Summary
Die selektive inbronchiale Säureinstillation in die linke Lunge bei Mäusen führt zu einseitigen und selbstbegrenzten akuten Lungenverletzungen, die das durch Magensäureaspiration induzierte humane akute Atemnotsyndrom (ARDS) modelliert.
Abstract
Selektive intrabronchiale Instillation von Salzsäure (HCl) an den murinen linken Hauptstamm Bronchus verursacht akute Gewebeverletzungen mit histopathologischen Befunden ähnlich dem akuten Atemnotsyndrom (ARDS). Die daraus resultierenden Alveolarödeme, Alveolar-Kapillarbarriereschäden und Leukozyteninfiltration betreffen vorwiegend die linke Lunge, wobei die rechte Lunge als unverletzte Kontrolle erhalten bleibt und es den Tieren ermöglicht, zu überleben. Dieses Modell der selbstbegrenzten akuten Lungenverletzung ermöglicht die Untersuchung von Gewebelösungsmechanismen, wie Makrophagen-Efferozytose von apoptotischen Neutrophilen und die Wiederherstellung der Integrität der alveolar-Kapillarbarriere. Dieses Modell hat dazu beigetragen, wichtige Rollen für Auflösungsagonisten zu identifizieren, einschließlich spezialisierter Vermittler ,,Pro-Solving Mediators, die eine Grundlage für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze für Patienten mit ARDS bieten.
Introduction
Akutes Atemnotsyndrom (ARDS) ist eine wichtige Ursache für akute Ateminsuffizienz1. Es ist eine häufige und tödliche oder behindernde Krankheit, die bei 10% aller Patienten auftritt, die weltweit auf Intensivstationen aufgenommen werden2. Nach der Berliner Definition3wird ARDS durch den akuten Beginn hypoxämischer Ateminsuffizienz (<1 Woche) und bilateraler Lungeninfiltrate auf Bruströntgenaufnahmen definiert, die nicht durch Herzinsuffizienz erklärt werden4. Die zugrunde liegende Pathobiologie ist durch eine übermäßige Entzündungsreaktion gekennzeichnet. Die Lunge kann direkt verletzt werden, z. B. bei Lungenentzündung oder mit Magensäure-Aspiration, oder indirekt, wie bei Sepsis oder nach mehreren Bluttransfusionen4. Nach der anfänglichen Beleidigung schreitet die ARDS-Pathogenese in drei Phasen voran: exsudative, proliferative und fibrotische Phasen1. Diese Phasen zeichnen sich durch ausgeprägte molekulare und zelluläre Immun- und Reparaturmechanismen aus, die die Prognose für ARDS-Patienten bestimmen. Die unterstützende Versorgung bleibt die tragende Säule für ARDS-Patienten; Derzeit gibt es keine wirksamen pharmakologischen Behandlungen für ARDS, so gibt es einen dringenden Bedarf an neuen Forschung über diese verheerende Zustand4.
Dysregulation der angeborenen Immunantwort während der Exsudativphase trägt zum akuten Beginn von ARDS und damit verbundener Ateminsuffizienzbei 1. Potente pro-inflammatorische Mediator-Signalisierung orchestriert die anfänglichen Immunreaktionen, was zu einer Störung der Alveolar-Kapillarbarriere, diffusen Alveolarödem und neutrophilen Infiltration an der Stelle der Lungengewebeverletzung4führt. In ARDS prädisponieren unwirksame Bremssignale für akute Entzündungen zum Lungenversagen und können die rechtzeitige Katabasis des verletzten Lungengewebes verzögern5. Zu diesem Zweck kann die präklinische Untersuchung der endogenen Initiierungs- und Pro-Resolution-Mechanismen von ARDS neuartige therapeutische Strategien aufdecken. Eine solche Untersuchung erfordert selbstbegrenzte experimentelle In-vivo-Modelle akuter Lungenverletzungen, die den Merkmalen des menschlichen ARDS sehr ähnlich sind, was die Abfrage von Mechanismen ermöglicht, die der Einleitungs- und Abwicklungsphase von Gewebeverletzungen zugrunde liegen.
Das hier vorgestellte murine Modell produziert direkte akute Lungenverletzungen, die die kardinalen pathobiologischen Prozesse exsudativer ARDS zeigen, nämlich alveolar-kapillare Barrierestörung und neutrophile Infiltration. Die Methode beruht auf selektiver intra-bronchiale Instillation von HCl durch Cannulation des linken Mainstammbronchus, Lokalisierung der Verletzung und Entzündungsreaktion auf die linke Lunge; Die unverletzte rechte Lunge kann als interne Kontrolle für ausgewählte Bestimmungen von Gewebeverletzungen und Entzündungen verwendet werden. Darüber hinaus ist einseitige Lungenverletzung nicht tödlich und enthüllt ein Auflösungsprogramm. Dies bietet ein deutliches Fenster zur Auflösung von Lungenentzündungen, die zur Identifizierung endogener Pro-Auflösungsmediatoren und zellulärer Mechanismen genutzt werden können, und um den ARDS neue therapeutische Wege zu eröffnen, die die Auflösungsphysiologie und pharmakologie.
Protocol
Alle nachstehenden Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care And Use Committee am Brigham and Women es Hospital (Protokoll #2016N000356) überprüft und genehmigt.
HINWEIS: Sterile Technik wurde für alle Überlebensverfahren befolgt. Für jede Operation wurde ein steriles Feld mit einem sterilen Drapat eingerichtet, während Chirurgen sterile chirurgische Handschuhe, Mützen, Masken und saubere Labormäntel trugen. Alle chirurgischen Instrumente wurden mit einem Autoklaven sterilisiert, und die Sterilität wurde mit einem Perlensterilisator aufrechterhalten.
1. Vorbereitung von 0,1 N HCl
- 11 ml ddH2O in eine Bernsteinglasflasche geben. Fügen Sie langsam 1 ml 37% HCl (12 N) hinzu, um einen 1 N HCl-Betriebsbestand zu erstellen.
ACHTUNG: Stellen Sie sicher, dass HCl in das Wasser aufgenommen wird. Dies ist ein Sicherheitsproblem, da das Hinzufügen von Wasser direkt zur Säure dazu führen kann, dass Säure kocht und aus der Flasche spritzt. Achten Sie beim Umgang mit konzentriertem HCl darauf, dass die Säure in einer belüfteten chemischen Kapuze aufbewahrt wird und die entsprechende persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Labormantel, Handschuheunden und Schutzbrillen, getragen wird. - Fügen Sie langsam 4 ml des zuvor verdünnten HCl-Arbeitsbestands in 35 ml ddH2O in einem 50 ml konischen Rohr hinzu, um einen 0,1 N HCl-Experimentalbestand zu erzeugen.
- Messen Sie den pH-Wert des Versuchsbestands mit einer elektronischen pH-Sonde nach Dertwo-Point-Kalibrierung mit Niedrigen pH-Lösungen. Mit NaOH- oder HCl-Lagerlösungen nach Bedarf auf pH 1,1 titrate, so dass das Endvolumen 40 ml beträgt.
HINWEIS: Die Messung der niedrigen pH-Werte kann schwierig sein. Um eine genaue Messung zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass die pH-Sonde ordnungsgemäß mit niedrigen pH-Standards kalibriert wird, um eine Überextrapolation der Messung zu vermeiden. - Filtern Sie unmittelbar vor dem Experiment 1–2 ml des experimentellen HCl-Bestands durch einen 0,22 m sterilen Filter in ein steriles Mikrozentrifugenrohr.
2. Selektive intrabronchiale Instillation von HCl
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Vorbereitung des Operationsbereichs
- Induzieren Sie die Vollnarkose durch DieInjektion eines Ketaminge (100 mg/kg) und Eines Xylazin (10 mg/kg) Gemischs durch intraperitoneale Injektion. Stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig beäscht wird, indem Sie die Spitze des Schwanzes oder hinteren Fußes sanft drücken. Mangelnde Entzugsreaktion ist erforderlich, bevor ein Hautschnitt gemacht wird. Bei Bedarf zusätzliche Anästhesiebolusen verabreichen.
- 0,1 mg/kg Buprenorphin subkutan unter der Halsschnupzer geben. Das präoperative Analgetikum wird die Wirkung der Anästhesie verstärken und prä- und postoperative Schmerzen, die sich aus dem Verfahren ergeben, lindern.
- Verwenden Sie elektrische Clippers, um den chirurgischen Bereich auf der ventralen Oberfläche der Maus, unterhalb des Kinns im Halsbereich des Rachens, mit langsamen Abwärtsschlägen sanft zu rasieren. Entfernen Sie loses Fell, um die darunter liegende Haut vollständig freizulegen.
- Bereiten Sie den chirurgischen Bereich vor, indem Sie die rasierte Stelle mit 10% Povidon-Jod-Lösung abwischen. Nach dem Auftragen der aseptischen Lösung reinigen Sie die Stelle mit einem 70% Isopropylalkoholabstrich. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
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Isolieren der Luftröhre
- Legen Sie die Maus in eine Supine-Position auf einem sauberen operationsärztlichen Brett und bedecken Sie die Maus in einem sterilen chirurgischen Vorhang, während sie die Exposition des chirurgischen Bereichs aufrechterhält. Sichern Sie den Vorhang an Ort und Stelle.
- Machen Sie einen 0,5 cm Längsschnitt in der Haut über den Luftröhre und Speicheldrüsen. Verwenden Sie leicht gekrümmte gezackte Zangen, um die Haut vorsichtig zurückzuziehen und die Speicheldrüsen sanft zu trennen, um die Trachealmuskeln freizulegen.
- Mit gezackten Zangen für stumpfe Sezierung, schieben Sie sanft die Paratrachealmuskeln auseinander und necken die Faszie, die die Luftröhre umgibt, bis die Knorpelringe der Luftröhre vollständig freigelegt sind.
- Verwenden Sie voll gekrümmte gezackte Zangen, um die Luftröhre zu heben und das Bindegewebe zwischen der Retro-Trachea und der Retro-Faszie zu trennen. Sobald das Bindegewebe abgetrennt ist, sollte die Spitze der Zange vollständig hinter die Luftröhre gleiten.
- Halten Sie die gekrümmten Zangen hinter der Luftröhre und greifen Sie ein 10–15 cm großes Stück 4-0 geflochtene Seidennaht mit den Spitzen der Zange. Ziehen Sie die Naht hinter die Luftröhre, so dass es eine gleichmäßige Länge auf beiden Seiten gibt.
- Sobald die Naht an Ort und Stelle ist, ziehen Sie vorsichtig die Seiten der Naht in Richtung des Hinterteils der Maus und halten Sie die Seiten an Ort und Stelle.
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Selektive Cannulation des linken Mainstammbronchus und Instillation von HCl
- Nehmen Sie einen 24 G x 3/4" Angiokatheter und legen Sie die Nadel, abschrägen, in den vorderen Bereich der Luftröhre zwischen dem ersten und zweiten Trachealringen. Sobald die richtige Insertion durch direkte Visualisierung der Nadelspitze im Tracheallumen bestätigt wird, lassen Sie die Naht los und bringen Sie die Kanüle über die Nadel und in die Luftröhre, bis der Widerstand erreicht ist, und ziehen Sie dann die Nadel zurück. Winkeln Sie die Richtung der Insertion in Richtung des linken Hauptstammbronchus für die selektive Instillation in die linke Lunge.
- Sobald die Kanüle an Ort und Stelle ist, greifen Sie den Injektionsanschluss fest, um zu verhindern, dass sich der Katheter verschiebt.
- Mit einer P200 Pipette und sterilen P200 Pipettenspitzen 2,5 ml/kg (50 l für eine 20 g Maus) steril gefilterten 0,1 N HCl in den Katheter einflößen, gefolgt von einem identischen Luftvolumen.
- Ziehen Sie den Katheter schnell zurück und heben Sie das Operationsbrett für 30 s auf einen 60°-Winkel.
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Schließen des Operationsbereichs
- Legen Sie das OPERATIONSbrett flach und entfernen Sie die Naht hinter der Luftröhre.
- Verwenden Sie 4-0 wachsbeschichtete geflochtene Seidennaht, um den Hautschnitt mit 2–3 Stichen zu schließen.
3. Postoperative Pflege
- Sobald der Schnitt geschlossen ist, legen Sie die Maus auf der linken Seite auf ein warmes Heizkissen, bis sich die Maus von der Anästhesie erholt. Beginnen Sie mit der Überwachung der Maus auf Schmerzen und Aktivitätsniveau, bevor Sie sie zum normalen Gehäuse zurückgeben.
HINWEIS: Buprenorphin sollte bei 0,1 mg/kg subkutan alle 6-12 h für die ersten 24 h verabreicht werden. Wenn anhaltende Durchbruchschmerzen vorhanden sind, verlängern Sie das schmerzstillende Regime, bis der Schmerz nachlässt.
4. Ganze Lunge Bronchoalveolar Lavage (BAL) und Leukozyten Immunophenotypisierung
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Euthanisieren Sie die Maus, indem Sie 3x die in Schritt 2.1.1 verwendete Dosis ketamin/Xylazin verabreichen.
- Zur Unterscheidung interstitiellen und intravaskulären Neutrophilen injizieren Sie einen ausgewählten Fluorophor-markierten Ly6G-Antikörper 5 min vor der Euthanasie. Dieses Etikett sollte für den Nachweis durch Durchflusszytometrie geeignet sein, um intravaskuläre Neutrophile von Lungeninterstitiellen und alveolären Neutrophilen zu unterscheiden, die während der Gewebevorbereitung mit einem anderen Fluorophor gekennzeichnet werden (siehe unten).
- Legen Sie die Maus auf ein chirurgisches Brett und haken Sie die vorderen Schneidezähne um eine Schlaufe von 2-0 geflochtene Seidennaht.
- Befolgen Sie die Schritte 2.2.2–2.2.6. , um die Luftröhre für die Konservenulation vorzubereiten.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Zwerchfell nicht punktiert ist, um den transalveolären Aufblasdruck während der Lungenspülung zu maximieren; Die Linke-Lungen-Compliance nimmt nach Verletzungen ab, die einen höheren Transalveolardruckbedarf für die Lungenspülung erfordern können. - Die Luftröhre nach Schritt 2.3.1 ankündigen, aber den Katheter nicht unter die Karina bringen; den Katheter parallel zur Luftröhre einsetzen.
- Mit dem Katheter eingesetzt, binden Sie die Naht um die Luftröhre, um den Katheter an Ort und Stelle zu halten.
- Einflöße und zurückziehen sie zwei aufeinander folgende 1 ml Aliquots eiskalten PBS -/- (ohne Magnesium oder Kalzium) mit 0,6 mM EDTA mit einer 1-ccm-Spritze. Für die Immunphenotypisierung durch Durchflusszytometrie entfernen Sie jedes Aliquot und kehren Sie zu einem 5 ml Polystyrol FACS-Röhre auf Eis zurück.
- Um die Euthanasie zu gewährleisten, führen Sie eine Thorakotomie mit einer chirurgischen Schere gefolgt von einer Herzpunktion durch. Die Lunge kann zur Weiterverarbeitung geerntet werden.
- Zentrifugieren Sie die BAL für 10 min bei 800 g bei 4 °C, um die Zellen zu pellet.
- Dekantieren Sie den Überstand in ein 2 ml Mikrozentrifugenrohr und aliquot in 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre. Bei -80 °C für die nachfolgende Analyse lagern.
- Setzen Sie das Zellpellet in PBS -/- mit 2% FBS für die Leukozytendifferenzanalyse durch Durchflusszytometrie aus.
- Um interstitielle und intravaskuläre Neutrophile zu differenzieren, entfernen Sie die linke und rechte Lunge getrennt und verarbeiten die Lunge für Diedurchflusszytometrie wie in Abdulnour et al. 20146.
- Färben Sie die resultierende Zellsuspension mit ausgewählten FACS-Antikörpern und achten Sie darauf, Ly6G, das mit einem anderen Fluorophor konjugiert ist als der Ly6G-Antikörper aus Schritt 4.1.1, zu färben.
5. Bewertung der Alveolar Barrieredurchlässigkeit mit Evans Blue Dye (EBD)
- Intravenös injizieren Evan es Blue Dye (40 mg/kg) 30 min vor der Euthanasie.
- Euthanisieren Sie die Maus mit Ketamin/Xylazin-Überdosierung (Schritt 4.1).
- Um die Integrität der Alveolarbarriere zu messen, befolgen Sie die Schritte 4.2–4.9 für die BAL-Auflistung.
- Übertragen Sie 100 l BALF auf eine klare 96-Well-Mikroplatte im unteren Bereich, zusammen mit 100 L doppelter EBD-Standards. Verwenden Sie PBS -/- als Leerzeichen.
- Verwenden Sie einen Mikroplattenleser, um die Absorption des BALF bei 620 nm und 740 nm zu messen. Verwenden Sie die Absorption bei 740 nm, um die Hämkontamination in den Proben zu korrigieren7.
- Um die Gefäßbarriereintegrität zu messen, durchdringen Sie die Lunge, indem Sie langsam 5 ml eiskalte SE-PBS -/- durch den rechten Herzschlitz injizieren. Entfernen Sie die linke Lunge.
- Trocknen Sie die linke Lunge für 72 h bei 58 °C, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
- Verarbeiten Sie das getrocknete Lungengewebe wie in Radu und Chernoff 20138und messen Sie die Absorptionen bei 620 nm und 740 nm.
6. Lungenhistologie
- Kanülieren Sie die Luftröhre, indem Sie die Schritte 4.1–4.5 befolgen.
- Um die Lunge mit 20cm H2 O zu befestigen, verwenden Sie einen Ringständer und eine Klemme, um eine 60 ml Spritze mit ventilgesteuerten Schläuchen zu erhöhen, die mit einer ausgewählten fixativen Lösung (z. B. Zinkfixativ) gefüllt sind, so dass der Meniskus der Fixierlösung 20 cm über dem Lunge.
- Befestigen Sie den Schlauch am Katheter und öffnen Sie den Wert. Füllen Sie die Lunge langsam mit fixativ, bis sie aufhören zu blasen.
- Entfernen Sie den Katheter 3/4 des Weges aus der Luftröhre. Binden Sie die Luftröhre mit Naht ab, bevor Sie den Katheter vollständig entfernen, um den Verlust der Fixierung zu minimieren.
- Entfernen Sie die Lunge und das Herz en bloc.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Lunge während der Entfernung nicht punktiert wird, um den Druck infundiert fixativ zu halten. - Fixieren Sie die Lunge für 24 h in 25 ml Fixierung bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die feste Lunge für sequentielle 20 min Intervalle in PBS -/-, 30% Ethanol und 50% Ethanol.
- Nach der letzten Wäsche die Lunge in 70% Ethanol für die Histologieverarbeitung wie in Eickmeier et al. 20139lagern.
Representative Results
Selektive intrabronchiale HCl-Instillation führt zu einseitigen akuten Lungenverletzungen
Die Methode der selektiven intrabronchialen Instillation von HCl in den linken Hauptstamm bronchus ist in Abbildung 1Adargestellt. Die daraus resultierende akute Lungenverletzung betrifft die gesamte linke Lunge, und nach intravenöser Verabreichung von EBD und Lungenperfusion blieb die EBD nur in der linken Lunge (Abbildung 1B). Die EBD-Extravasation in die linke Lunge wurde quantifiziert und zeigte sich signifikant erhöht im Vergleich zur scheinselektiven Instillation (Abbildung 1C; angepasst von Abdulnour et al. 20146). Als Reaktion auf Lungenverletzungen diapedesen zirkulierende Leukozyten in das entzündete Gewebe. In diesem Modell durchlaufen vaskuläre Neutrophilen eine trans-endotheliale Migration in das verletzte Lungeninterstitium. Interstitielle Neutrophile akkumulierten sich in der linken Lunge 24 h nach HCl-Instillation, im Gegensatz zur rechten Lunge, wo nur wenige interstitielle Neutrophile beobachtet werden (Abbildung 1D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die selektive linke Intra-Bronchial-Instillationsmethode zu einer murinen akuten Lungenverletzung führte, die weitgehend auf die linke Lunge lokalisiert war und pathologische Veränderungen hervorbrachte, die auch bei menschlichen ARDS beobachtet werden, einschließlich erhöhter Alveolar-Kapillarbarrierebruch und neutrophile Infiltration.
Einseitige akute Lungenverletzung ermöglicht Untersuchung von Abwicklungsmechanismen
Um die Auflösungsphase von säureinduzierten akuten Lungenverletzungen zu untersuchen, müssen Mäuse in der Lage sein, die anfängliche Beleidigung zu überleben. Im Unterschied zu intratrachealen HCl führt die Instillation in nur den linken Mainstem Bronchus zu einer selbstbegrenzten Verletzung mit gleichmäßigem Überleben bei ansonsten gesunden Mäusen. Lungen können von Mäusen zu frühen oder späteren Zeitpunkten erhalten werden, wie in Abbildung 2A. Lungenhistologie zeigt Gewebeverletzungen und Entzündungen auf Organ- und Zellebene mit exsudativer Entzündung 24 h nach einer Verletzung, die durch ausgeprägte Alveolarödeme und neutrophile Infiltration in der linken Lunge gekennzeichnet ist. Beachten Sie, dass es keine signifikanten Verletzungen oder Leukozytenzustrom in die unverletzte Kontrolle rechte Lunge (Abbildung 2A). 72 h nach Verletzung werden Ödeme und zelluläre Infiltrate erheblich verringert, was eine lösende Exsudativphase darstellt. Alveolare Neutrophile können durch Durchflusszytometrie (CD45+/CD68-/F4/80-/Ly6G+/CD11b+) überwacht werden, die durch ganze Lungenspülung erhalten werden. Neutrophile erhöhen in der linken Lunge 24 h nach der anfänglichen Verletzung und nehmen deutlich bei 48 und 72 h ab (Abbildung 2B). Wenn spätere Zeitpunkte untersucht werden, werden die Neutrophilenzahlen zur Baseline zurückkehren und Mechanismen in späteren Phasen der Katabasis, wie fibroproliferative Reaktionen, können untersucht werden.
Abbildung 1: Selektive intrabronchiale HCl-Instillation führt zu einseitigen Lungenverletzungen, die durch Alveolarbarrierebruch und neutrophile Infiltration definiert werden. (A) Darstellung der Cannulation der murinen linken Mainstem Bronchus zur selektiven Instillation von HCl in die linke Lunge. (B) Resected rechts (RL) und linke (LL) Lunge selektiver Säureinstillation ausgesetzt und nach dem intravenösen Evan-Blaufarbstoff durchlässig. (C) Quantifizierung des blauen Farbstoffs von Evan aus homogenisierter, durchgelüfmter Lunge 24 h nach Säureverletzung oder Scheinkontrolle; Figur angepasst von Abdulnour et al. 20146. Die Werte stellen den Mittelwert - SEM dar, wobei n 5. *p < 0.05, Mann-Whitney U Test. (D) Repräsentative Durchflusszytometrie der intravaskulären (I.V.; Fluorophor 1) und interstitiellen (I.S.; fluorophore 2) Neutrophilen als Prozent der gesamten CD45+ Zellen in der verarbeiteten Lunge 24 h nach Säureverletzung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Einseitige akute Lungenverletzungen sind selbstauflösend. (A) Repräsentative H&E-Histologie (10x) der linken Lunge, die von naiven Mäusen (0 h) oder Mäusen 24, 48, 72 h nach Verletzung gewonnen wurde, zusammen mit der zugehörigen rechten Lunge von derselben Maus (Skalenbalken = 250 m). (B) Repräsentative Durchflusszytometrie von alveolaren Neutrophilen (Ly6G+ CD11b+), die aus der ganzen Lungenspülung als Prozent der gesamten CD45+ Zellen in naiven (0 h) Mäusen oder Mäusen 24, 48 und 72 h nach Säureverletzungen gewonnen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Die hier beschriebene intrabronchiale Instillationsmethode verwendet eine selektive Cannulation des linken Mainstammbronchus, um HCl in die linke Lunge einzuflößen, was zu einseitigen und selbstbegrenzten akuten murinen akuten Lungenverletzungen führt. Dieses Modell der murinen Säurelungenverletzung stellt die Entzündliche Reaktion, Histopathologie und physiologische Dysfunktion im menschlichen ARDS, wo Magensäureaspiration ein häufiges Niederschlagsmittel oder beitragender Faktor4ist, eng dar. Die Exposition der murinen Atemwege gegenüber niedrigem pHHCl führt zu einer erhöhten Durchlässigkeit der Alveolar-Kapillarbarriere, alveolaren Ödemen und einer tiefen neutrophilen Infiltration an der Stelle der Verletzung. Diese Ereignisse werden in der unverletzten rechten Lunge nicht beobachtet. Darüber hinaus erzeugt dieses Modell schnelle Entzündungsreaktionen, die innerhalb von 24 h nach der Säureinstillation ihren Höhepunkt erreichen, und teilt Veränderungen in der Genexpression mit menschlichen ARDS, wie die Differentialexpression von Phospholipase D Isoformen10.
Obwohl dieses murine präklinische Modell viele der Merkmale von ARDS auf molekularer, zellulärer und Gewebeebene reproduziert, rekapituliert es den menschlichen ARDS nicht vollständig. Die Definition von ARDS umfasst die bilaterale Lungenbeteiligung3, während die hier beschriebene Instillationsmethode bei einseitigen Lungenerkrankungen gestalterisch entsteht. Darüber hinaus benötigen die Tiere keine kontinuierliche mechanische Belüftung, Unbeweglichkeit oder parenterale Sedierung. Die hier vorgestellten Ergebnisse (vide supra) und andernorts6,9,11,12,13 zeigen, dass einseitige säureinduzierte Lungenverletzungen die meisten pathologischen Merkmale der ARDS bietet gleichzeitig die einmalige Gelegenheit, die richtige Lunge als interne Kontrolle zu nutzen und die Abwicklungsphase dieser Krankheit zu studieren. Als solches modelliert das hier diskutierte Modell die ARDS-Pathobiologie, ermöglicht aber auch die mechanistische Untersuchung grundlegender Lungengewebereaktionen auf Verletzungs- und Auflösungsmechanismen, die für die Bekämpfung dieser wichtigen Krankheit relevant sein können.
Die Instillation von HCl stellt eine direkte akute Lungenverletzung dar, so dass es Aspekte der Pathophysiologie modelliert, die mit Aspirationspneumonitis verbunden ist. Darüber hinaus wird die anfängliche linke Lungenbeleidigung in diesem Modell mit sterilem HCl anstelle von bakteriellen Mageninhalten erzeugt, die in einigen menschlichen Aspirationsereignissen beobachtet werden, die auch zu einer Lungenentzündung führen können14. Beim Menschen kann die Aspiration pathogener Bakterien zu einer sekundären bakteriellen Lungenentzündung führen, die die akute Entzündungsreaktion verschärft, die anfängliche Lungenverletzung verlängert und die Anfälligkeit der Patienten erhöht, ARDS14zu entwickeln. Diese potenzielle Einschränkung wurde von den Forschern absichtlich instillieren pathogene Bakterien Escherichia coli (E. coli)15 nach sterilen HCl. Darüber hinaus wurde diese Methode verwendet, um Pathogen-vermittelte Entzündung; einseitige bakterielle Lungenentzündung kann durch selektive linke Lungeninstillation von Bakterien induziert werden, wie E. coli16,17, Pseudomonas aeruginosa16, und Streptococcus pneumoniae18 . Das hier beschriebene Modell der selbstbegrenzten akuten Lungenverletzung kann auch zur Untersuchung von beatmungsinduzierten Lungenverletzungen (VILI) verwendet werden, einer wichtigen Ursache für eine erhöhte Sterblichkeit beim Menschen ARDS19. Experimentelle Tiermodelle von VILI beinhalten in der Regel mechanische Beatmung bei naiven Mäusen mit Gezeitenvolumina, die viel höher sind als das, was klinisch verwendet wird, um Lungenverletzungen zu verursachen (>15 ml/kg; siehe vorherige Arbeit20,21). Auf dem Weg zu einem klinisch relevanteren Modell der VILI kann die hier beschriebene inbronchiale Säureinstillation zunächst zur Induzieren von nicht-tödlichen Lungenverletzungen, gefolgt von mechanischer Beatmung bei Gezeitenvolumen im klinischen Bereich (6-12 ml/kg), eingesetzt werden. Dieses hypothetische Tiermodell kann es den Forschern ermöglichen, VILI nach der Entwicklung und Validieren auf klinisch relevante Weise zu untersuchen. Zusammen unterstreichen diese murinen Modelle die Vielseitigkeit der selektiven intrabronchialen Instillationsmethode, um einseitige Lungenbeleidigungen zu erzeugen, die Pathologien im Zusammenhang mit menschlichen Lungenerkrankungen sehr ähnlich sind.
Die Technik der intrabronchialen Instillation nach tracheostomie erlaubt nicht nur die selektive Instillation verschiedener schädlicher Mittel in der linken Lunge, sondern erfordert auch keine längere Ausbildung, lange Eingriffszeit oder komplexe Ausrüstung und in erfahrenen Händen. verursacht minimale Bedrängnis für die Tiere. Trotzdem können während des selektiven HCl-Instillationverfahrens mehrere Probleme auftreten, die sich auf experimentelle Ergebnisse auswirken können. Unsachgemäße Cannulation des linken Hauptstammbronchus kann zu bilateralen Lungenverletzungen führen, die das Überleben von Versuchsmäusen verringern und die Verwendung der rechten Lunge als verletzte interne Kontrolle verwirren. Dies kann vermieden werden, indem der Katheter während der Kanulation ausreichend in Richtung der linken Lunge geangelt wird, bis der Widerstand erreicht ist. Nach der Injektion von HCl sollte ein Luftbolus injiziert, der Katheter schnell entfernt und das Operationsbrett aufrecht in einen 60°-Winkel gebracht werden. Diese Schritte sind entscheidend, um sicherzustellen, dass die Säure die distalen Atemwege der linken Lunge erreicht und verhindert den Rückfluss von Säure in die rechte Lunge und Luftröhre, die proximale Verletzungen verursachen kann. Innerhalb von 24 h nach der Instillation ist die Verletzung in der linken Lunge diffus mit ausgedehnten Lungenödemen, die sowohl die distale als auch die proximale linke Lunge betreffen.
Während der Methodenentwicklung bei erwachsenen 8-12 Wochen alten Mäusen führten 2,5 ml/kg intrabronchiale HCl zu erheblichen, aber subletalen akuten Lungenverletzungen; niedrigere Dosen von HCl nicht zu reproduzierbaren und homogenen Lungenverletzungen geführt. Obwohl wir dieses Modell nicht bei jüngeren (z. B. 3-6 Wochen alten) oder älteren Mäusen (z. B. 10-14 Monate alt) durchgeführt haben, gehen wir davon aus, dass eine gewichtsbasierte Dosing von HCl zu einem Phänotyp für Lungenverletzungen führen wird, ähnlich dem, was bei 8-12 Wochen alten Mäusen festgestellt wird. Wir empfehlen den Forschern, HCl-Dosen zu itrieren, um den gewünschten Grad an Lungenverletzungen zu erreichen, bevor sie Experimente mit Mäusen mit extremen Gewichten durchführen.
Dieses selektive Säureinstillationsverfahren bietet ein nicht-tödliches muriniertes Modell für sterile Gewebeentzündungen, das den Bedarf an unterstützender Pflege, wie z. B. mechanischer Beatmung, reduziert. Mit dem verlängerten Überleben verletzter Mäuse hat die säureinduzierte Entzündung genug Zeit, sich selbst zu lösen. Die Auflösungsphase dieses Modells wurde verwendet, um zeitlich regulierte endogene bioaktive Lipidmediatoren, sogenannte spezialisierte Pro-Auflösungsmediatoren (SPMs), wie Lipoxin A4 (LXA4), Maresin 1 (MaR1) und Resolvine 6 zu identifizieren. ,11,12,16. Die Verabreichung von exogenen SPMs an verletzte Mäuse beschleunigt die Auflösung von säureinduzierten Lungenverletzungen, indem entzündliche Mechanismen gedämpft und die Katabasis des verletzten Lungengewebes gefördert wird. Diese SPMs fördern die Clearance von Alveolarenödem12, erhöhen die Efferozytose von apoptotischen Neutrophilen durch rekrutierte Makrophagen16und beschleunigen die Reepithelisierung der Atemwege und Alveolen12, um die Leckagen und Gewebehypoxie. In einem Modell der pathogen-induzierten Lungenverletzung zeigte 15-Epi-Resolvin D1 auch antimikrobielle Maßnahmen durch erhöhte bakterielle Phagozytose durch Makrophagen und verbesserte bakterielle Clearance von der infizierten Lunge16. Die Untersuchung dieser endogene Auflösungsmechanismen gibt Einblick in mögliche neuartige Therapiestrategien für Patienten mit ARDS5.
Um die räumlich-zeitliche Regulierung von Auflösungsmechanismen am besten zu untersuchen, sind in vivo-Experimentelle Modelle erforderlich. Akute Lungenverletzungsmodelle müssen relevante akute Entzündungsreaktionen und Organfunktionsstörungen mit Engagement der Wirtslösung zur Förderung molekularer und zellulärer Prozesse umfassen. Diese Mechanismen können mit hilfe etablierter Abwicklungsindizes22quantifiziert werden. Die selektive intrabronchiale Instillationsmethode zur Erzeugung einseitiger akuter Lungenverletzungen hat sich in dieser Hinsicht für die ersonen endogene Auflösungsmediatoren und -wege als nützlich erwiesen. Zukünftige Studien, die unser Verständnis dieser aktiven Auflösungsprozesse vertiefen, haben das Versprechen, zu therapeutischen Agonisten zu führen, die die Bioaktionen endogener Lipidmediatoren imitieren, um die Auflösung von Entzündungen zu verbessern und die Morbidität zu mildern. sterblichkeit von ARDS und anderen wichtigen Lungenerkrankungen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Joseph Mizgerd für seine Beiträge zur Entwicklung der selektiven intrabronchialen Methode und für seine hilfreichen Kommentare und die Überprüfung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von den Stipendien der National Institutes of Health P01GM095467 (B.D.L.) und K08HL130540 (R.E.A.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Zinc Fixative | BD Biosciences | 552658 | |
| 2-0 Braided Silk Suture | Surgical Specialties | SP118 | |
| 24 G x 3/4" Disposable Safelet I.V. Catheter | Excel | 26751 | |
| 33 mm, 0.22 µm syringe filter unit | Millipore-Sigma | SLGP033RS | |
| 4" Long Serrated Slight Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| 4" Long Tip Serrated Full Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| 4.5 " Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | |
| 6" Crile Wood Needle Holder | Roboz | RS-7860 | |
| 60 mL syringe | BD Biosciences | 309653 | |
| Anti-mouse FITC-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 11-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Anti-mouse PE-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 12-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Bead sterilizer | |||
| Betadine Solution Swabstick | Betadine | 67618-153-01 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | |
| Clear flat-bottomed 96-well microplate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| Dulbeccos's Phosphate Buffered Saline (PBS) without Ca2+ or Mg+ | life technologies | 14190-144 | |
| Electric clippers | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore-Sigma | E6758 | |
| Evans Blue Dye | Millipore-Sigma | E-2129 | |
| Heating pad | |||
| Hydrochloric acid, 37% | Millipore-Sigma | 258148 | |
| Ketamine | Henry-Schein | 56344 | |
| Microplate reader (640, 720 nm) | |||
| P200 Pipette | |||
| P200 Pipette Tips | |||
| pH probe | |||
| Ring stand with extension clamp | |||
| Sterile Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Sterile Mouse Drape 8" x 8" with Oval Adhesive Fenestration | Steris | 88VCSTF | |
| Sterile Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 56890 | |
| Sterile Towl Drape | Dynarex | 4410 | |
| Wax Coated 4-0 Braided Silk Suture | Covidien | SS733 | |
| Xylazine | AKORN | NDC: 59399-111-50 |
References
- Baron, R. M., Levy, B. D., et al. Acute Respiratory Distress Syndrome. Harrison's Principles of Internal Medicine, 20e. Jameson, J. L. , McGraw-Hill Education. (2018).
- Bellani, G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).
- The ARDS Definition Task. Acute Respiratory Distress Syndrome: The Berlin DefinitionThe Berlin Definition of ARDS. The Journal of the American Medical Association. 307 (23), 2526-2533 (2012).
- Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. New England Journal of Medicine. 377 (6), 562-572 (2017).
- Krishnamoorthy, N., Levy, B. D., Walker, K. H., Abdulnour, R. -E. E., Engstrom, B. D. Specialized Proresolving Mediators in Innate and Adaptive Immune Responses in Airway Diseases. Physiological Reviews. 98 (3), 1335-1370 (2018).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Maresin 1 biosynthesis during platelet-neutrophil interactions is organ-protective. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16526 (2014).
- Chen, H., et al. Pulmonary permeability assessed by fluorescent-labeled dextran instilled intranasally into mice with LPS-induced acute lung injury. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. 73 (73), e50062 (2013).
- Eickmeier, O., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 reduces mucosal inflammation and promotes resolution in a murine model of acute lung injury. Mucosal Immunology. 6 (2), 256-266 (2013).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Phospholipase D isoforms differentially regulate leukocyte responses to acute lung injury. Journal of Leukocyte Biology. 103 (5), 919-932 (2018).
- Fukunaga, K., Kohli, P., Bonnans, C., Fredenburgh, L. E., Levy, B. D. Cyclooxygenase 2 Plays a Pivotal Role in the Resolution of Acute Lung Injury. Journal of Immunology. 174 (8), 5033 (2005).
- Colby, J. K., et al. Resolvin D3 and Aspirin-Triggered Resolvin D3 Are Protective for Injured Epithelia. American Journal of Pathology. 186 (7), 1801-1813 (2016).
- Bonnans, C., Fukunaga, K., Keledjian, R., Petasis, N. A., Levy, B. D. Regulation of phosphatidylinositol 3-kinase by polyisoprenyl phosphates in neutrophil-mediated tissue injury. The Journal of Experimental Medicine. 203 (4), 857-863 (2006).
- Mandell, L. A., Niederman, M. S. Aspiration Pneumonia. New England Journal of Medicine. 380 (7), 651-663 (2019).
- Seki, H., et al. The anti-inflammatory and proresolving mediator resolvin E1 protects mice from bacterial pneumonia and acute lung injury. Journal of Immunology. 184 (2), 836-843 (2010).
- Abdulnour, R. E., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 is produced during self-resolving gram-negative bacterial pneumonia and regulates host immune responses for the resolution of lung inflammation. Mucosal Immunology. 9 (5), 1278-1287 (2016).
- Traber, K. E., et al. Myeloid-epithelial cross talk coordinates synthesis of the tissue-protective cytokine leukemia inhibitory factor during pneumonia. American journal of physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 313 (3), L548-L558 (2017).
- Yamamoto, K., et al. Roles of lung epithelium in neutrophil recruitment during pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 253-262 (2014).
- Acute Respiratory Distress Syndrome Network. Ventilation with Lower Tidal Volumes as Compared with Traditional Tidal Volumes for Acute Lung Injury and the Acute Respiratory Distress Syndrome. New England Journal of Medicine. 342 (18), 1301-1308 (2000).
- Peng, X., et al. Inducible nitric oxide synthase contributes to ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 172 (4), 470-479 (2005).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Mechanical stress activates xanthine oxidoreductase through MAP kinase-dependent pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (3), L345-L353 (2006).
- Serhan, C. N., Levy, B. D. Resolvins in inflammation: emergence of the pro-resolving superfamily of mediators. The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2657-2669 (2018).
