Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En semi-High-genomströmning anpassning av NADH-kopplad ATPas-analys för screening av småmolekylära hämmare

Published: August 17, 2019 doi: 10.3791/60017
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 2, 1,2
1Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, 2Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, 3Laboratory of Molecular Physiology, NHLBI, National Institutes of Health

Summary

En nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH)-kopplad ATPas-analys har anpassats till semihigh genomströmning screening av små molekyler myosin-hämmare. Denna kinetiska analys körs i ett 384-väl mikroplattformat med totala reaktions volymer på endast 20 μL per brunn. Plattformen bör vara tillämplig på praktiskt taget alla ADP-producerande enzym.

Abstract

ATPas enzymer utnyttja den fria energi som lagras i adenosintrifosfat att katalysera en mängd olika endergonic biokemiska processer in vivo som inte skulle inträffa spontant. Dessa proteiner är avgörande för i huvudsak alla aspekter av cellulära liv, inklusive metabolism, celldelning, svar på miljöförändringar och rörelse. Det protokoll som presenteras här beskriver en nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH)-kopplad ATPas-analys som har anpassats till semi-High genomströmning screening av små molekyler ATPas hämmare. Analysen har tillämpats på hjärt-och skelettmuskulaturen myosin II: s, två Actin-baserade molekylära motor ATPases, som ett bevis på princip. Hydrolys av ATP är kopplad till oxidation av NADH genom enzymatiska reaktioner i analysen. Först, ADP genereras av ATPas regenereras till ATP av pyruvatkinas (PK). PK katalyserar övergången av fosfoenolpyruvat (PEP) till Pyruvat parallellt. Därefter, pyruvat reduceras till laktat av laktatdehydrogenas (LDH), som katalyserar oxidation av NADH parallellt. Sålunda, minskningen i ATP koncentrationen är direkt korrelerad till minskningen i NADH koncentration, som följs av förändring till den inneboende fluorescensen av NADH. Så länge som PEP finns i Reaktionssystemet förblir ADP-koncentrationen mycket låg, vilket undviker hämning av enzymet ATPas av sin egen produkt. Dessutom förblir ATP koncentrationen nästan konstant, vilket ger linjära tidsförlopp. Fluorescensen övervakas kontinuerligt, vilket möjliggör enkel uppskattning av kvaliteten på data och hjälper till att filtrera bort potentiella artefakter (t. ex. till följd av sammansatt nederbörd eller termiska förändringar).

Introduction

Myosins är mechanochemical energigivare som hydrolysera adenosintrifosfat (ATP) att generera riktad rörelse längs glödtrådar av aktin cytoskelettet i Eukaryoter1,2. De har både strukturellt och Kinetically anpassas till deras olika intracellulära funktioner, såsom transport av organeller, muskelkontraktion eller generering av cytoskeletala spänningar1,2. Den myosin superfamiljen representeras av ~ 40 myosin gener som tillhör ~ 12 distinkta myosin klasser i den mänskliga arvsmassan3,4. Medlemmar av myosin klasserna spelar olika roller i en mycket varierande uppsättning av sjukdomar, såsom flera cancerformer, neurologiska sjukdomar, skelett myopatier, och hypertrofisk kardiomyopati5,6. Med tanke på det stora antalet fysiologiska och patologiska funktioner av dessa molekylära motorer, är det inte förvånande att de blir alltmer erkända som narkotika mål för en mängd olika villkor7. Betydande framsteg har gjorts nyligen i upptäckten av nya myosin-hämmare8,9,10 och aktivatorer11, och för att förbättra egenskaperna hos de befintliga12, 13 , fjorton , 15.

Den nikotinamid adenin--dinukleotid (NADH)-kopplad ATPas-analys har länge använts för att mäta ATPas aktivitet av olika enzymer, såsom sarkoplasmatiska nätmagen ca2 + pump ATPas16, DNA reparation ATPas Rad5417, AAA + ATPas p9718 eller mikrotubuli motor kinesinet19. Analysen sysselsätter en ATP förnyelsecykel. Adenosindifosfat (ADP) som genereras av ATPas regenereras till ATP av pyruvatkinas (PK), som omvandlar en molekyl av fosfoenolpyruvat (PEP) till Pyruvat parallellt. Därefter reduceras pyruvat till laktat genom laktatdehydrogenas (LDH). Det, i sin tur, oxiderar en molekyl av NADH till NAD. Minskningen av NADH-koncentrationen som en funktion av tiden är därför lika med ATP-Hydrolyshastigheten. ATP-regenereringscykeln håller ATP-koncentrationen nästan konstant och ADP-koncentrationen låg så länge som PEP är tillgänglig. Detta resulterar i linjära tidsförlopp, vilket gör det enkelt att fastställa de initiala reaktions frekvenserna och hjälper till att undvika produkt hämning av ADP19. Även om den NADH-kopplade ATPas-analysen redan har anpassats till en 96-brunn format20, den höga reaktions volymer (~ 150 μl) gör det relativt dyrt på grund av den höga efterfrågan av reagenser, göra det mindre mottaglig för snabb screening av ett stort antal Föreningar. Alternativa metoder, såsom den malakit gröna analysen19,21, som förlitar sig på upptäckten av fosfat som produceras av enzymet ATPas, var bevisat mer lämpade för miniatyrisering och hög genomflöde screening22 , 23 , 24. en Endpoint-analys är dock mer sannolikt att påverkas av flera artefakter (diskuteras nedan), som kan förbli oupptäckta i avsaknad av heltids kurser.

Här, den NADH-kopplade ATPas-analysen har optimerats för semi-High genomströmning screening av småmolekylära hämmare. Skelett-och hjärtmuskeln myosin II: s och myosin-hämmare blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 och para-nitroblebbistatin12 används för att demonstrera kraften i analysen, som förlitar sig på NADH fluorescens som en avläsning. Detta protokoll är mottagligt för screening projekt inriktade på alla ADP-producerande enzymer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av stamlösningar och reagenser

  1. Bered Ditiotreitol (dTT) stamlösning genom att lösa upp kristallint DTT i destillerat vatten till en slutlig koncentration av 1000 mm. Justera pH till 7,0 med 1 M NaOH-lösning. Och förvara vid-20 ° c.
  2. Förbered ATP stamlösning genom att lösa kristallint ATP i destillerat vatten till en slutlig koncentration av 100 mM. Justera pH till 7,0 med 1 M NaOH-lösning. Och förvara vid-20 ° c.
  3. Förbered 10X NADH buffert som innehåller 70 mM 3-(N-morpholino) propansulfonsyra (moppar), 10 mM MgCl2, 0,9 mm etylenglykol-bis (β-aminoetyleter)-N, N, n ′, n′-tetraättiksyra (EGTA), och 3 mm Nan3. Justera pH till 7,0 med 1 M NaOH-lösning. Förvaras vid 4 ° c.
  4. Bered 1x myosin-buffert som innehåller 10 mM moppar och 0,1 mM EGTA. Justera pH till 7,0 med 1 M NaOH-lösning. Förvaras vid 4 ° c. Tillsätt bovint serumalbumin (BSA) och DTT till en slutlig koncentration på 0,1% (w/v%) respektive 1 mM före användning.
  5. Förbered 1x aktin-buffert som innehåller 4 mm moppar, 0,1 mm EGTA, 2 mm mgcl2och 3 mm Nan3. Justera pH till 7,0 med 1 M NaOH-lösning. Förvaras vid 4 ° c. Tillsätt BSA och DTT till en slutlig koncentration av 0,1% (w/v%) respektive 1 mM före användning.
  6. Förbered NADH Stock lösning genom att lösa kristallint NADH i 10X NADH buffert till en slutlig koncentration av 5,5 mM. Och förvara vid-20 ° c.
  7. Förbered PEP stamlösning genom att lösa kristallina PEP i 10X NADH buffert till en slutlig koncentration av 50 mM. Och förvara vid-20 ° c.
  8. Förbered LDH-lagerlösningen genom att lösa upp frystorkat LDH-pulver i en blandning av glycerol och 10X NADH-buffert (50%: 50%) till en slutlig koncentration av 2000 U/mL. Centrifugera lösningen för att avlägsna eventuellt oupplöst protein som finns (7 197 x g, 20 ° c, 10 min). Överför supernatanten till ett rent centrifugerör noggrant. Och förvara vid-20 ° c.
  9. Förbered PK stamlösning genom att lösa upp frystorkat PK pulver i en blandning av glycerol och 10X NADH buffert (50%: 50%) till en slutlig koncentration av 10000 U/mL. Centrifugera lösningen för att avlägsna eventuellt oupplöst protein som finns (7 197 x g, 20 ° c, 10 min). Överför supernatanten till ett rent centrifugerör noggrant. Och förvara vid-20 ° c.
  10. Rekonstituera de frystorkade hjärt-och skelettmuskel myosin II-proverna genom att tillsätta 100 μL destillerat vatten för att erhålla 10 mg/mL stamlösningar motsvarande ~ 37,9 μM och ~ 40,8 μM myosin-koncentrationer (monomeriska). Mer information finns i tillverkarens anvisningar.
  11. Förbered F-Actin från kanin muskel aceton pulver som beskrivs av Pardee och Spudich25.

2. mätning av ATPas verksamhet och hämmande effekter av småmolekylära hämmare

  1. Förbered sammansatta plattan.
    1. Lös upp föreningar av intresse för dimetylsulfoxid av hög kvalitet (DMSO).
    2. Skapa femton steg Serial 1:2 utspädningar med början från 10 mM sammansatt koncentration i DMSO.
    3. Överför proverna till en 384-och polypropenplatta i tre exemplar (12,5 μL vardera) med en multikanalpipett. Använd två rader på den sammansatta plattan för en förening (i stället för tre kolumner) för att minimera antalet brunnar som potentiellt påverkas av kanteffekter. Använd de sista tre brunnarna i den andra raden för varje förening som negativ kontroll (DMSO endast). Använd inte den första och sista raden på plattan för sammansatta spädningar.
    4. Överför ren DMSO in i brunnarna i första raden (reserverad för NADH kalibrering).
    5. Använd den sista raden för positiv kontroll.
      Anmärkning: para-aminoblebbistatin vid 4 mm koncentration i DMSO användes här.
  2. Bered 4500 μl av 20 μm utspädd aktin-lösning för varje analysplattan (384-brunn svart-vägg polystyren Microplate) genom att späda aktin Stock lösning i aktin buffert. Blanda lösningen grundligt genom att Pipettera upp och ner 30x med en 5 ml pipett för att reducera viskositet och heterogenitet genom att bryta aktin filament. Centrifugera lösningen för att avlägsna eventuellt utfällt protein (7 197 x g, 20 ° c, 10 min). Överför försiktigt supernatanten till ett rent centrifugerör.
  3. Förbered Master Mix som innehåller LDH och PK enzymer ("enzym mix"). För varje analys platta, kombinera 171,4 μL LDH-lösning, 171,4 μL PK-lösning och 3189,3 μL eller 3252,9 μL myosin-buffert för analyser som involverar hjärt-eller skelettmuskel myosin II, i ett 15 mL koniskt centrifugerör. Lägg inte till någon myosin på denna punkt för att undvika aggregering och nederbörd.
  4. Förbered Master Mix som innehåller alla substrat ("substrat mix"). För varje platta, kombinera 162,1 μL av ATP, 162,1 μL av PEP och 324,1 μL av NADH lösning i ett 15 mL koniskt centrifug rör. Lägg inte aktin på denna punkt för att undvika aggregering och nederbörd.
  5. Skapa Seven-Step Serial 1:2 utspädningar av NADH för kalibrerings start från 250 μM.
    1. Blanda 12,3 μL av NADH stamlösning med 257,7 μL myosin buffert i ett 1,5 mL microcentrifugerör.
    2. Alikvot 135 μL myosin buffert i sju 1,5 mL microcentrifug rör.
    3. Överför 135 μL lösning från det första röret till den andra och blanda genom pipettering. Upprepa tills du når 7: e röret.
    4. Använd det sista röret som No-NADH Control (endast buffert).
  6. Använd en pipett med 8 kanaler och överför 20 μL av NADH kalibreringslösningarna till den första raden av analys plattan i tre exemplar.
  7. Tillsätt 68 μL hjärt-eller 4,2 μL skelettmuskel myosin II till enzym mixen. Vortex kort.
  8. Förutom den första raden, dispensera 8,4 μL av den beredda myosin-enzymblandningen i varje brunn av analys plattan med hjälp av en automatiserad dispenser.
  9. Överför 100 nL av lösningar från den sammansatta plattan till analys plattan som innehåller enzym blandningen med hjälp av ett automatiserat vätskehanteringssystem utrustat med en 100 nL PIN verktygs huvud.
  10. Skaka analys plattan i 1 min vid rumstemperatur vid 1200 rpm med en skakapparat med mikroplattor.
  11. Tillsätt 4 052 μl av den centrifugerade aktin-lösningen till substrat blandningen. Vortex kort.
  12. Fördela 11,6 μL av Actin-substrat blandningen i varje brunn av analys plattan (utom första raden) för att starta den enzymatiska reaktionen med hjälp av en automatiserad dispenser.
  13. Skaka analys plattan i 1 min vid rumstemperatur vid 1200 rpm med en skakapparat med mikroplattor.
  14. Centrifugera analys plattan vid 101 x g i 30 s.
  15. Se till att plattläsarens inre temperatur har stabiliserats vid 25 ° c. Fyll på plattan och skaka i ytterligare 30 s. Detta skakar steg är nödvändigt att göra formen på den flytande ytan liknande i varje brunn och ger tid för plattan att nå Mät temperaturen.
  16. Rekord NADH fluorescens för 30 min Skanna plattan i 45 s intervaller. Använd en 380 Nm, 10 nm bandbredd excitation filter och en 470 nm, 24 nm bandbredd avgas filter i samband med en 425 nm cut-off Dichroic spegel. Kör mätningen i hög koncentrations läge. Optimera antalet blixtar, detektor förstärkning, plåt dimensioner och Mät höjden innan du kör analyserna.
    Anmärkning: slutliga assay villkor är 300 nM hjärt/20 nM skelettmuskulaturen myosin II, 10 μM Actin, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220 μM NADH, 1 mM PEP, 1 mM ATP i en buffert som innehåller 10 mM moppar (pH = 7,0), 2 mM MgCl2 , 0,15 mM EGTA, 0,1 mg/mL BSA, 0,5% (v/v) DMSO och 1 mM DTT. Den totala volymen är 20 μL/brunn. Den högsta slutliga sammansatta koncentrationen är 50 μM. 20 μM para-aminoblebbistatin i 0,5% DMSO fungerar som den positiva kontrollen och 0,5% DMSO ensam är den negativa kontrollen. Alla mätningar utförs i tre exemplar.

3. analysera data

  1. Rita den observerade fluorescensintensiteten mot tiden för varje brunn.
  2. Utför enkel linjär regression för att bestämma lutningen och skärningspunkten mellan fluorescenssvaren för varje brunn. Lutningen är proportionell till ATP (NADH) förbrukningstakt, medan skärningspunkten är proportionell mot NADH koncentrationen i början av mätningen (t = 0 s).
  3. Konstruera en kalibreringskurva för NADH genom att plotta de fångar som erhållits för den första raden av plattan mot koncentrationen av NADH. Se till att avlyssningar beror linjärt på NADH koncentrationen.
    Anmärkning: de fångar uppskattar den verkliga fluorescensintensiteten vid t = 0 s med mycket mer självförtroende än genomsnittet av råfluorescensintensiteten läser vid t ≈ 0 s.
  4. Utför enkel linjär regression för att få lutningen och skärningspunkten hos NADH kalibrerings linje.
    Anmärkning: skärningspunkten beskriver bakgrunds signalen fluorescens (ingen NADH närvarande), medan lutningen motsvarar den extrapolerade/teoretiska fluorescensintensiteten hos en 1 M NADH lösning i just det experimentet.
  5. Dela upp lutningen på fluorescensresponsen som erhålls för resten av brunnarna med lutningen på NADH kalibrerings linje för att omvandla fluorescens-förändringar till ATP-förbrukningshastigheter.
  6. Rita upp ATP-förbrukningssatserna mot koncentrationen av hämmaren.
  7. För att bestämma hämmande konstanter, Använd lämplig statistisk programvara för att passa dos-responsdata till följande andragradsekvation som motsvarar en enkel en-till-en bindande jämviktsmodell:
    Equation 1
    där y är ATP-förbrukningshastigheten, ymin är ATP-förbrukningshastigheten int frånvaron av hämmare ,y max är den teoretiska ATP-konsumtionen på 100% hämning, Ki är hämmande konstant , [E]t och [i]t är den totala koncentrationen av enzymet (myosin) respektive inhibitor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den typiska plattlayoutkartan som används för screening experiment visas i figur 1. Den första och sista raden är reserverade för NADH kalibrering och positiv kontroll (20 μM para-aminoblebbistatin, 0,5% DMSO), respektive. De återstående raderna (B till O) används för att testa den hämmande aktiviteten av föreningar. Här, femton-steg Serial 1:2 utspädningar från 10 mM sammansatta koncentration i DMSO bereds och överförs från den sammansatta plattan till analys plattan, så att den högsta slutliga sammansatta koncentrationen är 50 μM (i 0,5% DMSO) på analys plattan. Två rader används för att erhålla en dos-responskurva för en förening (48 datapunkter/förening). Observera att plattlayoutkartorna kan utformas på nytt för att stödja de specifika målen för ett givet projekt. Till exempel, om målet var att få Single-Point screeningdata för ett stort antal föreningar, kunde man testa 112 föreningar på en enda 384-brunn plattan med samma layout för positiv kontroll och NADH kalibrering (beräkning med tre exemplar för varje förening). Det är alltid klokt att ha minst 3 datapunkter för en förening (eller för varje koncentration) och för att undvika att använda endast brunnar längs kanterna av plattan för en förening, eftersom dessa datapunkter kan påverkas av kanteffekter. För att uppskatta vikten av kanteffekter, alltid köra en full tallrik med negativ kontroll först.

Fluorescensintensiteterna har ett linjärt beroende av koncentrationen av NADH som visas i figur 2A. Lutningen på den linjära passformen används vid dataanalys för att omvandla fluorescensförändringar till reaktionshastigheter. Observera att den råa fluorescensintensitetsspårningen som erhålls för varje brunn i NADH-kalibreringen analyseras med linjär regression först (en liknande analys visas i figur 2b, C för sammansatta data). Dessa spår förväntas Visa exponentiell förfall över tid på grund av photoblekning av fluorophore. Men, photoblekning är mycket långsam och därför kan rådata analyseras med linjära passformar. Lutningen och skärningspunkten mellan dessa passar motsvarar den initiala frekvensen av photoblekning och fluorescensintensiteten vid t = 0 s, respektive. De fångar av dessa linjära passformar används i stället för genomsnittet av råfluorescensen läser på t = 0 s för att konstruera NADH kalibreringskurvan eftersom fångar uppskattas baserat på mer data och därmed tillhörande fel är mycket mindre.

Figur 2b,C visar att oavsett myosin används eller närvaron av hämmaren, tidsförlopp är linjära i tidsfönstret av mätningarna. Den högsta (50 μM) och lägsta (0 μM) hämmare koncentrationer här motsvarar ~ 100% och 0% hämning, respektive. Observera att på grund av mängden rådata, den faktiska analysen verkar kaotisk om visas på en enda panel. Därför har dessa paneler förenklats för att bättre visualisera processen. Genomsnittet av den rå fluorescensintensiteten läsningar beräknades för alla parallella experiment (triplicates för varje koncentration) och konverteras till NADH koncentrationer här. Endast 3 inhibitor koncentrationer visas. I den verkliga analysen analyseras varje rå fluorescensintensitetsspår (48/sammansatt test) genom linjär regression först, och därefter konverteras backarna till ATP-förbrukningshastigheter.

Det är alltid tillrådligt att visa att reaktions frekvensen ändras linjärt med enzym koncentrationen, som visas i figur 2D och figur2e för skelett-och hjärtmuskeln myosin II ' s, respektive. Baserat på de linjära passformar, den slutliga assay koncentrationen av enzymet kan lätt uppskattas. Till exempel, en reaktionshastighet på ~ 5 x 10-8 MS-1 rekommenderas för 30-min tid kurser. Om en aktivator används i reaktionsblandningar (såsom aktin här), det rekommenderas att köra experimenten både i närvaro och frånvaro av aktivator för att säkerställa att den förväntade effekten (aktivering) är närvarande. Villkoren och förfarandet måste följa det slutliga protokollet så nära som möjligt. Här, en spädningsserie av myosin bereddes i myosin buffert i åtta microcentrifug rör först. Därefter lades en blandning av LDH och PK enzymer. Slutligen, reaktionerna startades genom att lägga substrat blanda till varje rör parallellt, med hjälp av en Multichannel pipett. Reaktions blandningarna överfördes omedelbart till en rad av analys plattan i tre exemplar. Om aktin saknades användes aktin buffer istället. Inga andra parametrar har ändrats (se anmärkning i steg 2,16 i protokollet för slutliga assay villkor).

Figur 2F visar ATP-förbrukningsfrekvenser som erhållits för flera negativa och positiva kontrollreaktioner (halv platta vardera). Dessa data kan jämföras baserat på Z ' värde eller "screening Window koefficienten"26, som är en allmänt använd statistisk parameter för att uppskatta kvaliteten på höga dataflöden analyser. Den jämför de positiva och negativa kontrollerna genom att ta hänsyn till både medel och standardavvikelser:

Equation 2,

där σn, σp och μn, μp är standardavvikelser och medel för de negativa respektive positiva kontrollerna. De två populationerna är väl åtskilda om Z-värdet sjunker mellan 0,5 och 1. A Z ' = 0,78 erhålls här visar att analysen kan betraktas som utmärkt26.

För att påvisa att analysen kan användas för att bestämma inhibitoriska konstanter, den lilla molekylen myosin inhibitor blebbistatin8 och två analoger, para-nitroblebbistatin12 och para-aminoblebbistatin13 har har valts här, som visas i figur 3a och figur 3b. Blebbistatin är en okonkurrensutsatt, alloster myosin hämmare27,28. En molekyl av blebbistatin binder till en motorisk domän av myosin och blockerar ATPas cykeln genom att stabilisera myosin-ADP-fosfat komplex27,28. Därför modellerades de hämmande effekterna av blebbistatin derivat med hjälp av en enkel, en-till-en bindande modell här (se steg 3,7 i protokollet). Observera att denna modell kanske inte var tillämplig om ATP-förbrukningssatserna inte hade visat linjärt beroende av myosin-koncentrationen (se figur 2D,E). Den kinetiska vattenlöslighet av blebbistatin, para-nitroblebbistatin och para-aminoblebbistatin har rapporterats vara 426 μm, 3,6 μm och 9,3 μm, respektive13. Inga avvikelser i signalen observerades vid eller under de rapporterade lösligheter i våra experiment; flera artefakter visades dock när antingen blebbistatin eller para-nitroblebbistatin användes över deras rapporterade löslighets värden, vilket visas i figur 4. Därför exkluderades den signal som registrerades vid koncentrationer som var högre än lösligheten från dataanalysen i dessa fall. Para-aminoblebbistatin är mycket löslig, och därför var lösligheten inte en begränsande faktor i det fallet.

Slutligen, det rekommenderas alltid att testa om de hämmande effekterna av några positiva träffar är specifika för den Target ATPas enzymet. Den kopplade Reaktionssystemet sysselsätter två andra enzymer, LDH och PK, och hämning av en av dessa skulle resultera i en falsk positiv signal. Att köra ATPas-analysen med ett orelaterat ATPas-enzym kan bidra till att filtrera ut dessa falskt positiva träffar (för ytterligare rekommendationer, se diskussion). Para-aminoblebbistatin och apyrase, ett ATP-hydrolyserande enzym som producerar ADP och oorganiskt fosfat29, användes här som ett exempel för att demonstrera ett sådant kontroll experiment, som visas i figur 5.

Figure 1
Figur 1 : Analysplattans layout. Seven-Step Serial 1:2 spädningar av NADH start från 250 μM koncentration bereds och därefter dispenseras i rad A i tre exemplar för kalibrering (svart till grön färg gradient). De sist tre brunnarna av ror A innehåller myosin buffert endast (ingen NADH kontrollerar, vit). Den sista raden (P) används för den positiva kontrollen (20 μM para-aminoblebbistatin; röd). Ett typiskt dos-responsexperiment kräver två rader (t ex B och C). Därför kan 7 dos-respons experiment köras parallellt på en enda 384-brunn plattan (representeras av blå till vit färg gradienter). Varje prov läses in som triplicates. Här börjar de högsta slutliga sammansatta koncentrationerna vid 50 μM (i 0,5% DMSO). De sista tre brunnarna i varannan rad är reserverade för den negativa kontrollen (ingen förening, 0,5% DMSO endast; cyan). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Representativa ATPase-data. Aen tvåfaldig utspädningsserie av NADH bereddes och överfördes till den första raden på varje Mätplatta. Fluorescensintensiteten registrerades i 30 minuter och rådata analyserades genom enkel linjär regression. Skärningspunkten för varje regressionslinje plottas mot koncentrationen av NADH. Observera att i ett idealfall kan fluorescensintensiteten vid t = 0 s helt enkelt användas för att erhålla kalibrerings linjen. Medan rå fluorescensdata är mycket bullriga ger avlyssningen en noggrann uppskattning av fluorescensintensiteten vid t = 0 s och deras tillhörande standardfel (visas som felstaplar) är mycket liten. (B,C) Representativa fluorescensintensitet spår av skelett (B) och hjärt (C) muskel myosin II ATPas reaktioner noterades i närvaro av olika nivåer (se insets) av para-aminoblebbistatin. För enkelhetens skull representerar datapunkter och felstaplar medelvärdet av tre oberoende mätningar respektive den associerade standardavvikelsen. Enkel linjär regression utfördes (heldragna linjer) för att få reaktionshastigheter. Observera att ett typiskt dos-responsexperiment består av 15 olika inhibitionskoncentrationer och negativ kontroll i tre exemplar på Mät plattan (se figur 1) och den linjära regressionen utförs individuellt för varje fluorescens intensitet spår. För enkelhetens skull visas endast 3 olika koncentrationer här. (D,E) Basala (röda) och Actin-aktiverade (blå) ATPas-frekvenser fastställdes för olika skelett (D) och hjärt (E) muskel myosin II-koncentrationer. ATPas-frekvenserna visar linjärt beroende av myosinkoncentrationen. (F) positiva (röda) och negativa (blå) kontroller (halv platta vardera) kördes parallellt på en 384-brunn-analysplatta och z-faktorn (z) beräknades för att bedöma kvaliteten på ATPas-analysen. Ett Z-värde på 0,78 indikerar en tillförlitlig analys med mycket väl separerade positiva och negativa kontroller. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Dos-responskurvor och analys av inhibitoriska konstanter. Hjärt (a) och skelett (B) muskel myosin II: s användes för att testa den hämmande aktiviteten av blebbistatin, para-aminoblebbistatin och para-nitroblebbistatin. ATPas-frekvenser (blå) erhölls genom att tillämpa enkel linjär regression på rå fluorescens-data. Felstaplar representerar standardfelet för montering och användes som viktningsfaktorer vid montering av en kvadratisk ekvation (se steg 3,7 i protokollet) som representerar en enkel jämvikts bindnings modell (röd). Data som erhållits ovan löslighet påverkades av artefakter och exkluderades från analys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Löslighets relaterade artefakter. A) spår av fluorescensintensitet för blebbistatin som erhålls i en ATPas-analys med hjälp av skelettmuskulaturen MYOSIN II visar linjärt minskande signal beroende på hur mycket hämmare som finns (blå). Men när blebbistatin användes ovan löslighet (50 μM initial blebbistatin koncentration), observerades en ökning av signalen (röd), troligen på grund av bildandet av ljust fluorescerande blebbistatin kristaller13. Bnär det gäller para-nitroblebbistatin, som är en icke-fluorescerande analog av blebbistatin12, syntes spåren av råfluorescensintensiteten som normala (minskande). Den högsta hämningsnivån var dock mycket lägre än väntat (baserat på den positiva kontrollen). Därför ingick endast de reaktions frekvenser som erhålls under löslighet (blått) i dataanalysen. Reaktions frekvenser som erhålls ovanför lösligheten (röd) avviker från den fastställda dos-responskurvan (grön), eftersom nederbörden begränsar mängden (koncentrationen) av den hämmare som återstår i lösningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Hämmande effekter av para- aminoblebbistatin i skelettmuskulaturen myosin II och apyrase ATPase assays. Para-aminoblebbistatin hämmade skelettmuskulaturen MYOSIN II med en Ki på 1,7 μm, medan ingen hämning upptäcktes när Apyrase29 användes som ATPas i samma kopplade reaktionssystem. Detta experiment visar tydligt att para-aminoblebbistatin är specifik för myosin och inte hämmar PK eller LDH, således den upptäckta hämmande effekten är inte en artefakt. Apyrase användes vid 0,5 nM koncentration. Ingen myosin eller aktin var närvarande, och reaktionen utfördes i en buffert som innehöll 100 mm moppar (pH = 7,0), 3 mm CaCl2, 2 mm mgcl2, 3 mm Nan3, 1 mm DTT, och 0,1% BSA. Inga andra ändringar gjordes i protokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiska steg i protokollet

Optimera plattan layout genom att köra flera plattor med negativ kontroll endast (ATPas reaktion utan inhibitor). Inspektera resultaten noggrant för mönster i reaktionshastigheter. Dessa kan till exempel bero på kanteffekter och/eller brister i den hydrofila ytbeläggningen på "icke-bindande" plåtar. Om ett mönster observeras, ändra platttyp och/eller plattlayout för att minimera artefakterna. Till exempel, en typisk dos-responskurva (16 koncentrationer med tre exemplar, 48 poäng totalt) kan antingen arrangeras i 3 kolumner eller två rader på en 384-brunn tallrik. Dessa arrangemang ger 6 och 4 datapunkter, respektive, som sannolikt påverkas av kanteffekter. Därför är rad arrangemanget alltid att föredra.

Ändringar och felsökning

Observera att de observerade fluorescenssvaren måste vara linjära under hela reaktionstiden. Icke-lineariteter kan förekomma under de första minuterna på grund av termiska förändringar eller under de senaste minuterna på grund av att uppnå jämvikt. Om icke-lineariteter förekommer kan man antingen justera reaktions parametrarna (t. ex. späda myosin, ändra Mät temperaturen) eller helt enkelt begränsa analysen till den linjära delen av data.

Icke-lineariteter kan också förekomma i början av reaktionerna om bindningen av hämmare till enzymet ATPas är långsam (inträffar över minuter). I detta fall, reaktionen förväntas bromsa över tiden som enzymet-hämmare komplex ackumuleras. Inkubera analys plattan innan du lägger till substrat blandningen efter behov för att undvika detta problem.

Analys betingelserna måste väljas på ett sådant sätt att den linjära delen av reaktionerna är längre än 15 minuter. Kortare linjära delar motsvarar mindre användbara datapunkter (< 20, eftersom skanningen av hela plattan tar ~ 45 sekunder). Därför ger de linjära passningar mindre tillförlitliga sluttningar (reaktionshastigheter) med mycket högre standardfel. Å andra sidan är det inte rekommenderat att få Kinetic läsningar längre än ~ 120 minuter. Sådana experiment kan påverkas av proteindenaturering eller koncentrations förändringar på grund av lösningsmedels avdunstning. Dessa kriterier kan uppfyllas enklast genom att justera myosinkoncentrationen.

Det är viktigt att se till att de reaktioner som katalyseras av PK och LDH inte är hastighetsbegränsande i det kopplade Reaktionssystemet. Kontroll experiment som utförs utan ATPas av intresse eller på höga nivåer av en potent ATPas hämmare skulle visa någon (eller liten) aktivitet. Tillägget av ADP skulle dock resultera i en snabb signal minskning om LDH och PK är aktiva och fungerar korrekt. Andelen NADH konsumtion förväntas vara mycket hög i detta kontroll experiment, så det är viktigt att börja upptäcka så snart som möjligt efter reaktionen har initierats av tillsats av ADP.

Det rekommenderas alltid att utesluta alla observerade ATPase-frekvenser som erhålls över hämmaren löslighet från dataanalysen. Eftersom lösligheten beror på temperaturen, renhet av föreningen, och skillnader i sammansättningen av lösningen, är det starkt rekommenderat att mäta det under förhållanden som är mycket lika de faktiska förhållandena (temperatur, buffert, etc.) under ATPas-analysen utförs. Försök att använda småmolekylära hämmare ovan löslighet kan resultera i nederbörd som kan påverka resultaten (se figur 4). Nederbörd begränsar koncentrationen av föreningen vid eller nära löslighet. Därför kan ATPas priser inte minskas ytterligare genom att lägga till fler hämmare. Med hjälp av en bra positiv kontroll som visar ~ 100% hämning, därför, kan bidra till att identifiera sådana avvikelser i signalen, även om lösligheten är okänd. En stor skillnad mellan den observerade reaktionshastigheten hos den positiva kontrollen och reaktionshastigheten som hör till den maximala inhibitionsnivå (IMax) som bestäms genom montering är alltid en bra indikation på problemet. Gradvis utesluta mer och mer data från analysen och/eller använda den positiva kontrollen som jagMax och hålla den fast under monteringen processen tills en bättre passform erhålls rekommenderas i sådana fall. Hämmare nederbörd kan också resultera i stark ljusspridning och kan också ändra de optiska egenskaperna hos hämmaren, vilket leder till onormalt hög observerade signal intensiteter i början av reaktioner och/eller öka signaler över tiden. Rådata måste alltid inspekteras noggrant, och de påverkade koncentrationerna måste uteslutas från analysen.

Metodens begränsningar

Den slutliga analys koncentrationen för Atpaser med ett lågt omsättnings nummer (t. ex. hjärtmuskeln myosin II) måste vara hög (flera hundra nM) för att uppnå mätbara reaktionshastigheter inom Tidsfönstret för analysen (30 − 120 minuter). Därför kan det vara viktigt att använda den kvadratiska bindnings modellen för analys av dos-responskurvor. Andra bindnings modeller (hyperbolisk, kulle) är vanligtvis inte lämpliga för analys av sådana data. Dessutom, koncentrationen av ATPas sätter en lägre gräns för intervallet av mätbara inhibitoriska konstanter eftersom dosresponskurvor blir omöjlig att skilja i praktiken på grund av förekomsten av experimentella fel om Kjag är nära eller mindre än den koncentrationen av ATPas.

Skillnader i sammansatta potenser bör alltid kvantifieras genom att utföra dos-responsexperiment och fastställa inhibitoriska konstanter. Även om en enda punkt screeningdata återspeglar dessa skillnader i teorin, den icke-linearitet av svaren, tillsammans med det experimentella felet skulle göra det extremt svårt att utföra en sådan analys. Enstaka punkt screening experiment bör utformas för att fånga även de relativt svaga hämmare med högt förtroende genom att välja en lämplig inhibitor koncentration och en fördefinierad tröskel svarsnivå för att skilja mellan aktiva och inaktiva Föreningar.

Att fastställa att skillnaderna mellan de inhibitoriska konstanterna är statistiskt signifikanta utförs bäst genom att skriva om ekvationen för ickelinjär regression för att bestämma pKi (-logki) istället för Ki, eftersom PKi är normalt fördelad, medan KI inte är30. Osäkerheten för pKI är symmetrisk, medan den inte är symmetrisk för Ki31. Konfidensintervall kan beräknas för pKi och t-test eller analys av varians (ANOVA) kan användas för att avgöra om medel för PKi mätningar är signifikant olika. Emellertid, försiktighet måste iakttas när du utför ett sådant statistiskt test som de antar homoscedasticity (samma avvikelse av data i grupper). Man kan förvänta sig högre varians associerad med pKI när en full dos-responskurva inte kan erhållas på grund av sammansatta löslighets problem. I detta fall bör andra lämpliga statistiska tester som inte förutsätter lika avvikelser (t. ex.

Alla sammansatta hämmande PK eller LDH skulle ge en falsk positiv signal i NADH-kopplade ATPas assay. Några av dessa falska positiva identifieringar kan identifieras genom att köra analysen med en icke-närstående ADP producerande enzym. I detta fall kan ingen hämning förverkliga positiva träffar förväntas, om inte hämmaren är en ATP-analog bindning till båda enzymerna. För att påvisa en sådan analys utförde vi en ATPas-analys med para-aminoblebbistatin och apyrase, ett ATP-hydrolyserande enzym som inte var relaterat till myosiner (se figur 5). Alternativt, en annan funktionell analys som är specifik för enzymet av intresse, eller en annan ATPas-analys som inte anställer PK och LDH kan köras för att skilja mellan verkliga och falska positiva träffar (t. ex., den malakit gröna analysen).

Mätning och analys av kinetiken hos fluorescensintensiteten i alla brunnar kräver en Plattläsare som är tillräckligt snabb för att skanna hela plattan på mindre än ~ 90 − 60 sekunder.

Metodens betydelse med avseende på befintliga/alternativa metoder

I motsats till den "traditionella" absorbans-baserade avläsning16,17,18,19,20, den modifierade NADH-kopplade ATPas assay som presenteras här förlitar sig på NADH Fluorescence. Detta gör analysen känsligare, så att användaren kan minska excitation ljusintensitet och därmed skydda NADH eller inhibitorer mot fotokemisk nedbrytning.

Även om analysen allmänt anses vara inte lämplig för hantering av ett stort antal prover32, de små reaktions volymer som uppnåtts här (20 μl) i ett 384-bra format gör det lämpligt för semi-High genomströmning screening applikationer, särskilt om bestämning av inhibitoriska konstanter anses.

Alternativa metoder förlitar sig vanligtvis på upptäckten av det oorganiska fosfat som produceras av enzymet ATPas. Till exempel kan [γ-32P] ATP användas som substrat för ATPas och därefter kan det friterade oorganiska fosfatet mätas baserat på dess radioaktivitet. Analysen är känslig; men det kräver hantering av radioaktiva ämnen och resterande ATP måste separeras från den oorganiska fosfat (t. ex., genom adsorption av ATP på kol)33. I den ovan nämnda malakitgröna analysen reagerar fosfat med molybdat under sura förhållanden och det resulterande foshomolybdate-komplexet binder den malakitgröna färgen som orsakar en förskjutning i absorptionsspektrat19,21, 22,23,24. Denna metod kräver också kylning av ATPas reaktionen; Därför är det oftast används som en Endpoint-analys, särskilt i hög genomströmning format. I motsats till den kontinuerliga övervakningen av ATPas reaktion i NADH-kopplade analys, en Endpoint assay förutsätter helt enkelt linjära tidsförlopp och kan inte avslöja artefakter som leder till icke-lineariteter. Föreningar interagerar med malakit grönt eller komplexa bildas kan också leda till artefakter21. Dessutom är den malakit gröna analysen mycket känslig för fosfatkontaminering24. Däremot är den NADH-kopplade analysen inte känslig för ADP-kontaminering eftersom ADP (som alltid finns på olika nivåer i ATP-prover) snabbt omvandlas till ATP av PK i början av reaktionen. Det finns inget behov av kylning eller separation av produkterna. Ett annat fluorometriskt test för mätning av ATPas-frekvenser har redan utvecklats genom att koppla ATP-hydrolys till reaktionen som katalyseras av nukleosidfosforylas34. Emellertid, att analysen inte använder en ATP förnyelsecykel, därför bestämning av initiala reaktionshastigheter kan vara mycket mer utmanande.

Framtida applikationer eller riktningar av metoden

Många enzymer som förlitar sig på ATPas aktivitet har undersökts som potentiella läkemedelsmål. Dessa inkluderar cytoskeletala motorproteiner som tillhör kinesinet35 och dynein familjer36 och DNA-spiraser37, som alla är de terminaleffektorerna i olika signalering vägar. Den analys som beskrivs här kan lätt optimeras för Drug discovery och utvecklingsprojekt som involverar alla enzym katalysera en reaktion där ADP är en produkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett bidrag från det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke och nationella institutet för drogmissbruk NS096833 (CAM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma A7699
Aurora FRD-IB Dispenser Aurora Discovery, Inc. 00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter A31841
Blebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) Akron Biotech AK1391 
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 Eppendorf 022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP Eppendorf 022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)  Sigma D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  Sigma D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel Thermo Scientific 4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)  Sigma E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader PerkinElmer 2104-0010
Glycerol  Sigma G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) Sigma L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)  Sigma M2670
Microplate Shaker VWR   12620-926 
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural Greiner Bio-One 784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)  Sigma M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) Cytoskeleton  MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) Cytoskeleton  MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) Sigma N8129
NaN3 (Sodium azide)  Sigma 71289
NaOH (Sodium hydroxide)  Sigma S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) PerkinElmer 2100-5850 Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) PerkinElmer 2100-5390 Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase PerkinElmer 2100-4270 Barcode 418
OriginPro 2017 software OriginLab N/A
para-Aminoblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) Sigma P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) Sigma P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder Pel Freez Biologicals 41995-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
  2. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  3. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  4. Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).
  5. Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).
  6. He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).
  7. Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).
  8. Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).
  9. Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).
  10. Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351 (6273), 617-621 (2016).
  11. Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).
  12. Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
  13. Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141 (2016).
  14. Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).
  15. Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
  16. Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).
  17. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).
  18. Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24 (1), 127-139 (2016).
  19. Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
  20. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).
  21. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  22. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).
  23. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
  24. Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).
  25. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
  26. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  27. Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).
  28. Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).
  29. Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).
  30. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).
  31. Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
  32. Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
  33. Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).
  34. Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).
  35. Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment? Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).
  36. See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).
  37. Datta, A., Brosh, R. M. Jr New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).

Tags

Biokemi ATPas assay NADH fluorescens semi High-genomströmning screening hämmande konstant myosin
En semi-High-genomströmning anpassning av NADH-kopplad ATPas-analys för screening av småmolekylära hämmare
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, … More

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter