Selektiv instillation af intra-bronkial syre til venstre lunge i mus resulterer i ensidig og selv begrænset akut lungeskade, der modellerer humant Akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) induceret af gastrisk syre aspiration.
Selektiv intra-bronkial instillation af saltsyre (HCL) til murine Left højre Bronkie forårsager akut vævsskade med histopatologiske fund svarende til humant Akut respiratorisk distress syndrom (ARDS). Det resulterende alveolært ødem, alveolær-kapillær barriere skader og leukocyt infiltration påvirker overvejende den venstre lunge, bevarer den rigtige lunge som en uskadet kontrol og tillader dyrene at overleve. Denne model af selv begrænset akut lungeskade muliggør undersøgelse af vævs opløsnings mekanismer, såsom makrofag efferocytose af apoptotiske neutrofiler og restitution af alveolær kapillær barriere integritet. Denne model har bidraget til at identificere vigtige roller for resolution agonister, herunder specialiserede Pro-løsning mæglere (Spm’er), der udgør et fundament for udvikling af nye terapeutiske tilgange til patienter med ARDS.
Akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) er en vigtig årsag til akut respirationssvigt1. Det er en fælles og dødelig eller invaliderende sygdom, der opstår i 10% af alle patienter indlagt på intensivafdelinger Worldwide2. Ifølge Berlin definition3, ARDS er defineret ved akut indtræden af hypoxemic respiratorisk svigt (< 1 uge) og bilateral pulmonal infiltrater på bryst radiografer, der ikke forklares ved hjertesvigt4. Den underliggende patogenbiologi er karakteriseret ved en overdreven inflammatorisk respons. Lungerne kan blive såret direkte, såsom i lungebetændelse eller med gastrisk syre aspiration, eller indirekte, såsom i sepsis eller efter flere blodtransfusioner4. Efter den indledende fornærmelse, ARDS patogenesen skrider frem i tre faser: exudative, proliferative, og fibrotiske faser1. Disse faser er karakteriseret ved særskilte molekylære og cellulære immun-og reparationsmekanismer, der bestemmer prognosen for ARDS patienter. Understøttende behandling forbliver den grundpille for ARDS patienter; i øjeblikket er der ingen effektive farmakologiske behandlinger for ARDS, så der er et presserende behov for ny forskning på denne ødelæggende betingelse4.
Dysregulering af det medfødte immunrespons under den exudativ fase bidrager til akut indtræden af ARDS og associeret respirationssvigt1. Potent Pro-inflammatorisk mediator signalering orkestrater den oprindelige immunrespons, fører til afbrydelse af den alveolære kapillar barriere, diffus alveolært ødem, og neutrofile infiltration til stedet for lunge vævsskade4. I ARDS, ineffektive bremse signaler for akut inflammation prædisponere til lungesvigt og kan forsinke rettidig katabasis af den skadede lunge væv5. Til dette formål kan prækliniske undersøgelser af de endogene initiering og Pro-resolution mekanismer af ARDS afdække nye terapeutiske strategier. En sådan undersøgelse kræver selv begrænsede eksperimentelle in vivo-modeller for akut lungeskade, der nøje ligner træk ved menneskelige ARDS, hvilket muliggør afhøring af mekanismer, som ligger til grund for Initierings-og afviklings faserne for vævsskade.
Den murine model præsenteres her producerer direkte akut lungeskade, der viser de kardinal patogenbiologiske processer af exudativ ARDS, nemlig alveolær-kapillar barriere forstyrrelse og neutrofile infiltration. Metoden er afhængig af selektiv intra-bronkial instillation af HCl gennem kanylering af venstre højre bronchus, lokalisering af skaden og inflammatorisk respons på venstre lunge; den uforkrænkede højre lunge kan bruges som en intern kontrol for udvalgte bestemmelser af vævsskade og inflammation. Desuden er ensidig lungeskade ikke-dødelig og afslører et opløsnings program. Dette giver et særskilt vindue til opløsning af lungebetændelse, der kan udnyttes til identifikation af endogene Pro-løsning mediatorer og cellulære mekanismer og til at åbne nye terapeutiske veje for ARDS, der fremhæver opløsningen fysiologi og Farmakologi.
Den intra-bronchiale instillation metode, der er beskrevet her, bruger selektiv kanylering af venstre højre Bronkie til indgyde HCL i venstre lunge, hvilket resulterer i ensidig og selv begrænset murine akut lungeskade. Denne murine syre lungeskade model nøje repræsenterer den inflammatoriske respons, histopatologi, og fysiologiske dysfunktion set i menneskelige ARDS, hvor gastrisk syre aspiration er et fælles bundfald eller medvirkende faktor4. Eksponeringen af murin-luftvejene til lav pH HCl resulterer i øget permeabilitet af den alveolære kapillær barriere, alveolært ødem og dyb neutrofilinfiltration på skadestedet. Disse hændelser observeres ikke i den uforkrænkede højre lunge. Derudover producerer denne model hurtige inflammatoriske reaktioner, der toppe inden for 24 timer efter syre instillation, og deler ændringer i genekspression med menneskelige ARDS, såsom differentialekspression af fosfolipase D isoformer10.
Selv om denne murine prækliniske model gengiver mange af funktionerne i ARDS på molekylære, cellulære, og væv niveauer, det ikke fuldt ud rekapitulere menneskelige ARDS. Definitionen af ARDS omfatter bilateral lunge involvering3, mens den instillation metode, der er beskrevet her, resulterer i design i ensidig lungesygdom. Desuden kræver dyrene ikke kontinuerlig mekanisk ventilation, immobilitet eller parenteral sedation. Resultater præsenteret her (vide Supra) og andetsteds6,9,11,12,13 viser, at ensidig syre induceret lungeskade gengiver de fleste af de patologiske kendetegn ved Samtidig give den enestående mulighed for at bruge den rigtige lunge som intern kontrol og til at studere opløsningen fase af denne sygdom. Som sådan, den model, der diskuteres her modeller ARDS patogenbiologi, men også giver mulighed for mekanisk undersøgelse af grundlæggende lunge væv respons på skade og afvikling mekanismer, som kan være relevante for at tackle denne vigtige sygdom.
Instillation af HCl repræsenterer direkte akut lungeskade, så det er modellering aspekter af Patofysiologi forbundet med aspiration pneumonitis. Desuden er den oprindelige venstre lunge fornærmelse i denne model genereret ved hjælp af steril HCl snarere end bakterier-lastet gastrisk indhold set i nogle menneskelige aspiration begivenheder, der kan også føre til lungebetændelse14. I mennesker, aspiration af patogene bakterier kan resultere i sekundær bakteriel lungebetændelse, der forværrer den akutte inflammatoriske respons, forlænge den oprindelige lungeskade og øge patientens modtagelighed for at udvikle ARDS14. Denne potentielle begrænsning er blevet behandlet af investigatorer med vilje indgyde patogene bakterier Escherichia coli (E. coli)15 efter steril HCL. Desuden er denne metode blevet anvendt til at undersøge patogen medierede betændelse ensidig bakteriel lungebetændelse kan være induceret af selektiv venstre lunge instillation af bakterier, såsom E. coli16,17, Pseudomonas aeruginosa16, og Streptococcus pneumoniae18 . Den selv begrænsede akutte lungeskade model, der er beskrevet her, kan også anvendes til at studere respirator induceret lungeskade (VILI), en vigtig årsag til øget dødelighed i menneskelige ARDS19. Eksperimentelle animalske modeller af VILI involverer normalt mekanisk ventilation i naive mus med tidevands volumener, der er meget højere end hvad der er klinisk anvendt til at forårsage lungeskade (> 15 ml/kg; Se tidligere arbejde20,21). Mod en mere klinisk relevant model af VILI kan instillation af intra-bronkial syre som beskrevet her først anvendes til at fremkalde ikke-dødelig lungeskade efterfulgt af mekanisk ventilation ved tidevands volumener inden for det kliniske område (6-12 mL/kg). Denne hypotetiske dyremodel kan give investigatorerne mulighed for at studere VILI på en klinisk relevant måde, når de er udviklet og valideret. Sammen, disse murine modeller fremhæve alsidigheden af selektiv intrabronchial instillation metode til at generere ensidige lunge fornærmelser, der nøje ligner patologier forbundet med menneskelige lungesygdomme.
Ud over at tillade selektiv instillation af forskellige skadelige stoffer til venstre lunge, teknikken med intra-bronkial instillation efter trakeostomi kræver ikke udvidet uddannelse, lang procedure tid, eller komplekst udstyr, og i erfarne hænder forårsager minimal lidelse for dyrene. På trods af dette, flere problemer kan opstå under selektiv HCl instillation procedure, der kan påvirke eksperimentelle resultater. Forkert kanylering af den venstre hovedstamme Bronkie kan resultere i bilateral lungeskade, der mindsker overlevelsen af eksperimentelle mus og behersker brugen af den rigtige lunge som en uskadet intern kontrol. Dette kan undgås ved at fiske kateteret tilstrækkeligt mod venstre lunge under kanyle, indtil modstanden er nået. Efter injektion af HCl skal en bolte af luft injiceres, kateteret hurtigt fjernes, og Operations brættet bragte oprejst til en 60 ° vinkel. Disse trin er afgørende for at sikre, at syren når de distale luftveje i venstre lunge og forhindrer refluks af syre i den rigtige lunge og luftrør, som kan forårsage proksimal skade. Inden for 24 timer efter instillation er skaden i venstre lunge diffus med omfattende lungeødem, der påvirker både den distale og proksimale venstre lunge.
Under metodeudvikling i voksne 8-12 uge gamle mus, 2,5 mL/kg intra-bronkial HCl produceret betydelig endnu subletale akut lungeskade; lavere doser af HCl resulterede ikke i reproducerbar og homogen lungeskade. Selvom vi ikke har udført denne model i yngre (f. eks. 3-6 uger gamle) eller ældre mus (f. eks. 10-14 måneder gamle), forventer vi, at vægtbaseret dosering af HCl vil resultere i en lungeskade-fænotype svarende til det, der er noteret i 8-12 uger gamle mus. Vi anbefaler, at investigatorerne titrerer HCl-doserne for at opnå den ønskede grad af lungeskade, før der udføres eksperimenter med mus ved ekstreme vægte.
Denne selektive syre instillation procedure tilbyder en ikke-dødbringende murine model af sterile væv betændelse, der reducerer behovet for støttende pleje, såsom mekanisk ventilation. Med forlænget overlevelse af sårede mus, den syre-induceret inflammation har tid nok til selv-løse. Afviklingsfasen af denne model er blevet brugt til at identificere timeligt regulerede endogene bioaktive lipid-mediatorer, betegnet specialiserede Pro-løse mediatorer (Spm’er), såsom lipoxin A4 (lxa4), Maresin 1 (MaR1), og resolvins6 ,11,12,16. Administration af udefrakommende Spm’er til sårede mus øger opløsningen af syre induceret lungeskade ved at dæmpe inflammatoriske mekanismer og fremme katabasis af det skadede lunge væv. Disse spm’er fremme clearance af alveolært ødem12, øge efferocytose af apoptotiske neutrofiler ved rekrutteret makrofager16, og fremskynde re-epitelialisering af luftvejene og alveolerne12 at reducere vaskulære lækage og vævs hypoksi. I en model af patogen-induceret lungeskade, 15-EPI-resolvin D1 også udstillet antimikrobielle handlinger gennem øget bakteriel fagocytose af makrofager og øget bakteriel clearance fra den inficerede lunge16. Undersøge disse endogene afviklingsmekanismer giver indsigt i potentielle nye terapeutiske strategier for patienter med ARDS5.
For bedst at studere den rumlige regulering af afviklings mekanismerne er der behov for in vivo-forsøgsmodeller. Akutte lungeskade modeller skal omfatte relevante akutte inflammatoriske reaktioner og organ dysfunktion med inddragelse af vært resolution fremme molekylære og cellulære processer. Disse mekanismer kan kvantificeres ved hjælp af etablerede opløsnings indekser22. Den selektive intra-bronkiale instillation metode til at generere ensidig akut lungeskade har vist sig nyttigt i denne henseende at sonde endogene opløsning mediatorer og veje. Fremtidige undersøgelser, der uddyber vores forståelse af disse aktive opløsnings processer, har løftet om at føre til terapeutiske agonister, der efterligner bioaktionerne af endogene lipid-mediatorer for at forbedre opløsningen af inflammation og afbøde sygelighed og dødelighed af ARDS og andre vigtige lungesygdomme.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Joseph Mizgerd for hans bidrag til udviklingen af den selektive intra-bronchiale metode og for hans nyttige kommentarer og gennemgang af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhedstilskud P01GM095467 (B.D.L.) og K08HL130540 (R.E.A.).
10x Zinc Fixative | BD Biosciences | 552658 | |
2-0 Braided Silk Suture | Surgical Specialties | SP118 | |
24G x 3/4" Disposable Safelet I.V. Catheter | Excel | 26751 | |
33 mm, 0.22 µm syringe filter unit | Millipore-Sigma | SLGP033RS | |
4" Long Serrated Slight Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5135 | |
4" Long Tip Serrated Full Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5137 | |
4.5 " Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | |
6" Crile Wood Needle Holder | Roboz | RS-7860 | |
60 mL syringe | BD Biosciences | 309653 | |
Anti-mouse FITC-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 11-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
Anti-mouse PE-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 12-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
Bead sterilizer | |||
Betadine Solution Swabstick | Betadine | 67618-153-01 | |
Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | |
Clear flat-bottomed 96-well microplate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
Dulbeccos's Phosphate Buffered Saline (PBS) without Ca2+ or Mg+ | life technologies | 14190-144 | |
Electric clippers | |||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore-Sigma | E6758 | |
Evans Blue Dye | Millipore-Sigma | E-2129 | |
Heating pad | |||
Hydrochloric acid, 37% | Millipore-Sigma | 258148 | |
Ketamine | Henry-Schein | 56344 | |
Microplate reader (640, 720 nm) | |||
P200 Pipette | |||
P200 Pipette Tips | |||
pH probe | |||
Ring stand with extension clamp | |||
Sterile Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 22-363-750 | |
Sterile Mouse Drape 8" x 8" with Oval Adhesive Fenestration | Steris | 88VCSTF | |
Sterile Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 56890 | |
Sterile Towl Drape | Dynarex | 4410 | |
Wax Coated 4-0 Braided Silk Suture | Covidien | SS733 | |
Xylazine | AKORN | NDC: 59399-111-50 |