Ici, nous présentons une méthode fiable, mini-invasive et rentable pour enregistrer et interpréter les électrocardiogrammes chez les poissons zèbres adultes anesthésiés vivants.
Les formes d’onde d’électrocardiogramme du poisson zèbre adulte et ceux des humains sont remarquablement semblables. Ces similitudes d’électrocardiogramme augmentent la valeur du poisson zèbre non seulement comme modèle de recherche pour l’électrophysiologie cardiaque humaine et les myopathies mais également comme modèle de substitution dans le criblage pharmaceutique à haut débit pour les cardiotoxicités potentielles à humains, tels que la prolongation de QT. En tant que tel, l’électrocardiographie in vivo pour le poisson zèbre adulte est un outil de phénotypage électrique qui est nécessaire, sinon indispensable, pour les caractérisations électrophysiologiques intertransversales ou longitudinales in vivo. Cependant, trop souvent, l’absence d’une méthode d’enregistrement fiable, pratique et rentable demeure un défi majeur empêchant cet outil de diagnostic in vivo de devenir plus facilement accessible. Ici, nous décrivons une approche pratique et directe de l’électrocardiographie in vivo pour les poissons zèbres adultes à l’aide d’un système à faible entretien, rentable et complet qui donne des enregistrements cohérents et fiables. Nous illustrons notre protocole utilisant le poisson zèbre mâle adulte en bonne santé de 12-18 mois. Nous introduisons également une stratégie d’interprétation rapide en temps réel pour la validation de la qualité afin d’assurer l’exactitude et la robustesse des données dès le début du processus d’enregistrement des électrocardiogrammes.
Le cœur de poisson zèbre (Danio rerio) est situé antéroventrally à la cavité thoracique entre l’operculum et les ceintures pectorales. Le cœur est enfermé assez lâchement dans un sac péricardique de couleur argentée. Anatomiquement, le cœur de poisson zèbre est différent des cœurs humains et autres mammifères à quatre chambres en raison de son échelle diminutive (100 fois plus petite que le cœur humain) et de sa structure à deux chambres composée d’un seul atrium et d’un ventricule. Néanmoins, les formes d’onde de l’électrocardiogramme (ECG) et la durée de l’intervalle QT des deux espèces sont remarquablement similaires (figure 1). En conséquence, le poisson zèbre a émergé comme un modèle populaire pour étudier les arythmies héréditaires humaines1,2,3 et pour le dépistage des médicaments à haut débit des cardiotoxicités humaines potentielles4,5 , comme la prolongation qT.
Dans l’évaluation systématique des maladies cardiaques humaines, l’ECG de surface du corps est devenu l’outil de diagnostic non invasif de première ligne le plus largement utilisé depuis son invention par Einthoven en 1903. En revanche, depuis la première adaptation de la méthode d’enregistrement ECG de surface du corps pour le poisson zèbre adulte en 20066 et plusieurs modifications par la suite7, cette technique est restée largement inaccessible à de nombreux chercheurs dans le domaine malgré la popularité de ce modèle animal. Pour d’autres chercheurs qui ont effectué l’interrogatoire in vivo d’ECG pour le poisson zèbre adulte, de grandes variations parmi des opérateurs ont mené à l’incohérence dans des résultats d’ECG de différentes études. Les raisons les plus courantes comprennent les dispositifs et logiciels spécialisés encombrants et coûteux, le faible rapport signal-bruit et la confusion concernant le placement des électrodes, toutes aggravées par une compréhension incomplète des caractéristiques adultes de l’ECG du poisson zèbre et mécanismes tissulaires sous-jacents. Étant donné que l’ECG in vivo est le seul outil de diagnostic pour phénotypeélectriqueélectriquer le poisson zèbre vivant, il est clair qu’il faut une méthode normalisée pour améliorer la sensibilité et la spécificité, la reproductibilité et l’accessibilité.
Ici, nous présentons une approche pratique, fiable et validée pour enregistrer et interpréter les zèbres dans les électrocardiogrammes in vivo (Figure 2). À l’aide d’un seul plomb bipolaire dans le plan frontal, nous avons étudié les changements dans les formes d’ondes ECG et les durées d’intervalle du poisson zèbre adulte ab adulte vivant anesthésié en bonne santé.
Lors de l’enregistrement in vivo ECG pour le poisson zèbre adulte au moyen d’une seule piste comme nous l’avons démontré dans cette étude, il ya un certain nombre de mises en garde concernant la qualité et la validité des résultats de l’enregistrement ECG. Tout d’abord, en choisissant les anesthésiques appropriés et en déterminant la concentration, la profondeur et la durée minimales requises en matière d’anesthésie, équilibrez les cardiotoxicités anesthésiques par rapport à la nécessité critique de supprimer les artefacts de mouvement et la détermination a priori pour une conception expérimentale de survie vs terminale. Capitaliser sur la puissance synergique d’une combinaison d’anesthésiques multiples provenant de différentes classes de médicaments5,14 et paralytiques1,6 pour abaisser la dose d’agents individuels5 ou l’administration une faible dose d’entretien à la suite d’une dose d’induction plus élevée sont des stratégies typiques. Cependant, malgré ses toxicités cardiorespiratoires potentielles bien connues, y compris la mort8, la tricaine est toujours la plus largement utilisée, la meilleure disponible, et le seul anesthésique approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour le poisson zèbre Anesthésie. Tricaine a été populairement utilisé dans l’enregistrement ECG de poissons zèbres adultes soit comme un agent unique ou en combinaison avec d’autres anesthésiques ou paralytiques.
Deuxièmement, l’exactitude du placement du plomb peut être assurée au moins pour les poissons zèbres normaux en bonne santé en utilisant nos quatre critères de validation pour un eCG adulte normal de poisson zèbre. Sur les quatre critères de validation que nous proposons ici, les deux derniers critères confirment ensemble la concordance fondamentale entre la polarité de la vague R et celle de la vague T dans un ECG normal5,7,15. Cette concordance d’onde de R et De est une similitude fortuite, mais critique, entre le poisson zèbre et l’homme16,17 ECG normal qui contribue à la pertinence clinique du modèle de coeur de poisson-zèbre en tant que substitut pour le cardiaque humain Électrophysiologie. Cependant, plusieurs conditions bénignes ou malignes peuvent invalider l’un des quatre critères de validation. Par exemple, la concordance des ondes R et T est perdue dans l’ischémie myocardique7,15. Cette perte de concordance d’onde de R et de T dans l’ischémie myocardique est une autre ressemblance frappante entre le poisson zèbre et l’ECG humain qui contribue à la pertinence clinique du modèle d’infarctus du myocarde de poisson-zèbre.
Enfin, nous recommandons une pratique standard dans l’analyse ECG. Avec l’avènement de la technologie, le logiciel d’analyse ECG peut générer une interprétation eCG automatique. Cependant, nous recommandons fortement que les humains formés devraient toujours réinterpréter et vérifier tous les ECG basés sur le scénario clinique respectif menant à l’enregistrement d’ECG. Il est déconseillé de trop dépendre de façon courante uniquement de l’interprétation automatique par un logiciel d’analyse ECG, en particulier en présence de variantes normales courantes d’ECG, de pathologies cardiaques ou de placement de plomb sous-optimal.
Cette étude se concentre sur la méthode mini-invasive pour de brèves sessions d’enregistrement ECG. Cependant, si le besoin se fait sentir pour des sessions d’enregistrement ECG prolongées terminales durant desheures, des modifications sont nécessaires pour fournir l’oxygénation, l’hydratation, et l’anesthésie proportionnels par perfusion continue 6.
En outre, améliorez le rapport signal-bruit d’au moins trois façons. Le choix d’un amplificateur plus puissant est souvent une option coûteuse, voire peu pratique. Ouvrir le sac péricardique pour réduire le conducteur de volume est une approche raisonnable, bien qu’invasive, qui a été adoptée7. Le placement stratégique du plomb pour aligner l’axe de plomb dans une direction parallèle à l’axe cardiaque principal (figure 4B) maximisera les signaux de tension ECG, mais peut nécessiter des essais et des erreurs, surtout en l’absence de péricardiotomie.
La méthode d’interrogatoire In vivo ECG pour le poisson zèbre adulte que nous avons présenté ici offre quatre principaux avantages. Tout d’abord, notre approche mini-invasive ne nécessite que l’insertion d’électrodes, mais pas d’élimination de l’échelle de poisson ou de la thoracotomie-péricardiotomie. Par conséquent, en minimisant la douleur pour les poissons, notre approche permet des interrogatoires répétés ECG dans des études de survie longitudinale. Deuxièmement, lorsque les anesthésiques suppriment adéquatement le mouvement des poissons, le système d’enregistrement In vivo ECG dans notre étude donne constamment un rapport signal-bruit satisfaisant avec des signaux bruts sans bruit. Troisièmement, la validation de la qualité en quatre critères que nous proposons ici assure l’exactitude et la robustesse des données dès le début de l’acquisition de données ECG et minimise les variations dépendantes des opérateurs. Enfin, en particulier, notre dernier critère de validation (l’onde T normale est verticale) résume la concordance de la vague R et de la vague T, une caractéristique humaine importante de l’ECG normal de poisson zèbre (Figure 1).
Cependant, il existe encore quatre limitations majeures à la méthodologie actuelle in vivo ECG pour les poissons zèbres adultes par notre groupe et d’autres.
Tout d’abord, le manque de coopération du sujet nécessite la nécessité d’une anesthésie avec ses conséquences limitantes de toxicité cardiorespiratoire. Pour l’interrogatoire in vivo d’ECG, alors que les patients humains n’ont jamais besoin de sédation, le poisson zèbre a toujours besoin d’anesthésiques ou de paralytiques, qui causent tous des toxicités cardiorespiratoires variables.
Deuxièmement, la nécessité de fixer les pistes ECG attachées augmente légèrement l’invasivité d’une procédure autrement non invasive. Alors que le placement de plomb dans l’enregistrement Delg de la surface du corps de l’homme est entièrement non-invasif parce que les électrodes adhèrent à l’épiderme humain, le placement de plomb pour l’enregistrement in vivo d’ECG du poisson zèbre est plus invasif parce que, au minimum, les électrodes en acier doivent perforer la peau du poisson pour une insertion sûre dans la musculature du poisson.
Les deux dernières limitations découlent des contraintes anatomiques de la poitrine et du cœur du poisson zèbre. Troisièmement, la taille minuscule du cœur adulte de poisson zèbre nécessite une réduction drastique du nombre de fils d’ECG. Alors que les humains accueillent facilement douze pistes dans un enregistrement ECG standard, le poisson zèbre adulte ne peut généralement accueillir qu’un seul plomb unipolaire ou bipolaire. La ramification d’un seul plomb ECG est le défi d’optimiser simultanément les amplitudes des trois ondes P, R et T. Par conséquent, on ne saurait trop insister sur l’importance d’un placement optimal et précis du plomb dans les interrogatoires eCG du poisson zèbre. Chez le poisson zèbre, la vague T présente un défi de détection unique parce qu’elle est souvent la plus petite de ces trois vagues. Par conséquent, l’amplitude des ondes T du poisson zèbre devrait recevoir une priorité d’optimisation sur les ondes P et R généralement plus grandes.
Quatrièmement, il peut être difficile de déterminer l’axe cardiaque principal du poisson zèbre pour maximiser l’amplitude des ondes R. La raison en est que le cœur de poisson zèbre a plus de liberté de mouvement dans son sac péricardique lâche par rapport au cœur humain dans son péricarde de gant-ajustage de forme.
Dans l’ensemble, ces limites stimuleront l’innovation future en matière de méthode. Avec l’avènement de l’impression 3D et de l’électronique déformable18, il ya de l’espoir pour l’implantation directe de plomb un jour dans éveillé, alerte, la natation des poissons zèbres à l’aide d’une «chaussette cardiaque» de capteurs d’électrodes sans fil.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health R01 HL141452 à TPN. ADInstruments a gentiment fourni un financement généreux pour couvrir le coût de la publication en libre accès, mais n’a joué aucun rôle dans la conception expérimentale, l’acquisition de données, l’analyse des données de cette étude ou tout accès au manuscrit avant la publication.
Culture dishes | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
Dumont Forceps | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
FE136 Animal Bio Amp | AD Instruments | FE231 | |
Iris Forceps | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
LabChart 8 Pro | AD Instruments | Software with ECG Module | |
Needle electrodes for Animal Bio Amp | AD Instruments | MLA1213 | 29 gauge |
Plastic Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 in., 1.2 mL |
PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
Scissors | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | MS-222 |