Här presenterar vi en tillförlitlig, minimalt invasiv och kostnadseffektiv metod för att registrera och tolka elektrokardiogram i levande sövda vuxna zebrafiskar.
Den elektrokardiogram vågformer av Adult zebrafiskar och de av människor är anmärkningsvärt likartade. Dessa elektrokardiogram likheter öka värdet av zebrafiskar inte bara som en forskningsmodell för mänsklig kardiell elektrofysiologi och myopatier utan också som en surrogat modell i hög genomströmning farmaceutisk screening för potentiella kardiotoxicities till människor, såsom QT-förlängning. Som sådan är in vivo elektrokardiografi för vuxna zebrafiskar ett elektriskt fenotypnings verktyg som är nödvändigt, om inte nödvändigt, för tvärsnitts eller longitudinell in vivo elektrofysiologiska karakteriseringar. Bristen på tillförlitlig, praktisk och kostnadseffektiv inspelnings metod är dock alltför ofta en stor utmaning som hindrar detta in vivo-diagnostikverktyg från att bli mer lättillgängligt. Här beskriver vi en praktisk, enkel metod för in vivo elektrokardiografi för vuxna zebrafiskar med ett lågt underhåll, kostnadseffektivt och heltäckande system som ger konsekventa, pålitliga inspelningar. Vi illustrerar vårt protokoll med friska vuxna manliga zebrafiskar på 12-18 månaders ålder. Vi introducerar också en snabb realtids tolkning strategi för kvalitets validering för att säkerställa data noggrannhet och robusthet tidigt i elektrokardiogram inspelningsprocessen.
Den zebrafiskar (Danio rerio) hjärtat ligger anteroventrally till brösthålan mellan operculum och bröst girdles. Hjärtat är bifogat ganska löst inom en silverfärgad perikardiell SAC. Anatomiskt, den zebrafiskar hjärta skiljer sig från de fyra-chambered mänskliga och andra däggdjur hjärtan på grund av dess diminutiv skala (100-faldigt mindre än det mänskliga hjärtat) och dess två-chambered struktur bestående av endast en Atrium och en ventrikel. Icke desto mindre är elektrokardiogram (EKG) vågformer och varaktigheten av QT-intervallet för båda arterna anmärkningsvärt likartade (figur 1). Följaktligen har zebrafiskar vuxit fram som en populär modell för att studera mänskliga ärftliga arytmier1,2,3 och för hög genomflöde av läkemedels screening av potentiella humana kardiotoxiciteter4,5 , såsom QT-förlängning.
I den rutinmässiga utvärderingen av mänskliga hjärtsjukdomar, kroppen-ytan EKG har blivit den mest omfattande första linjens icke-invasiva diagnostiska verktyg sedan dess uppfinning av Einthoven i 1903. I motsats, sedan den första anpassningen av kroppsytan EKG inspelnings metod för vuxna zebrafiskar i 20066 och flera ändringar därefter7, denna teknik har varit i stort sett otillgängliga för många forskare inom området trots populariteten av denna djurmodell. För andra forskare som utförde in vivo EKG förhör för vuxna Zebrafish, stora variationer bland operatörerna ledde till inkonsekvens i EKG-fynd från olika studier. Vanliga orsaker är besvärliga och dyra specialiserade enheter och programvara, låg signal-brus-förhållande, och förvirring om elektrod placeringen, alla ytterligare förvärras av en ofullständig förståelse av den vuxna zebrafiskar EKG-funktioner och underliggande vävnadsmekanismerna. Med tanke på att in vivo EKG är det enda diagnostiska verktyg för elektriskt fenotyp levande zebrafisk, det finns ett tydligt behov av en standardiserad metod för att förbättra känslighet och specificitet, reproducerbarhet och tillgänglighet.
Här presenterar vi en praktisk, tillförlitlig och validerad metod för att registrera och tolka zebrafiskar in vivo elektrokardiogram (figur 2). Med hjälp av en enda bipolär bly i frontal planet, undersökte vi förändringar i EKG-vågformer och intervall varaktigheter av levande sövda friska vild-typ AB Adult Zebrafish.
Vid inspelning in vivo-EKG för vuxna zebrafiskar med hjälp av en enda ledning som vi visade i denna studie, det finns ett antal varningar om kvaliteten och giltigheten av EKG-Inspelningsresultat. Först, i valet av lämpliga anestetika och bestämma den minimala behov anestesi koncentration, djup, och varaktighet, balansera bedövningsmedel kardiotoxiciteter mot det kritiska behovet av att undertrycka rörelse artefakter och a priori beslutsamhet för en överlevnad kontra Terminal experimentell design. Kapitalisera på den synergistiska potensen av en kombination av flera anestetika från olika läkemedelsklasser5,14 och paralytika1,6 för att sänka dosen av enskilda agenter5 eller administrera en låg underhållsdos efter en högre induktionsdos är typiska strategier. Men trots dess välkända potentiella kardiorespiratoriska toxicitet, inklusive död8, tricaine är fortfarande den mest använda, den bästa tillgängliga, och den enda bedövningsmedel som godkänts av US Food and Drug Administration (FDA) för zebrafisk Anestesi. Tricaine har populärt används i EKG-inspelning av vuxna zebrafiskar antingen som en enda agent eller i kombination med andra anestetika eller paralytika.
För det andra, bly placering noggrannhet kan säkerställas åtminstone för friska normal zebrafiskar med våra fyra validerar kriterier för en normal vuxen zebrafiskar EKG. Av de fyra validerar kriterier som vi föreslår här, de två sista kriterierna tillsammans bekräfta den grundläggande överensstämmelse mellan polariteten av R-vågen och att T-vågen i ett normalt EKG5,7,15. Denna R och T våg konkordans är en slumpartad, men ändå kritisk, likhet mellan zebrafisk och humant16,17 normalt EKG som bidrar till den kliniska relevansen av zebrafiskar hjärt modell som ett surrogat för mänskliga hjärt Elektrofysiologi. Flera godartade eller maligna tillstånd kan dock ogiltigförklara något av de fyra valideringskriterierna. Till exempel, R och T våg konkordans är förlorad i myokardischemi7,15. Denna förlust av R och T våg konkordans i myokardischemi är en annan slående likhet mellan zebrafiskar och humant EKG som bidrar till den kliniska relevansen av zebrafiskar hjärtinfarkt modell.
Slutligen rekommenderar vi en standard praxis i EKG-analys. Med tillkomsten av teknik, kan EKG-analysprogram generera automatisk EKG-tolkning. Vi rekommenderar dock starkt att utbildade människor alltid omtolkar och verifierar alla EKG baserat på respektive kliniskt scenario som leder till EKG-inspelning. Rutinmässig övertillit enbart på automatisk tolkning av ett EKG analysprogram är olämpligt, särskilt i närvaro av vanliga normala EKG-varianter, hjärtsjukdomar, eller suboptimala bly placering.
Denna studie fokuserar på den minimalt invasiva metoden för korta EKG-inspelningssessioner. Men om behovet uppstår för Terminal långvarig EKG-inspelning sessioner varar timmar, ändringar är nödvändiga för att ge adekvat syresättning, hydrering, och anestesi genom kontinuerlig perfusion6.
Dessutom, förbättra signal-brus-förhållandet med en av minst tre sätt. Välja en mer kraftfull förstärkare är ofta en kostsam, om inte opraktiskt, alternativ. Öppna perikardiell SAC att minska volymen ledaren är en rimlig, även invasiva, tillvägagångssätt som har antagits7. Strategisk bly placering för att rikta in bly axeln i en riktning parallellt med den huvudsakliga hjärt axeln (figur 4b) maximerar EKG-spänningssignalerna, men kan kräva försök och fel, särskilt i avsaknad av perikardiotomi.
Den in vivo EKG förhörs metoden för Adult zebrafiskar som vi presenterade här erbjuder fyra huvudsakliga fördelar. För det första, vår minimalt invasiva tillvägagångssätt kräver endast elektrod insättning, men ingen fisk skala avlägsnande eller torakotomi-pericardiotomy. Därför, genom att minimera smärta för fisken, vår metod möjliggör upprepade EKG förhör i longitudinella överlevnads studier. För det andra, när bedövningsmedel tillräckligt undertrycka fisk rörelse, in vivo EKG-inspelningssystem i vår studie ger konsekvent en tillfredsställande signal-brus-förhållande med brus fria RAW-signaler. För det tredje garanterar den kvalitets validering med fyra kriterier som vi föreslår här data noggrannhet och robusthet tidigt i EKG-datainhämtningen och minimerar operatörsberoende variationer. Slutligen, i synnerhet, vårt sista validerar kriterium (den normala T-vågen är upprätt) kapslar in konkordans av R-vågen och T-vågen, en viktig människa-liknande egenskap hos zebrafiskar normalt EKG (figur 1).
Emellertid, det finns fortfarande fyra stora begränsningar till aktuell in vivo EKG-metod för vuxna zebrafiskar av vår grupp och andra.
För det första kräver bristen på ämnes samarbete behovet av anestesi med dess begränsande kardiorespiratoriska toxicitet konsekvenser. För in vivo EKG-förhör, medan mänskliga patienter aldrig behöver sedering, zebrafiskar kräver alltid bedövningsmedel eller paralytika, som alla orsakar variabla kardiorespiratoriska toxiciteter.
För det andra, behovet av att säkra bifogade EKG leder något höjer invasivitet av en annars icke-invasiva förfarande. Bly placering i kroppsyta EKG-inspelning av människor är helt icke-invasiv eftersom elektroder följa den mänskliga epidermis, bly placering för in vivo-EKG-inspelning av zebrafiskar är mer invasiv eftersom stål elektroder åtminstone måste punktera fisken huden för säker insättning i fisken muskulatur.
De två sista begränsningarna härrör från den anatomiska begränsningar av zebrafiskar bröstet och hjärtat. För det tredje, den minimala storleken på den vuxna zebrafiskar hjärtat kräver en drastisk minskning av antalet EKG leder. Medan människor lätt rymma tolv leder i en vanlig EKG-inspelning, Adult zebrafiskar kan normalt rymma endast en enda unipolär eller bipolär bly. Förgreningen av ett enda EKG-bly är utmaningen att optimera samtidigt amplituderna av alla tre P, R, och T vågor. Därför, vikten av optimal och noggrann bly placering i zebrafiskar EKG förhör kan inte överskattas. I Zebrafish presenterar T-vågen en unik detektions utmaning eftersom den ofta är den minsta av dessa tre vågor. Därför bör zebrafiskar T vågamplitud få optimerings prioritet över de typiskt större P-och R-vågor.
För det fjärde, bestämning av zebrafiskar huvudsakliga hjärt axeln för att maximera R-vågamplituden kan vara utmanande. Anledningen är att zebrafiskar Heart har mer rörelsefrihet inom sin lösa perikardiell SAC jämfört med det mänskliga hjärtat inom dess form-passande handske-liknande hjärtsäcken.
Sammantaget kommer dessa begränsningar att stimulera framtida metod innovation. Med tillkomsten av 3D-utskrifter och deformerbar elektronik18, det finns hopp om direkt bly implantation en dag i vaken, Alert, simning zebrafiskar med hjälp av en “hjärt strumpa” av trådlösa elektrod sensorer.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health R01 HL141452 to TPN. ADInstruments vänligt gav generös finansiering för att täcka kostnaderna för Open Access-publicering men hade ingen roll i antingen experimentell design, datainsamling, dataanalys av denna studie eller någon tillgång till manuskriptet före offentliggörandet.
Culture dishes | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
Dumont Forceps | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
FE136 Animal Bio Amp | AD Instruments | FE231 | |
Iris Forceps | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
LabChart 8 Pro | AD Instruments | Software with ECG Module | |
Needle electrodes for Animal Bio Amp | AD Instruments | MLA1213 | 29 gauge |
Plastic Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 in., 1.2 mL |
PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
Scissors | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | MS-222 |