La instilación selectiva de ácido intrabronal en el pulmón izquierdo en ratones da lugar a una lesión pulmonar aguda unilateral y autolimitada que modela el síndrome de dificultad respiratoria aguda humana (ARDS) inducido por la aspiración de ácido gástrico.
La instilación intrabronal selectiva del ácido clorhídrico (HCl) al bronquio del tronco principal izquierdo murino causa lesiones agudas del tejido con hallazgos histopatológicos similares al síndrome de dificultad respiratoria aguda humana (ARDS). El edema alveolar resultante, el daño de la barrera alveolar-capilar y la infiltración de leucocitos afectan predominantemente al pulmón izquierdo, preservando el pulmón derecho como un control no lesionado y permitiendo que los animales sobrevivan. Este modelo de lesión pulmonar aguda autolimitada permite la investigación de mecanismos de resolución de tejidos, como la eferocittosis de macrófagos de neutrófilos apoptoticos y la restitución de la integridad de la barrera alveolar-capilar. Este modelo ha ayudado a identificar funciones importantes para los agonistas de resolución, incluidos los mediadores pro-resolución (SEMP) especializados, proporcionando una base para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para los pacientes con SRAS.
El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SADe) es una causa importante de insuficiencia respiratoria aguda1. Es una enfermedad común y letal o incapacitante que ocurre en el 10% de todos los pacientes ingresados en unidades de cuidados intensivos en todo el mundo2. Según la definición3de Berlín, el ARDS se define por la aparición aguda de insuficiencia respiratoria hipoxémica (<1 semana) e infiltrados pulmonares bilaterales en radiografías torácicas que no se explican por insuficiencia cardíaca4. La patobiología subyacente se caracteriza por una respuesta inflamatoria excesiva. El pulmón puede lesionarse directamente, como neumonía o con aspiración de ácido gástrico, o indirectamente, como en sepsis o después de múltiples transfusiones de sangre4. Tras el insulto inicial, la patogénesis de la ARDS progresa en tres fases: fases exudativas, proliferativas y fibrosas1. Estas fases se caracterizan por distintos mecanismos moleculares y celulares inmunes y de reparación que determinan el pronóstico para los pacientes con Síndrome de SIS. La atención de apoyo sigue siendo el pilar para los pacientes con SDR; actualmente, no existen tratamientos farmacológicos eficaces para la SADR,por lo que es urgente una nueva investigación sobre esta devastadora condición 4.
La desregulación de la respuesta inmunitaria innata durante la fase exudativa contribuye a la aparición aguda de la sARAS y la insuficiencia respiratoria asociada1. Potente mediador proinflamatorio que orquesta las respuestas inmunitarias iniciales, lo que conduce a la interrupción de la barrera alveolar-capilar, el edema alveolar difuso y la infiltración de neutrófilos en el sitio de la lesión del tejido pulmonar4. En ARDS, las señales de frenado ineficaces para la inflamación aguda predisponen a la insuficiencia pulmonar y pueden retrasar la catabase oportuna del tejido pulmonar lesionado5. Para ello, la investigación preclínica sobre los mecanismos endógenos de iniciación y pro-resolución del SADE puede descubrir nuevas estrategias terapéuticas. Dicha investigación requiere modelos experimentales in vivo autolimitados de lesión pulmonar aguda que se asemejen mucho a las características de la ARDS humana, permitiendo el interrogatorio de los mecanismos subyacentes a las fases de iniciación y resolución de la lesión tisular.
El modelo murino presentado aquí produce una lesión pulmonar aguda directa que demuestra los procesos patobiológicos cardinales de la ARDS exudativa, a saber, la interrupción de la barrera alveolar-capilar e la infiltración de neutrófilos. El método se basa en la instilación intrabronal selectiva de HCl a través de la cannulación del bronquio del tronco principal izquierdo, localizando la lesión y la respuesta inflamatoria al pulmón izquierdo; el pulmón derecho no lesionado se puede utilizar como un control interno para determinaciones selectas de lesión e inflamación tisular. Además, la lesión pulmonar unilateral no es letal y revela un programa de resolución. Esto ofrece una ventana distinta en la resolución de la inflamación pulmonar que se puede aprovechar para la identificación de mediadores endógenos pro-resolución y mecanismos celulares y para abrir nuevas vías terapéuticas para ARDS que enfatiza la fisiología de la resolución y Farmacología.
El método de instilación intrabronal descrito aquí utiliza la cannulación selectiva del bronquio del tronco principal izquierdo para inculcar HCl en el pulmón izquierdo, lo que resulta en una lesión pulmonar aguda murina unilateral y autolimitada. Este modelo de lesión pulmonar de ácido murino representa de cerca la respuesta inflamatoria, histopatología y disfunción fisiológica que se observa en el ARDS humano, donde la aspiración de ácido gástrico es un factor precipitante o factorcontribuyente 4común. La exposición de las vías respiratorias murinas a un PCl de bajo pH da como resultado una mayor permeabilidad de la barrera alveolar-capilar, edema alveolar e infiltración profunda de neutrófilos en el lugar de la lesión. Estos eventos no se observan en el pulmón derecho no lesionado. Además, este modelo produce respuestas inflamatorias rápidas que alcanzan su punto máximo dentro de las 24 horas después de la instilación ácida, y comparte cambios en la expresión génica con ARDS humano, como la expresión diferencial de la fosfolipasa D isoforma10.
Aunque este modelo preclínico murino reproduce muchas de las características de ardo a nivel molecular, celular y tisular, no recapitula completamente el ARDS humano. La definición de ARDS incluye la afectación pulmonar bilateral3, mientras que el método de inscripción descrito aquí resulta por diseño en enfermedad pulmonar unilateral. Además, los animales no requieren ventilación mecánica continua, inmovilidad o sedación parenteral. Los resultados presentados aquí (vide supra) y otros lugares6,9,11,12,13 demuestran que la lesión pulmonar unilateral inducida por ácido reproduce la mayoría de las señas de identidad patológicas de ARDS al tiempo que proporciona la oportunidad única de utilizar el pulmón derecho como control interno y para estudiar la fase de resolución de esta enfermedad. Como tal, el modelo discutido aquí modela la patobiología ARDS, pero también permite la investigación mecanicista de las respuestas fundamentales del tejido pulmonar a las lesiones y los mecanismos de resolución que pueden ser relevantes para abordar esta importante enfermedad.
La instilación de HCl representa una lesión pulmonar aguda directa, por lo que está modelando aspectos de la fisiopatología asociada con la neumonitis por aspiración. Además, el insulto pulmonar izquierdo inicial en este modelo se genera utilizando HCl estéril en lugar de contenido gástrico cargado de bacterias visto en algunos eventos de aspiración humana que también pueden conducir a neumonía14. En los seres humanos, la aspiración de bacterias patógenas puede dar lugar a neumonía bacteriana secundaria que exacerba la respuesta inflamatoria aguda, prolongando la lesión pulmonar inicial y aumentando la susceptibilidad del paciente para desarrollar ARDS14. Esta posible limitación ha sido abordada por los investigadores que inculcaron deliberadamente bacterias patógenas Escherichia coli (E. coli)15 después de HCl estéril, este método se ha utilizado para investigar inflamación; La neumonía bacteriana unilateral puede ser inducida por la instilización selectiva del pulmón izquierdo de bacterias, como E. coli16,17, Pseudomonas aeruginosa16, y Streptococcus pneumoniae18 . El modelo de lesión pulmonar aguda autolimitada descrito aquí también se puede utilizar para estudiar la lesión pulmonar inducida por el ventilador (VILI), una causa importante de aumento de la mortalidad en el ARDShumano 19. Los modelos animales experimentales de VILI suelen implicar ventilación mecánica en ratones ingenuos con volúmenes de marea que son mucho más altos que lo que se utiliza clínicamente para causar lesiones pulmonares (>15 ml/kg; ver trabajos anteriores20,21). Hacia un modelo más relevante clínicamente de VILI, la instilación de ácido intrabronal como se describe aquí puede utilizarse primero para inducir lesiones pulmonares no letales seguidas de ventilación mecánica en volúmenes de marea dentro del rango clínico (6-12 ml/kg). Este modelo hipotético animal puede permitir a los investigadores estudiar el VILI de una manera clínicamente relevante una vez desarrollado y validado. Juntos, estos modelos murinos destacan la versatilidad del método selectivo de instilación intrabronquial para generar insultos pulmonares unilaterales que se asemejan mucho a patologías asociadas con enfermedades pulmonares humanas.
Además de permitir la instilación selectiva de varios agentes nocivos en el pulmón izquierdo, la técnica de instilación intrabronal después de la traqueotomía no requiere entrenamiento prolongado, tiempo de procedimiento prolongado o equipo complejo, y en manos experimentadas causa una angustia mínima a los animales. A pesar de esto, pueden ocurrir varios problemas durante el procedimiento selectivo de instilación de HCl que pueden afectar los resultados experimentales. La cannulación inadecuada del bronquio del tallo principal izquierdo puede dar lugar a una lesión pulmonar bilateral que disminuye la supervivencia de ratones experimentales y confunde el uso del pulmón derecho como un control interno no lesionado. Esto se puede evitar mediante la pesca del catéter lo suficiente hacia el pulmón izquierdo durante la cannulación hasta que se alcance la resistencia. Después de la inyección de HCl, se debe inyectar un bolo de aire, extraer rápidamente el catéter y llevar la placa quirúrgica en posición vertical a un ángulo de 60o. Estos pasos son cruciales para asegurar que el ácido llegue a las vías respiratorias distales del pulmón izquierdo y previene el reflujo de ácido en el pulmón derecho y la tráquea, que puede causar lesiones proximales. Dentro de las 24 h después de la instilación, la lesión en el pulmón izquierdo es difusa con un edema pulmonar extenso, que afecta tanto al pulmón izquierdo distal como proximal.
Durante el desarrollo del método en ratones adultos adultos de 8-12 semanas de edad, 2,5 ml/kg de HCl intrabronal produjo una lesión pulmonar aguda sustancial pero subletal; dosis más bajas de HCl no dieron lugar a lesiones pulmonares reproducibles y homogéneas. Aunque no hemos realizado este modelo en ratones más jóvenes (por ejemplo, de 3-6 semanas de edad) o mayores (por ejemplo, 10-14 meses de edad), anticipamos que la dosificación basada en el peso de HCl dará lugar a una lesión pulmonar fenotipo similar a lo que se observa en ratones de 8-12 semanas de edad. Recomendamos que los investigadores valoren las dosis de HCl para lograr el grado deseado de lesión pulmonar antes de realizar experimentos con ratones en extremos de peso.
Este procedimiento selectivo de instilación ácida ofrece un modelo murino no letal de inflamación del tejido estéril que reduce la necesidad de cuidados de apoyo, como la ventilación mecánica. Con la supervivencia prolongada de los ratones lesionados, la inflamación inducida por ácido stiene suficiente tiempo para resolverse. La fase de resolución de este modelo se ha utilizado para identificar mediadores de lípidos bioactivos endógenos regulados temporalmente, llamados mediadores pro-resolución (SPR) especializados, como lipoxina A4 (LXA4),decolora 1 (MaR1) y resolvins6 ,11,12,16. La administración de EMM exógenas a ratones lesionados acelera la resolución de lesiones pulmonares inducidas por ácido al amortiguar los mecanismos inflamatorios y promover la catabase del tejido pulmonar lesionado. Estos EPYME promueven el aclaramiento del edema alveolar12, aumentan la eferocytosis de los neutrófilos apoptóticos por macrófagos reclutados16, y aceleran la reepitelización de las vías respiratorias y alvéolos12 para reducir la vascular fugas e hipoxia tisular. En un modelo de lesión pulmonar inducida por patógenos, 15-epi-resolución D1 también exhibió acciones antimicrobianas a través del aumento de la fagocitosis bacteriana por macrófagos y el aclaramiento bacteriano mejorado del pulmón infectado16. La investigación de estos mecanismos de resolución endógenas proporciona información sobre posibles estrategias terapéuticas novedosas para pacientes con ARDS5.
Para estudiar mejor la regulación espaciotemporal de los mecanismos de resolución, se necesitan modelos experimentales in vivo. Los modelos de lesiones pulmonares agudas deben incluir respuestas inflamatorias agudas relevantes y disfunción orgánica con compromiso de resolución del huésped que promueva procesos moleculares y celulares. Estos mecanismos pueden cuantificarse utilizando los índicesderesolución 22 establecidos. El método selectivo de instilación intrabronal para generar lesiones pulmonares agudas unilaterales ha demostrado ser útil a este respecto para sondear mediadores y vías de resolución endógena. Estudios futuros que profundizan nuestra comprensión de estos procesos de resolución activa tienen la promesa de conducir a agonistas terapéuticos que imitan las bioacciones de los mediadores lipídicos endógenos para mejorar la resolución de la inflamación y mitigar la morbilidad mortalidad por sades y otras enfermedades pulmonares importantes.
The authors have nothing to disclose.
Los autores quieren agradecer al Dr. Joseph Mizgerd sus contribuciones al desarrollo del método selectivo intrabronquial y por sus comentarios útiles y revisión del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones P01GM095467 (B.D.L.) y K08HL130540 (R.E.A.).
10x Zinc Fixative | BD Biosciences | 552658 | |
2-0 Braided Silk Suture | Surgical Specialties | SP118 | |
24G x 3/4" Disposable Safelet I.V. Catheter | Excel | 26751 | |
33 mm, 0.22 µm syringe filter unit | Millipore-Sigma | SLGP033RS | |
4" Long Serrated Slight Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5135 | |
4" Long Tip Serrated Full Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5137 | |
4.5 " Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | |
6" Crile Wood Needle Holder | Roboz | RS-7860 | |
60 mL syringe | BD Biosciences | 309653 | |
Anti-mouse FITC-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 11-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
Anti-mouse PE-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 12-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
Bead sterilizer | |||
Betadine Solution Swabstick | Betadine | 67618-153-01 | |
Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | |
Clear flat-bottomed 96-well microplate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
Dulbeccos's Phosphate Buffered Saline (PBS) without Ca2+ or Mg+ | life technologies | 14190-144 | |
Electric clippers | |||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore-Sigma | E6758 | |
Evans Blue Dye | Millipore-Sigma | E-2129 | |
Heating pad | |||
Hydrochloric acid, 37% | Millipore-Sigma | 258148 | |
Ketamine | Henry-Schein | 56344 | |
Microplate reader (640, 720 nm) | |||
P200 Pipette | |||
P200 Pipette Tips | |||
pH probe | |||
Ring stand with extension clamp | |||
Sterile Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 22-363-750 | |
Sterile Mouse Drape 8" x 8" with Oval Adhesive Fenestration | Steris | 88VCSTF | |
Sterile Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 56890 | |
Sterile Towl Drape | Dynarex | 4410 | |
Wax Coated 4-0 Braided Silk Suture | Covidien | SS733 | |
Xylazine | AKORN | NDC: 59399-111-50 |