Summary
La instilación selectiva de ácido intrabronal en el pulmón izquierdo en ratones da lugar a una lesión pulmonar aguda unilateral y autolimitada que modela el síndrome de dificultad respiratoria aguda humana (ARDS) inducido por la aspiración de ácido gástrico.
Abstract
La instilación intrabronal selectiva del ácido clorhídrico (HCl) al bronquio del tronco principal izquierdo murino causa lesiones agudas del tejido con hallazgos histopatológicos similares al síndrome de dificultad respiratoria aguda humana (ARDS). El edema alveolar resultante, el daño de la barrera alveolar-capilar y la infiltración de leucocitos afectan predominantemente al pulmón izquierdo, preservando el pulmón derecho como un control no lesionado y permitiendo que los animales sobrevivan. Este modelo de lesión pulmonar aguda autolimitada permite la investigación de mecanismos de resolución de tejidos, como la eferocittosis de macrófagos de neutrófilos apoptoticos y la restitución de la integridad de la barrera alveolar-capilar. Este modelo ha ayudado a identificar funciones importantes para los agonistas de resolución, incluidos los mediadores pro-resolución (SEMP) especializados, proporcionando una base para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para los pacientes con SRAS.
Introduction
El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SADe) es una causa importante de insuficiencia respiratoria aguda1. Es una enfermedad común y letal o incapacitante que ocurre en el 10% de todos los pacientes ingresados en unidades de cuidados intensivos en todo el mundo2. Según la definición3de Berlín, el ARDS se define por la aparición aguda de insuficiencia respiratoria hipoxémica (<1 semana) e infiltrados pulmonares bilaterales en radiografías torácicas que no se explican por insuficiencia cardíaca4. La patobiología subyacente se caracteriza por una respuesta inflamatoria excesiva. El pulmón puede lesionarse directamente, como neumonía o con aspiración de ácido gástrico, o indirectamente, como en sepsis o después de múltiples transfusiones de sangre4. Tras el insulto inicial, la patogénesis de la ARDS progresa en tres fases: fases exudativas, proliferativas y fibrosas1. Estas fases se caracterizan por distintos mecanismos moleculares y celulares inmunes y de reparación que determinan el pronóstico para los pacientes con Síndrome de SIS. La atención de apoyo sigue siendo el pilar para los pacientes con SDR; actualmente, no existen tratamientos farmacológicos eficaces para la SADR,por lo que es urgente una nueva investigación sobre esta devastadora condición 4.
La desregulación de la respuesta inmunitaria innata durante la fase exudativa contribuye a la aparición aguda de la sARAS y la insuficiencia respiratoria asociada1. Potente mediador proinflamatorio que orquesta las respuestas inmunitarias iniciales, lo que conduce a la interrupción de la barrera alveolar-capilar, el edema alveolar difuso y la infiltración de neutrófilos en el sitio de la lesión del tejido pulmonar4. En ARDS, las señales de frenado ineficaces para la inflamación aguda predisponen a la insuficiencia pulmonar y pueden retrasar la catabase oportuna del tejido pulmonar lesionado5. Para ello, la investigación preclínica sobre los mecanismos endógenos de iniciación y pro-resolución del SADE puede descubrir nuevas estrategias terapéuticas. Dicha investigación requiere modelos experimentales in vivo autolimitados de lesión pulmonar aguda que se asemejen mucho a las características de la ARDS humana, permitiendo el interrogatorio de los mecanismos subyacentes a las fases de iniciación y resolución de la lesión tisular.
El modelo murino presentado aquí produce una lesión pulmonar aguda directa que demuestra los procesos patobiológicos cardinales de la ARDS exudativa, a saber, la interrupción de la barrera alveolar-capilar e la infiltración de neutrófilos. El método se basa en la instilación intrabronal selectiva de HCl a través de la cannulación del bronquio del tronco principal izquierdo, localizando la lesión y la respuesta inflamatoria al pulmón izquierdo; el pulmón derecho no lesionado se puede utilizar como un control interno para determinaciones selectas de lesión e inflamación tisular. Además, la lesión pulmonar unilateral no es letal y revela un programa de resolución. Esto ofrece una ventana distinta en la resolución de la inflamación pulmonar que se puede aprovechar para la identificación de mediadores endógenos pro-resolución y mecanismos celulares y para abrir nuevas vías terapéuticas para ARDS que enfatiza la fisiología de la resolución y Farmacología.
Protocol
Todos los procedimientos de animales a continuación han sido revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en Brigham and Women's Hospital (Protocolo #2016N000356).
NOTA: Se siguió la técnica estéril para todos los procedimientos de supervivencia. Se estableció un campo estéril para cada cirugía utilizando una toalla de cortina estéril, mientras que los cirujanos llevaban guantes quirúrgicos estériles, gorras, máscaras y abrigos de laboratorio limpios. Todos los instrumentos quirúrgicos fueron esterilizados usando un autoclave, y la esterilidad se mantuvo usando un esterilizador de cuentas.
1. Preparación de 0,1 N HCl
- Añadir 11 ml de ddH2O a una botella de vidrio ámbar. Añadir lentamente 1 ml de 37% de HCl (12 N) para crear un stock de trabajo de 1 N HCl.
PRECAUCION: Asegúrese de que HCl se añade al agua. Esto es un problema de seguridad porque agregar agua directamente al ácido puede hacer que el ácido hierva y saque la botella. Cuando manipule HCl concentrado, asegúrese de que el ácido se mantiene en una campana química ventilada y se usa el equipo de protección personal adecuado, incluyendo capa de laboratorio, guantes y gafas de seguridad. - Añadir lentamente 4 ml de la culata de trabajo HCl previamente diluida en 35 ml de ddH2O en un tubo cónico de 50 ml para crear un stock experimental de 0,1 N HCl.
- Mida el pH del material experimental utilizando una sonda electrónica de pH después de una calibración de dos puntos utilizando soluciones de pH bajo. Valorar a pH 1.1 utilizando soluciones de stock NaOH o HCl según sea necesario para que el volumen final sea de 40 ml.
NOTA: Medir los valores bajos de pH puede ser difícil. Para garantizar una medición precisa, asegúrese de que la sonda de pH esté correctamente calibrada utilizando estándares de pH bajos para evitar la extrapolación excesiva de la medición. - Inmediatamente antes del experimento, filtre 1–2 ml de la población experimental de HCl a través de un filtro estéril de 0,22 m en un tubo de microcentrífuga estéril.
2. Insinsisiación intrabronquial selectiva de HCl
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Preparación del área quirúrgica
- Inducir la anestesia general mediante la entrega de una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) por inyección intraperitoneal. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado apretando suavemente la punta de la cola o del pie trasero. Se requiere falta de respuesta de abstinencia antes de hacer una incisión cutánea. Administrar bolos de anestesia adicionales, si es necesario.
- Entregar 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea bajo el cuello. El analgésico preoperatorio fortalecerá el efecto de la anestesia y aliviará el dolor pre y postoperatorio resultante del procedimiento.
- Utilice cortadoras eléctricas para afeitar suavemente el área quirúrgica en la superficie ventral del ratón, debajo de la barbilla en la región cervical de la garganta, utilizando golpes lentos hacia abajo. Retire el pelaje suelto para exponer completamente la piel subyacente.
- Preparar el área quirúrgica frotando el sitio afeitado con 10% de solución de povidona-yodo. Después de aplicar la solución aséptica, limpie el sitio con un hisopo de alcohol isopropílico del 70%. Repita este paso 3x.
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Aislar la tráquea
- Coloque el ratón en posición supina sobre una tabla quirúrgica limpia y cubra el ratón en una cortina quirúrgica estéril mientras mantiene la exposición del área quirúrgica. Asegure la cortina en su lugar.
- Hacer una incisión longitudinal de 0,5 cm en la piel por encima de la tráquea y las glándulas salivales. Utilice fórceps serrados ligeramente curvados para retirar cuidadosamente la piel y separar suavemente las glándulas salivales para exponer los músculos traqueales.
- Usando fórceps serrados para la disección contundente, aparta suavemente los músculos paratraqueales y se burla de la fascia que rodea la tráquea hasta que los anillos cartilaginosos de la tráquea estén completamente expuestos.
- Utilice fórceps serrados completamente curvados para levantar la tráquea y separar el tejido conectivo entre la retro-tráquea y la retro-fascia. Una vez que el tejido conectivo está separado, la punta de los fórceps debe deslizarse completamente detrás de la tráquea.
- Mantenga los fórceps curvos detrás de la tráquea y agarre una pieza de 10-15 cm de sutura de seda trenzada 4-0 con las puntas de los fórceps. Tire de la sutura detrás de la tráquea para que haya una longitud uniforme a cada lado.
- Una vez que la sutura esté en su lugar, tire suavemente de los lados de la sutura hacia la parte posterior del ratón y mantenga los lados en su lugar.
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Cannulación selectiva del bronquio del tronco principal izquierdo e inculcación de HCl
- Tome un angiocatéter de 24 G x 3/4" e inserte la aguja, biselado hacia arriba, en la región anterior de la tráquea entre el primer y el segundo anillo traqueato. Una vez que la inserción adecuada se confirma mediante la visualización directa de la punta de la aguja en el lumen traqueal, suelte la sutura y avance la cánula sobre la aguja y en la tráquea hasta que se alcance la resistencia, luego retire la aguja. Angulo la dirección de inserción hacia el bronquio del tallo principal izquierdo para la insinstalación selectiva en el pulmónizquierdo.
- Una vez que la cánula esté en su lugar, sujete firmemente el puerto de inyección para evitar que el catéter se desplace.
- Usando una pipeta P200 y puntas estériles de pipeta P200, inundar 2,5 ml/kg (50 ml para un ratón de 20 g) de ratón estéril filtrado 0,1 N HCl en el catéter, seguido de un volumen idéntico de aire.
- Retire rápidamente el catéter y levante la placa quirúrgica a un ángulo de 60o durante 30 s.
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Cierre del área quirúrgica
- Poner la tabla quirúrgica plana y retirar la sutura de detrás de la tráquea.
- Utilice la sutura de seda trenzada recubierta de cera 4-0 para cerrar la incisión de la piel con 2-3 puntos de sutura.
3. Atención postoperatoria
- Una vez cerrada la incisión, coloque el ratón en su lado izquierdo sobre una almohadilla de calentamiento caliente hasta que el ratón se recupere de la anestesia. Comience a monitorear el ratón para el dolor y el nivel de actividad antes de devolverlo a la carcasa normal.
NOTA: La buprenorfina se debe administrar a 0,1 mg/kg por vía subcutánea cada 6-12 h durante las primeras 24 horas. Si hay dolor de ruptura persistente, extienda el régimen analgésico hasta que el dolor disminuya.
4. Lavado broncoalveolar de pulmón entero (BAL) e inmunofenotipado de leucocitos
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Euthanizar el ratón mediante la administración de 3x la dosis de ketamina/xilazina utilizada en el paso 2.1.1.
- Para diferenciar los neutrófilos intersticiales e intravasculares, inyectar por vía intravenosa un anticuerpo Ly6G seleccionado etiquetado como Ly6G 5 minutos antes de la eutanasia. Esta etiqueta debe ser adecuada para la detección por citometría de flujo para distinguir los neutrófilos intravasculares de los neutrófilos pulmonares intersticiales y alveolares, que se etiquetarán durante la preparación del tejido con un fluoróforo diferente (ver más abajo).
- Coloque el ratón sobre una tabla quirúrgica y enganche los incisivos anteriores alrededor de un bucle de sutura de seda trenzada 2-0.
- Siga los pasos 2.2.2–2.2.6. para preparar la tráquea para la cánulation.
NOTA: Asegúrese de que el diafragma no esté perforado para maximizar la presión de inflado trans-alveolar durante el lavado pulmonar; el cumplimiento pulmonar izquierdo disminuye después de la lesión, que puede requerir un mayor requisito de presión transalveolar para el lavado pulmonar. - Canalizar la tráquea siguiendo el paso 2.3.1, pero no avanzar el catéter por debajo de la carina; insertar el catéter paralelo a la tráquea.
- Con el catéter insertado, ate la sutura alrededor de la tráquea para mantener el catéter en su lugar.
- Inculque y retire dos alícuotas consecutivas de 1 ml de PBS helado -/- (sin magnesio ni calcio) con 0,6 mM de EDTA utilizando una jeringa de 1 cc. Para inmunofenotipado mediante citometría de flujo, retire cada alícuota y vuelva a un tubo FACS de poliestireno de 5 ml sobre hielo.
- Para asegurar la eutanasia, realice una toracotomía con tijeras quirúrgicas seguidas de punción cardíaca. Los pulmones se pueden cosechar para su posterior procesamiento.
- Centrifugar el BAL durante 10 min a 800 g a 4 oC para peletizar las células.
- Decantar el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de 2 ml y alícuota en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Conservar a -80oC para su posterior análisis.
- Resuspender el pellet celular en PBS -/- con 2% de FBS para el análisis diferencial de leucocitos por citometría de flujo.
- Para diferenciar los neutrófilos intersticiales e intravasculares, retire el pulmón izquierdo y derecho por separado y procese los pulmones para la citometría de flujo como en Abdulnour et al. 20146.
- Manchar la suspensión celular resultante utilizando anticuerpos FACS seleccionados, asegurándose de manchar Ly6G que se conjuga con un fluoróforo diferente al anticuerpo Ly6G del paso 4.1.1.
5. Evaluación de la permeabilidad de la barrera alveolar utilizando el tinte azul de Evan (EBD)
- Inyectar por vía intravenosa el tinte azul de Evan (40 mg/kg) 30 minutos antes de la eutanasia.
- Eutanasia del ratón con sobredosis de ketamina/xilazina (paso 4.1).
- Para medir la integridad de la barrera alveolar, siga los pasos 4.2–4.9 para la recolección de BAL.
- Transfiera 100 l de BALF a una microplaca de 96 pocillos de fondo transparente, junto con 100 s de estándares EBD duplicados. Utilice PBS -/- como espacio en blanco.
- Utilice un lector de microplacas para medir la absorbancia del BALF a 620 nm y 740 nm. Utilice la absorbancia a 740 nm para corregir la contaminación del heme en las muestras7.
- Para medir la integridad de la barrera vascular, perfundie los pulmones inyectando lentamente 5 ml de PBS helada -/- a través del ventrículo derecho del corazón. Retire el pulmón izquierdo.
- Secar el pulmón izquierdo durante 72 h a 58 oC para eliminar el exceso de agua.
- Procesar el tejido pulmonar seco como en Radu y Chernoff 20138, y medir las absorbancias a 620 nm y 740 nm.
6. Histología pulmonar
- Canine la tráquea siguiendo los pasos 4.1–4.5.
- Para fijar la presión de los pulmones a 20 cm H2O, utilice un soporte de anillo y una abrazadera para elevar una jeringa de 60 ml equipada con tubo controlado por válvula y llena de una solución fijativa selecta (por ejemplo, fijador de zinc) de modo que el menisco de la solución fijativa esté 20 cm por encima de la Pulmones.
- Fije el tubo al catéter y abra el valor. Llene lentamente los pulmones con fijadores hasta que dejen de inflarse.
- Retire el catéter 3/4 de la salida de la tráquea. Ate la tráquea con sutura antes de retirar completamente el catéter para minimizar la pérdida de fijador.
- Retire los pulmones y el corazón en bloque.
NOTA: Asegúrese de que los pulmones no estén perforados durante la extracción para retener el fijador infundido por presión. - Fijar los pulmones durante 24 h en 25 ml de fijador a temperatura ambiente.
- Lave los pulmones fijos durante intervalos secuenciales de 20 minutos en PBS -/-, 30% etanol y 50% etanol.
- Después del último lavado, almacenar los pulmones en 70% etanol para el procesamiento histológico como en Eickmeier et al. 20139.
Representative Results
La instilación selectiva intrabronal de HCl da como resultado una lesión pulmonar aguda unilateral
El método de insinfección intrabronquial selectiva de HCl en el bronquio del tronco principal izquierdo se ilustra en la Figura 1A. La consecuente lesión pulmonar aguda implica todo el pulmón izquierdo, y tras la administración intravenosa de EBD y perfusión pulmonar, la EBD permaneció sólo en el pulmón izquierdo (Figura1B). Se cuantificó la extravasación de EBD en el pulmón izquierdo y se constató que aumentaba significativamente en relación con la inscriplación selectiva falsa (Figura1C;adaptada de Abdulnour et al. 20146). En respuesta a una lesión pulmonar, los leucocitos circulantes se diáparte en el tejido inflamado. En este modelo, los neutrófilos vasculares sufren migración transendotelial hacia el intersticio pulmonar lesionado. Neutrófilos intersticiales acumulados en el pulmón izquierdo 24 h después de la instilación de HCl, en contraste con el pulmón derecho donde se observan pocos neutrófilos intersticiales (Figura1D). Estos resultados indican que el método selectivo de instilación intrabronquial del tronco principal izquierdo dio lugar a una lesión pulmonar aguda murina que se localizó en gran medida en el pulmón izquierdo y produjo cambios patológicos que también se ven con el SADe, incluido el aumento brecha de barrera alveolar-capilar e infiltración de neutrófilos.
La lesión pulmonar aguda unilateral permite la investigación de mecanismos de resolución
Para estudiar la fase de resolución de los ratones con lesión pulmonar aguda inducida por ácido deben ser capaces de sobrevivir al insulto inicial. Distinta de la HCl intratraqueal, la instilación en solo el bronquio del tronco principal izquierdo conduce a una lesión autolimitada con supervivencia uniforme en ratones sanos. Los pulmones se pueden obtener de ratones en los primeros o más tarde en los puntos de tiempo como en la Figura 2A. La histología pulmonar muestra lesión tisular e inflamación a nivel orgánico y celular con inflamación exudativa 24 h después de la lesión caracterizada por edema alveolar marcado e infiltración de neutrófilos en el pulmón izquierdo. Tenga en cuenta que no hay ninguna lesión significativa o afluencia de leucocitos en el pulmón derecho de control no lesionado (Figura2A). 72 h después de lesiones, edema e infiltrados celulares disminuyen sustancialmente, lo que representa una fase exudativa resolutiva. Los neutrófilos alveolares pueden ser monitoreados por citometría de flujo (CD45+/CD68-/F4/80-/Ly6G+/CD11b+) obtenidopor lavado pulmonar entero. Los neutrófilos aumentan en el pulmón izquierdo 24 h después de la lesión inicial y disminuyen sustancialmente a 48 y 72 h (Figura2B). Si se investigan los puntos de tiempo posteriores, los números de neutrófilos volverán a la línea de base y se pueden estudiar los mecanismos en fases posteriores de catabasis, como las respuestas fibroproliferativas.
Figura 1: La instilación selectiva intrabronal de HCl produce una lesión pulmonar unilateral definida por la violación de la barrera alveolar y la infiltración de neutrófilos. (A) Representación de la cannulación del bronquio del tronco principal izquierdo murino para la instilación selectiva de HCl en el pulmón izquierdo. (B) Pulmones rectos derecho (RL) e izquierdos (LL) expuestos a la instilación selectiva de ácidos y perfundidos tras el tinte azul de Evan intravenoso. (C) Cuantificación del tinte azul intersticial de Evan a partir de pulmón homogeneizado y perfundido 24 h después de una lesión ácida o control falso; figura adaptada de Abdulnour et al. 20146. Los valores representan la media de sem, donde n a 5. *p < 0.05, Mann-Whitney U Test. (D) Citometría de flujo representativa de intravascular (I.V.; fluoróforo 1) e intersticial (I.S.; fluoróforo 2) neutrófilos como porcentaje del total de CD45+ células en el pulmón procesado 24 h después de una lesión ácida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La lesión pulmonar aguda unilateral se autoresolven. (A) Histología representativa H&E (10x) de los pulmones izquierdos obtenidos de ratones ingenuos (0 h) o ratones 24, 48, 72 h después de la lesión, junto con el pulmón derecho asociado del mismo ratón (Barra de escala de 250 m). (B) Citometría de flujo representativa de neutrófilos alveolares (Ly6G+ CD11b+) obtenida del lavado pulmonar entero como porcentaje del total de CD45+ células en ratones o ratones ingenuos (0 h) 24, 48 y 72 h después de una lesión ácida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El método de instilación intrabronal descrito aquí utiliza la cannulación selectiva del bronquio del tronco principal izquierdo para inculcar HCl en el pulmón izquierdo, lo que resulta en una lesión pulmonar aguda murina unilateral y autolimitada. Este modelo de lesión pulmonar de ácido murino representa de cerca la respuesta inflamatoria, histopatología y disfunción fisiológica que se observa en el ARDS humano, donde la aspiración de ácido gástrico es un factor precipitante o factorcontribuyente 4común. La exposición de las vías respiratorias murinas a un PCl de bajo pH da como resultado una mayor permeabilidad de la barrera alveolar-capilar, edema alveolar e infiltración profunda de neutrófilos en el lugar de la lesión. Estos eventos no se observan en el pulmón derecho no lesionado. Además, este modelo produce respuestas inflamatorias rápidas que alcanzan su punto máximo dentro de las 24 horas después de la instilación ácida, y comparte cambios en la expresión génica con ARDS humano, como la expresión diferencial de la fosfolipasa D isoforma10.
Aunque este modelo preclínico murino reproduce muchas de las características de ardo a nivel molecular, celular y tisular, no recapitula completamente el ARDS humano. La definición de ARDS incluye la afectación pulmonar bilateral3, mientras que el método de inscripción descrito aquí resulta por diseño en enfermedad pulmonar unilateral. Además, los animales no requieren ventilación mecánica continua, inmovilidad o sedación parenteral. Los resultados presentados aquí (vide supra) y otros lugares6,9,11,12,13 demuestran que la lesión pulmonar unilateral inducida por ácido reproduce la mayoría de las señas de identidad patológicas de ARDS al tiempo que proporciona la oportunidad única de utilizar el pulmón derecho como control interno y para estudiar la fase de resolución de esta enfermedad. Como tal, el modelo discutido aquí modela la patobiología ARDS, pero también permite la investigación mecanicista de las respuestas fundamentales del tejido pulmonar a las lesiones y los mecanismos de resolución que pueden ser relevantes para abordar esta importante enfermedad.
La instilación de HCl representa una lesión pulmonar aguda directa, por lo que está modelando aspectos de la fisiopatología asociada con la neumonitis por aspiración. Además, el insulto pulmonar izquierdo inicial en este modelo se genera utilizando HCl estéril en lugar de contenido gástrico cargado de bacterias visto en algunos eventos de aspiración humana que también pueden conducir a neumonía14. En los seres humanos, la aspiración de bacterias patógenas puede dar lugar a neumonía bacteriana secundaria que exacerba la respuesta inflamatoria aguda, prolongando la lesión pulmonar inicial y aumentando la susceptibilidad del paciente para desarrollar ARDS14. Esta posible limitación ha sido abordada por los investigadores que inculcaron deliberadamente bacterias patógenas Escherichia coli (E. coli)15 después de HCl estéril, este método se ha utilizado para investigar inflamación; La neumonía bacteriana unilateral puede ser inducida por la instilización selectiva del pulmón izquierdo de bacterias, como E. coli16,17, Pseudomonas aeruginosa16, y Streptococcus pneumoniae18 . El modelo de lesión pulmonar aguda autolimitada descrito aquí también se puede utilizar para estudiar la lesión pulmonar inducida por el ventilador (VILI), una causa importante de aumento de la mortalidad en el ARDShumano 19. Los modelos animales experimentales de VILI suelen implicar ventilación mecánica en ratones ingenuos con volúmenes de marea que son mucho más altos que lo que se utiliza clínicamente para causar lesiones pulmonares (>15 ml/kg; ver trabajos anteriores20,21). Hacia un modelo más relevante clínicamente de VILI, la instilación de ácido intrabronal como se describe aquí puede utilizarse primero para inducir lesiones pulmonares no letales seguidas de ventilación mecánica en volúmenes de marea dentro del rango clínico (6-12 ml/kg). Este modelo hipotético animal puede permitir a los investigadores estudiar el VILI de una manera clínicamente relevante una vez desarrollado y validado. Juntos, estos modelos murinos destacan la versatilidad del método selectivo de instilación intrabronquial para generar insultos pulmonares unilaterales que se asemejan mucho a patologías asociadas con enfermedades pulmonares humanas.
Además de permitir la instilación selectiva de varios agentes nocivos en el pulmón izquierdo, la técnica de instilación intrabronal después de la traqueotomía no requiere entrenamiento prolongado, tiempo de procedimiento prolongado o equipo complejo, y en manos experimentadas causa una angustia mínima a los animales. A pesar de esto, pueden ocurrir varios problemas durante el procedimiento selectivo de instilación de HCl que pueden afectar los resultados experimentales. La cannulación inadecuada del bronquio del tallo principal izquierdo puede dar lugar a una lesión pulmonar bilateral que disminuye la supervivencia de ratones experimentales y confunde el uso del pulmón derecho como un control interno no lesionado. Esto se puede evitar mediante la pesca del catéter lo suficiente hacia el pulmón izquierdo durante la cannulación hasta que se alcance la resistencia. Después de la inyección de HCl, se debe inyectar un bolo de aire, extraer rápidamente el catéter y llevar la placa quirúrgica en posición vertical a un ángulo de 60o. Estos pasos son cruciales para asegurar que el ácido llegue a las vías respiratorias distales del pulmón izquierdo y previene el reflujo de ácido en el pulmón derecho y la tráquea, que puede causar lesiones proximales. Dentro de las 24 h después de la instilación, la lesión en el pulmón izquierdo es difusa con un edema pulmonar extenso, que afecta tanto al pulmón izquierdo distal como proximal.
Durante el desarrollo del método en ratones adultos adultos de 8-12 semanas de edad, 2,5 ml/kg de HCl intrabronal produjo una lesión pulmonar aguda sustancial pero subletal; dosis más bajas de HCl no dieron lugar a lesiones pulmonares reproducibles y homogéneas. Aunque no hemos realizado este modelo en ratones más jóvenes (por ejemplo, de 3-6 semanas de edad) o mayores (por ejemplo, 10-14 meses de edad), anticipamos que la dosificación basada en el peso de HCl dará lugar a una lesión pulmonar fenotipo similar a lo que se observa en ratones de 8-12 semanas de edad. Recomendamos que los investigadores valoren las dosis de HCl para lograr el grado deseado de lesión pulmonar antes de realizar experimentos con ratones en extremos de peso.
Este procedimiento selectivo de instilación ácida ofrece un modelo murino no letal de inflamación del tejido estéril que reduce la necesidad de cuidados de apoyo, como la ventilación mecánica. Con la supervivencia prolongada de los ratones lesionados, la inflamación inducida por ácido stiene suficiente tiempo para resolverse. La fase de resolución de este modelo se ha utilizado para identificar mediadores de lípidos bioactivos endógenos regulados temporalmente, llamados mediadores pro-resolución (SPR) especializados, como lipoxina A4 (LXA4),decolora 1 (MaR1) y resolvins6 ,11,12,16. La administración de EMM exógenas a ratones lesionados acelera la resolución de lesiones pulmonares inducidas por ácido al amortiguar los mecanismos inflamatorios y promover la catabase del tejido pulmonar lesionado. Estos EPYME promueven el aclaramiento del edema alveolar12, aumentan la eferocytosis de los neutrófilos apoptóticos por macrófagos reclutados16, y aceleran la reepitelización de las vías respiratorias y alvéolos12 para reducir la vascular fugas e hipoxia tisular. En un modelo de lesión pulmonar inducida por patógenos, 15-epi-resolución D1 también exhibió acciones antimicrobianas a través del aumento de la fagocitosis bacteriana por macrófagos y el aclaramiento bacteriano mejorado del pulmón infectado16. La investigación de estos mecanismos de resolución endógenas proporciona información sobre posibles estrategias terapéuticas novedosas para pacientes con ARDS5.
Para estudiar mejor la regulación espaciotemporal de los mecanismos de resolución, se necesitan modelos experimentales in vivo. Los modelos de lesiones pulmonares agudas deben incluir respuestas inflamatorias agudas relevantes y disfunción orgánica con compromiso de resolución del huésped que promueva procesos moleculares y celulares. Estos mecanismos pueden cuantificarse utilizando los índicesderesolución 22 establecidos. El método selectivo de instilación intrabronal para generar lesiones pulmonares agudas unilaterales ha demostrado ser útil a este respecto para sondear mediadores y vías de resolución endógena. Estudios futuros que profundizan nuestra comprensión de estos procesos de resolución activa tienen la promesa de conducir a agonistas terapéuticos que imitan las bioacciones de los mediadores lipídicos endógenos para mejorar la resolución de la inflamación y mitigar la morbilidad mortalidad por sades y otras enfermedades pulmonares importantes.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores quieren agradecer al Dr. Joseph Mizgerd sus contribuciones al desarrollo del método selectivo intrabronquial y por sus comentarios útiles y revisión del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones P01GM095467 (B.D.L.) y K08HL130540 (R.E.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Zinc Fixative | BD Biosciences | 552658 | |
| 2-0 Braided Silk Suture | Surgical Specialties | SP118 | |
| 24 G x 3/4" Disposable Safelet I.V. Catheter | Excel | 26751 | |
| 33 mm, 0.22 µm syringe filter unit | Millipore-Sigma | SLGP033RS | |
| 4" Long Serrated Slight Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| 4" Long Tip Serrated Full Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| 4.5 " Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | |
| 6" Crile Wood Needle Holder | Roboz | RS-7860 | |
| 60 mL syringe | BD Biosciences | 309653 | |
| Anti-mouse FITC-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 11-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Anti-mouse PE-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 12-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Bead sterilizer | |||
| Betadine Solution Swabstick | Betadine | 67618-153-01 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | |
| Clear flat-bottomed 96-well microplate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| Dulbeccos's Phosphate Buffered Saline (PBS) without Ca2+ or Mg+ | life technologies | 14190-144 | |
| Electric clippers | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore-Sigma | E6758 | |
| Evans Blue Dye | Millipore-Sigma | E-2129 | |
| Heating pad | |||
| Hydrochloric acid, 37% | Millipore-Sigma | 258148 | |
| Ketamine | Henry-Schein | 56344 | |
| Microplate reader (640, 720 nm) | |||
| P200 Pipette | |||
| P200 Pipette Tips | |||
| pH probe | |||
| Ring stand with extension clamp | |||
| Sterile Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Sterile Mouse Drape 8" x 8" with Oval Adhesive Fenestration | Steris | 88VCSTF | |
| Sterile Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 56890 | |
| Sterile Towl Drape | Dynarex | 4410 | |
| Wax Coated 4-0 Braided Silk Suture | Covidien | SS733 | |
| Xylazine | AKORN | NDC: 59399-111-50 |
References
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