Summary
Här presenterar vi ett mekanisbaserat protokoll för att störa gap Junction Connexin 43 och mäta den efterföljande påverkan detta har på endotelial biomekanik genom observation av Tractions och intercellulära spänningar.
Abstract
Endotelceller har etablerats för att generera intercellulära spänningar och Tractions, men roll gapet korsningar spela i endotelceller intercellulära stress och Traction generation är för närvarande okänd. Därför presenterar vi här ett mekaniskbaserat protokoll för att söka påverkan av gap Junction Connexin 43 (Cx43) har på endotelceller biomekanik genom att exponera konfluenta endotelceller enskiktslager till en känd Cx43 hämmare 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) och mäta effekten denna hämmare har på Tractions och intercellulära spänningar. Vi presenterar representativa resultat, som visar en minskning av både Tractions och intercellulära spänningar under en hög Chalkon dosering (2 μg/ml) jämfört med kontroll. Detta protokoll kan tillämpas på inte bara Cx43, men även andra gap korsningar också, förutsatt att lämplig hämmare används. Vi tror att detta protokoll kommer att vara användbart inom områdena kardiovaskulär och mechanobiologi forskning.
Introduction
Det fält som hänvisar till studiet av effekterna av fysikaliska krafter och av mekaniska egenskaper på cellulär och vävnadfysiologi och patologi kallas Mekanobiologi1. Några användbara tekniker som har utnyttjats i Mekanobiologi är enskiktslager stressmikroskopi och dragkraft mikroskopi. Traction Force mikroskopi möjliggör beräkning av Tractions genereras vid cell-substrat gränssnitt, medan enskiktslager stress mikroskopi möjliggör beräkning av intercellulära påfrestningar som genereras mellan angränsande celler i ett enskiktslager2 ,3,4,5,6. Resultat som framkommit från tidigare metoder har föreslagit att cell-härledda mekaniska spänningar spelar en avgörande roll för att fastställa ödet för en mängd cellulära processer3,4,5. Till exempel, vid exponering för en extern mekanisk kraft, en grupp av celler som migrerar som ett kollektiv kan förändra deras morfologi och polarisera deras form för att anpassa och migrera längs riktningen av tillämpad kraft genom att delvis generera Tractions7, 8. Tractions ger ett mått som kan användas för att utvärdera cell kontraktilitet och beräknas med hjälp av dragkraft mikroskopi (TFM). Traction Force mikroskopi (TFM) börjar med bestämning av cell-inducerad substrat deformationer följt av beräkningen av dragkraft fältet med hjälp av en matematiskt rigorös, mekanik-baserade beräkningsmetoder. Eftersom förmågan att beräkna Tractions har funnits under ganska lång tid, forskare har utnyttjat TFM att avslöja effekterna Tractions har på en mängd processer, inklusive cancer9, sårläkning10 och bedömning av konstruerade hjärt vävnad11.
Genomförandet av TFM och MSM tillsammans kan delas in i tre viktiga steg som måste utföras i följande ordning: för det första bestäms de hydrogel-deformationer som produceras av cellerna. andra, Tractions återvinns från hydrogel deformationer; och för det tredje, en finita element metod används för att beräkna normala och skjuvning intercellulära påfrestningar inom hela monolayer. För att beräkna gel förskjutningar, fluorescens pärla bilder med celler jämfördes med referens pärla bilden (utan celler) med hjälp av en skräddarsydd partikel bild Velocimetry (PIV) rutin. Kors korrelations fönstrets storlek och överlappning för PIV-analys valdes till 32 x 32 pixlar respektive 0,5. Vid denna tid, pixel förskjutningar omvandlades till mikrometer genom att multiplicera med en pixel-till-micron omvandlingsfaktor (för vårt Mikroskop, denna omvandlingsfaktor är 0,65) för att få in-plane förskjutningar. Fel i samband med ignorera out-of-Plane förskjutningar är försumbar12,13. Efter uträkning av gel förskjutningar, finns det två typer av dragkrafts mätningar som kan utnyttjas, begränsade Tractions och oinskränkt Tractions8,14. Oinskränkt Tractions ger dragkraft fältet för hela synfält (inklusive regioner med och utan celler), medan begränsade Tractions ger dragkraft fältet endast för regioner som innehåller celler14. Sedan, intercellulära påfrestningar beräknas med hjälp av enskiktslager stress mikroskopi (MSM), som är en förlängning av dragkraft mikroskopi. Genomförandet av MSM bygger på antagandet att lokala Tractions utövas av en enskiktslager av celler vid cell-substrat gränssnitt måste balanseras av mekaniska krafter överförs mellan celler vid cell-cell-gränssnittet som krävs av Newtons lagar7 ,12,13. Ett avgörande antagande här är att cellen enskiktslager kan behandlas som ett tunt elastiskt ark eftersom dragkraft distributionen i enskiktslager är känd och kraften balansen inte beror på cell materialegenskaper. En annan viktig förutsättning är att drag krafterna balanseras av lokala intercellulära påfrestningar inom det optiska synfält (inom monolayer) och påverkan av denna kraftbalansen är minimal i distala regionen (utanför monolayer)13. Därför är de gräns förhållanden som definieras av intercellulära spänningar, förskjutningar eller en kombination av båda vid enskiktslager gränsen avgörande för att utföra MSM13. Med hänsyn till ovanstående information, vi använder MSM för att utföra en finita element analys (FEM) för att återvinna den maximala huvudsakliga stressen (σMax) och minsta huvudsakliga stress (σmin) genom att rotera stress planet vid varje punkt i enskiktslager. Dessa huvudsakliga spänningar används därefter för att beräkna den 2D genomsnittliga normala intercellulära spänningen [(σMax + σmin)/2] och 2D maximal skjuvning intercellulära spänning [(σMax -σmin)/2] inom den hela enskiktslager 12,13. Denna procedur beskrivs mer detaljerat av tambe et al.12,13
Enskiktslager stress mikroskopi (MSM) möjliggör beräkning av cell-cell intercellulära påfrestningar som genereras inom ett enskiktslager6,7,8,12,13. Dessa intercellulära spänningar har föreslagits vara viktigt för vävnad tillväxt och reparation, sårläkning, och cancermetastaser12,15,16,17. Dessutom, intercellulära spänningar har föreslagits att också vara viktiga i endotelceller cell migration och endotelceller barriärfunktion17,18. Medan cell-cell korsningar såsom snäva korsningar och anhängare korsningar har båda föreslagits för att spela en kritisk roll i endotelceller intercellulära stress generation och transmission, den roll som gap korsningar förblir svårfångade. Gap korsningar fysiskt ansluta angränsande celler och ge en väg för elektrisk ström och molekyler (< 1 kDa) att passera mellan angränsande celler19,20,21. Även endotelceller uttrycka Cx37, Cx40, och Cx43 gap korsningar19,22, Cx43 är utan tvekan den viktigaste när det gäller sjukdomsprogression23. Bevis på Cx43's betydelse kan hittas i det faktum att genetisk radering av Cx43 hos möss resulterar i hypotoni24 och har negativa effekter på angiogenes25. Dessutom har Cx43 dokumenterats för att vara viktigt för cell migration och proliferation och i utvecklingen av åderförkalkning18,22,23,24,25 .
I detta protokoll använde vi TFM och MSM för att undersöka om dragkraft och intercellulära spännings generering inom det konflytande, endoteliala enskiktslager skulle påverkas av störningen av endotelceller gap Junction Cx43. Vi störde Cx43 med 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), en molekyl som dokumenterats för att hämma Cx43 uttryck26. Chalkon användes för att störa Cx43 istället för siRNA eftersom Chalkon tidigare har rapporterats av Lee et al. för att störa Cx43 Expression26. Dessutom var vi särskilt intresserade av chalcone inflytande på endotelet eftersom det har också rapporterats vara en anti-inflammatorisk och trombocythämmande förening som potentiellt kan användas för att förebygga och behandla olika vaskulära patologier26. Chalcone behandlingar utfördes en timme efter försöket debut, chalcone-behandlade enskiktslager var avbildade i totalt sex timmar, och bildbehandling utfördes med en skräddarsydd MATLAB-kod för att bestämma Tractions och därefter intercellulära Betonar. Våra resultat visade en generell minskning av Tractions och intercellulära spänningar, vilket tyder Cx43 spelar en nyckelroll i endotelceller biomekanik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. göra polyakrylamid (PA) geler
-
Beredning av petriskål
- Bered bind silan-lösning genom att blanda 200 ml ultrarent vatten med 80 μl ättiksyra och 50 μl av 3-(Trimetoxysilyl) propylmetakrylat. Bind silan är en lösning som används för att funktionalisera glaset botten petriskål skålen för hydrogel kvarstad.
- Rör om bind silan-lösningen på en rör platta i minst 1 h.
- Behandla centrum väl av petriskål med BIND silan lösning för 45 min.
- Ta bort Bind silan lösning och skölj petriskål med Ultra-Pure Water 2x-3x.
- Torka petriskåden yta och förvara i rumstemperatur för framtida bruk.
-
Beredning av hydro gel lösning
- Blanda ultrarent vatten, 40% akrylamid och 2% bis-akrylamid i ett 15 mL centrifugerör enligt tabell 1.
- Tillsätt 80 μL av fluorescerande pärlor till Hydro gellösningen.
- Skaka försiktigt röret för att blanda pärlor med gellösningen.
- Dra åt rör locket lätt på centrifugerröret och placera det i en vakuumkammare.
- Degas gellösningen i minst 45 min i vakuumkammaren.
-
Hydrogel polymerisation
- Tillsätt först 75 μL av 10% ammoniumpersulfat (upplöst i ultrarent vatten) och tillsätt sedan 8 μL TEMED (N, N, N ',, N'-tetramethylethane-1,2-diamine) till Hydro gellösningen.
- Placera 24 μL hydro gel lösning i mitten av petriskål (se tabell 2).
- Använd en 18 mm täckslip för att platta ut Hydrogelen. Detta kommer att ge en höjd av ~ 100 μm.
- Vänta minst 30-40 min för gel polymerisation.
- Sänk den polymeriserade Hydrogelen i ultrarent vatten för att förhindra gel uttorkning.
- Täck petriskål med aluminiumfolie för att förhindra foto blekning av fluorescerande pärlor och förvara vid 4 ° c.
Obs: hydrogels kan lagras en period på upp till 3 månader, men det föreslås att dessa geler användas inte längre än 1 vecka efter tillverkningen för att få bästa resultat.
2. cell odling
- Kultur mänsklig navel ven endotelceller (HUVECs) i cellkulturmedium 200 (se tabell över material) kompletteras med 1% penicillin-streptomycin på 0,1% gelatin-belagda flaskor vid 37 ° c och 5% Co2.
3. micropattern stencil förberedelse
- Bota ett tunt lager Polydimetylsiloxan (PDMS) i en 100 mm petriskål genom att blanda silikon basen med silikon härdnings medlet vid ett förhållande av 20:1 (bas: härdningsmedel).
Obs: det är möjligt att använda andra bas-till härdningsförhållanden (ex. 10:1 eller 30:1). Emellertid, en lägre bas till härdningsmedel förhållandet kommer att ge en styvare mönster, medan en högre bas till härdning agent förhållandet kommer att producera en mjukare mönster. - Förbered en 20:1 (bas: härdningsmedel) PDMS lösning och blanda försiktigt i en 50 mL centrifug röret. Vänd röret upp och ner och skaka kraftigt flera gånger för att säkerställa korrekt blandning av PDMS lösning, som NonUniform blandning kommer att resultera i ofullständig polymerisation.
- Ta bort bubblor som har införts från ovanstående steg genom centrifugering av PDMS lösning för 1 min vid 190 x g.
- Häll 5-6 mL PDMS lösning i mitten av en 100 mm petriskål och agitera skålen tills PDMS lösningen täcker hela petriskål yta.
- Bota PDMS lösningen över natten vid 50-60 ° c. PDMS kan också botas i rumstemperatur.
- Ta bort en cirkulär, 16 mm diameter PDMS stencil med en hålslag.
- Använd en biopsi Punch att skapa små hål i PDMS stencil. Detta protokoll använder en 1,25 mm diameter biopsi punch.
- Sterilisera PDMS stenciler genom att först dränka dem i 70% etanol för 2-3 min, aspirrating av överskott etanol och sedan placera under en UV-ljus för 5 min.
4. kollagen-I hydro gel beläggning
- Ta bort täckglanden från Hydrogelen och aspirera eventuellt överflödig vätska.
- Placera PDMS-stencilen på hydrogelytan.
Obs: pincett kan användas för att tillämpa lätta tryck till PDMS stencil för att säkerställa en vattentät tätning mellan PDMS stencil och hydrogel yta. Våra PDMS schabloner är vattentäta och därmed förhindra vattentillgång mellan gelen översta ytan och PDMS stencil bottenyta. Dessutom behöver inte hydrogelstyvheten justeras med avseende på PDMS styvhet. - Täck över hydrogelytan med sulfosuccinimidyl-6-(4-azido-2-nitrophenylamino) hexanoat (sulfo-SANPAH) upplöst i a 0,1 M HEPES (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethansulfonsyra) buffertlösning med en koncentration av 1:1000 och plats under en UV- lampa (effekt 36 W) för 8 min.
- Aspirera överskottet sulfo-SANPAH och HEPES lösning och skölj hydrogel två gånger med 0,1 M HEPES följt av en ytterligare två sköljning med ultra-rent vatten.
- Aspirera överskott Ultra-Pure vatten och Coat hydrogeler med 0,1 mg/ml kollagen-jag över natten vid 4 ° c.
- Täck disken och skydda fluorescerande pärlor från foto blekning.
Obs: PDMS schabloner används för att skapa mikromönstrade monolayers. Mikromönstrade enskiktslager används eftersom de tillåter flera enskiktslager av samma geometri och dimensioner som ska observeras samtidigt under varje experiment. Men om mikromönster inte önskas kan ovanstående steg följas med undantag för steg 4,2.
5. skapa huvec enskiktslager på hydrogeler
- Använd 1x trypsin för att lösgöra celler från vävnads odlingsflaskor för 3-5 min i inkubatorn.
- Efter trypsinization, Lägg cellkultur media till trypsin lösning och tillsätt 15 mL Centrifugera röret.
- Centrifugera cell lösningen i 3 minuter vid 1710 x g. En liten, vit pellet av celler bör vara synlig på botten av Centrifugera röret.
- Aspirera på supernatanten och Omsuspendera cellerna i media till en koncentration av 50 x 104 celler/ml.
- Ta bort kollagen-I från hydrogel och skölj 1x med PBS.
- Tillsätt 75 x 103 celler överst på PDMS-stencilen och låt cellerna fästa på hydrogelytan i minst 1 h i inkubatorn vid 37 ° c och 5% Co2.
- Ta bort PDMS-stencilen och tillsätt minst 2 mL media till petriskål. Sänk PDMS stencil i 10X trypsin att ta bort alla bifogade celler och sterilisera genom sprutning med 70% etanol och sedan placera under UV-ljus för 5 min.
- Placera petriskål i inkubatorn och vänta minst 36 h eller tills en konflytande enskiktslager observeras.
6.2,5 dihydroxychalcone behandling för Cx43 störningar
- Lös 2,5 dihydroxychalcone (chalcone) i dimetylsulfoxid (DMSO) att göra en 0,1875 mg/ml stamlösning.
- Späd stamlösningen med cell Odlingsmedier för att göra en låg Chalkon koncentration (0,2 μg/mL) alikvot och en hög Chalkon koncentration (2 μg/mL) alikvot.
7. data insamling
- Lokalisera cell öar med ett mikroskop.
- Förvärva faskontrast och pärla bilder till bild cell morfologi och hydrogel förskjutningar, respektive.
Anmärkning: detta protokoll används ett 10X mål för datainsamling. - I slutet av experimentet, lossa celler med 10X trypsin och förvärva en bild av gelytan utan celler (referensbild).
8. immunofärgning
- Fix enskiktslager med 4% formaldehyd och inkubera vid 37 ° c i 15 min.
- Ta 4% formaldehyd och tillsätt 0,2% Triton X-100 för 5 min vid 37 ° c till permeabilize celler.
- Ta bort 0,2% Triton X-100 och skölj enskiktslager med PBS 2x-3x.
- Täck enskiktslager med 2% bovint serum albumin (BSA) lösning för 45 min vid 37 ° c.
- Ta bort 2% BSA-lösningen och skölj enskiktslager med PBS 2x-3x.
- Tillsätt primär Cx43 antikropp vid en koncentration av 1:400 till provet och inkubera över natten vid 4 ° c.
- Ta bort primär antikropp och skölj provet med PBS 2x-3x.
- Tillsätt sekundär antikropp vid en koncentration av 3:200 och inkubera i 2 timmar vid 37 ° c.
Anmärkning: proverna bör täckas för att förhindra foto blekning. - Ta bort sekundär antikropp och skölj med PBS 2x-3x.
- Täck provet med monteringsmedel (Fluromount-G DAPI) och tätning med en 18 mm täckslip.
9. implementering av traktionskraft mikroskopi (TFM) och enskiktslager stress mikroskopi (MSM)
-
Beräkning av hydrogel deformation
En beräknings procedur för förskjutningar steg för steg med MATLAB ges nedan.- Öppna Main Traction. m filen i MATLAB (för alla MATLAB rutiner Se kompletterande material).
Anmärkning: Följ instruktionerna i koden för att ställa in MATLAB-katalogen. - Definiera följande variabler: bildformat, pixel-till-micron omvandling, Youngs Modulus, Poissons förhållande, och Mikroskop mål.
- Lokalisera pärla, trypsin bild, och fas bild med hjälp av openfiles subrutin.
Obs: för stora datamängder är det bäst att namnge filer i sekventiell ordning. Till exempel bör filer namnges "filnamn1. tif", "filnamn2. tif", etc. - Definiera en fyrkantig ROI (region av intresse) runt cellen enskiktslager och utföra cell_cropper subrutin att beskära den ursprungliga bilden.
- Utför displacement_finder -subrutin för att beräkna förskjutningar.
- Utför Dedrift subrutine att ta bort eventuella ytterligare icke-cellulära förskjutningar som kan bero på Mikroskop skede drift.
- Öppna Main Traction. m filen i MATLAB (för alla MATLAB rutiner Se kompletterande material).
-
Uträkning av Tractions
Obs: här är oinskränkt Tractions beräknas med hjälp av vår skräddarsydda MATLAB rutin. Steg för steg Traction beräkning med hjälp av MATLAB rutin tidigare nämnts anges nedan.- Definiera följande variabler inom Traction. m rutin: gräns skick, gel tjocklek, gel höjd, och dedrift.
- Utför traction_finder -subrutin för att beräkna Tractions och kör plot_traction subrutin för att plotta Tractions. Alla Tractions i x-riktning (TX) och y-riktning (ty) tillsammans med deras motsvarande pixel platser kan hittas i en Traction. dat fil som kommer att genereras av koden.
-
Uträkning av intercellulära spänningar
Anmärkning: steg för steg instruktioner för intercellulära stress beräkning med hjälp av MATLAB rutin tidigare nämnts ges nedan.- Kör mark_circular_domain -subrutin för att ange den enskiktslager gränsen. Denna rutin kommer att uppmana alla beskurna fas bilder sekventiellt för användaren att manuellt dra en gräns runt monolayer. Anteckna nXPts genereras i kommandofönstret och använda dem senare som rutnäts parametrar i både X-axeln och Y-axeln för FEM-analys (se steg 9.3.2).
- Utföra Run_StressCode att beräkna intercellulära påfrestningar. Denna subrutin läser direkt parametrar från "model.in"-filen och exekverar "Island. exe" för att utföra FEM-analys. Innan du kör denna rutin, se till att alla parametrar i Model.in -filen, dvs rutnät parametrar i X och Y, pixel till micron omvandling, Youngs Modulus av gelen, Poissons förhållande, enskiktslager höjd, och enskiktslager mönster (band eller hål), redigerad Korrekt.
- Rita alla FEM resultat med hjälp av plot_FEM_results subrutin.
Obs: alla resultat som genereras kommer automatiskt att lagras i resultatmappen i MATLAB-katalogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Faskontrast bilder av kontroll, 0,2 μg/ml, och 2 μg/ml Chalkon behandlade enskiktslager togs 30 minuter före Chalkon behandling (figur 1A-C) och 2 timmar efter Chalkon behandling (figur 1D-F). Cell-inducerad pärla förskjutningar (μm) observerades för att minska i både lågdos Chalkon och hög dos Chalkon villkor (figur 2E, F) jämfört med kontroll huvec enskiktslager (figur 2D). Före Chalkon-behandlingen var RMS-Tractions cirka 51 ± 8 PA (figur 3A-C) för alla förhållanden. Efter behandling med Chalkon var det en liten ökning av RMS-Tractions till 59 ± 11 pa i en lågdos Chalkon behandlade enskiktslager (figur 3E) och en nästan 2-faldig minskning av RMS-Tractions till 18 ± 2 i hög dos Chalkon behandlade enskiktslager ( Figur 3F) jämfört med kontrollen (figur 3D). Före Chalkon behandling, genomsnittliga normala intercellulära spänningar var runt 220 ± 66 PA (figur 4A-C). Efter Chalkon behandling, det fanns en ökning av genomsnittlig normal intercellulära stress magnitud till 285 ± 75 pa med lågdos Chalkon behandling (figur 4E) men en signifikant minskning i genomsnittlig normal intercellulära stress magnitud till 106 ± 4 pa med hög dos Chalkon behandling (figur 4F) jämfört med kontroll genomsnittliga normala intercellulära spänningar (235 ± 18 PA, figur 4D). Maximal skjuvning intercellulära spänningar var runt 241 ± 30 PA (figur 5A-C) före Chalkon behandling, men efter Chalkon behandling, det fanns en minskning till 227 ± 20 pa vid låg Chalkon koncentration (figur 5E) och en ytterligare minskning i maximal skjuvning intercellulära spännings magnitud till 91 ± 6 pa vid hög Chalkon koncentrations behandling (figur 5F) jämfört med kontroll maximal skjuvning intercellulära påfrestningar (270 ± 30 Pa, figur 5D ). Analysen av Tractions och intercellulära spänningar presenteras i figur 6A-C. Alla plottade resultat testades för statistisk signifikans (t-test och enfaktoranova-test), och i båda testerna konstaterades att resultaten var statistiskt signifikanta (p < 0,05) när man självständigt jämförde 0,2 μg/ml Chalkon koncentration och 2 μg/ml Chalkon för att kontrollera förhållandena (utan Chalkon).
Figur 1: representativa faskontrast bilder av HUVEC monolayers. Exempel faskontrast bilder av kontroll huvecs vid 30 min (A) och 2 h (D), faskontrast bilder av huvecs som behandlats med 0,2 μg/ml Chalkon vid 30 min (B) och 2 h (E), och faskontrast bilder av huvecs som behandlats med 2 μg/ml Chalkon vid 30 min (C) och 2 h (F) experimentets debut. Scale bar representerar enskiktslager diameter på 1,25 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: illustration av förskjutnings fält som produceras av HUVEC monolayers. Representativa förskjutningar (μm) av kontroll huvecs vid 30 min (a) och 2 h (D), huvecs behandlade med 0,2 μg/ml Chalkon vid 30 min (B) och 2 h (E), och huvecs behandlas med 2 μg/ml Chalkon vid 30 min (C) och 2 h (F) av experimentets debut. Scale bar representerar enskiktslager diameter 1,25 mm. Color bar representerar förskjutningar i μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: RMS-traktionsfördelning i HUVEC monolayers. Exempel på RMS Tractions (PA) av kontroll, 0,2 μg/ml Chalkon, och 2 μg/ml Chalkon huvecs före Chalkon behandling (A-C) och efter en timme av Chalkon behandling (D-F), respektive. Scale bar representerar enskiktslager diameter på 1,25 mm. Color bar representerar RMS Tractions i PA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: genomsnittlig normal intercellulära spännings fördelning i HUVEC monolayers. Genomsnittlig normal intercellulära stress (PA) distribution av kontroll huvecs vid 30 min (a) och 2 h (D), huvecs behandlas med 0,2 μg/ml Chalkon vid 30 min (B) och 2 h (E), och huvecs behandlas med 2 μg/ml Chalkon vid 30 min (C) och 2 h (F). Scale bar representerar enskiktslager diameter på 1,25 mm. Color bar representerar spänningar i PA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: maximal skjuvning intercellulära stress fördelning i HUVEC monolayers. Maximal skjuvning intercellulära stress (PA) distribution av kontroll huvecs vid 30 min (a) och 2 h (D), huvecs behandlas med 0,2 μg/ml Chalkon vid 30 min (B) och 2 h (E), och huvecs behandlas med 2 μg/ml Chalkon vid 30 min (C) och 2 h (F). Scale bar representerar enskiktslager diameter på 1,25 mm. Color bar representerar spänningar i PA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: jämförelse av RMS-Tractions och intercellulära spänningar i huvec-enskiktslager och effekten av Chalkon-behandling på huvec gap Junction Cx43 structures. Tomter av genomsnittlig normal intercellulära stress (a), maximal skjuvning intercellulära stress (B) och RMS Tractions (C) visar effekten av Chalkon doser (0,2 μg/ml och 2 μg/ml) på huvec enskiktslager jämfört med kontroll. Felstaplar visar standardfel. Resultaten visade sig vara statistiskt signifikanta (urvalsstorlek = 6 öar, med en konfidensnivå på 95%) med både t-test jämfört med kontroll (p < 0,05) och en faktor ANOVA (p < 0,05). I separata rätter, immunofärgning utfördes 5 h efter tillsats av drogen för öar av celler som finns på mjuka 1,2 kPa hydrogels. Den gröna färgen representerar Cx43 och blått representerar DAPI (Nucleus). Panel D visar följande: kontroll (E, H), 0,2 μg/ml Chalkonbehandlade celler (F, I) och 2μg/ml Chalkonbehandlade celler (G, J). Skalstapel = 200 μm, mål = 20x. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: högupplöst Cx43 färgning i HUVEC monolayers. Fast huvec enskiktslager färgas för Cx43 (grön) och Nucleus (DAPI, blå) för att iaktta den dosberoende effekten av chalcone. Högre förstorings bilder (63x mål) avslöjar Cx43 lokalisering mestadels runt kärnan (tydligt från grön fluorescens intensitet). Som visas är kontroll (A-C), 0,2 μg/ml chalkonbehandlade celler (D-F) och 2 μg/ml Chalkonbehandlade celler (G-I). Scale bar = 100 μm, mål = 63x oljesänkning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 1200 PA | 870 PA | 1 kPa | 4 kPa | 6,3 kPa | 11 kPa | 90 kPa | 150 kPa | |
| Lösningens sammansättning | 0,05% BIS | 0,1% BIS | 0,03% BIS | 0,1% BIS | 0,03% BIS | 0,07% BIS | 0,3% BIS | 0,6% BIS |
| 5,5% akryl | 2% akryl | 5% akryl | 5% akryl | 10% akryl | 10% akryl | 12% akryl | 12% akryl | |
| Ultra Pure Water | 12,49 mL | 13,38 mL | 12,78 mL | 12,255 mL | 10,905 mL | 10,63 mL | 8,30 mL | 5,9 mL |
| 40% akrylamid | 2,062 mL | 750 μL | 1,875 mL | 1,875 mL | 3,75 ml | 3,75 mL | 4,5 mL | 4,5 mL |
| 2% BIS akrylamid | 375 μL | 750 μL | 225 μL | 750 μL | 225 μL | 525 μL | 2,12 mL | 4,5 mL |
| Fluroscent pärlor (0,2 μm eller 0,5 μm) | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | Tractions är inte mätbara |
Tabell 1: polyakrylamidgel som gör formuleringar för olika Youngs moduli.
| Volym | Tjocklek | Täckglas | ||
| 20 mm SL-brunn | Tjock | 500 μL | ~ 1 mm | 25 mm |
| Tunn | 24 μL | ~ 100 μm | 18 mm | |
| 14 mm SL-brunn | Tjock | 175 μL | ~ 700 μm | 18 mm |
| Tunn | 10,3 μL | ~ 100 μm | 12 mm | |
| 14 mm 6-brunn | Tjock | 280 μL | ~ 1,5 mm | 18 mm |
Tabell 2: gel volym och tjocklek.
Kompletterande fil: MATLAB rutiner. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår grupp, liksom andra, har framgångsrikt använt TFM och MSM för att söka påverkan av cell-cell korsningar i olika patologiska och fysiologiska cellulära processer in vitro-7,15,18,27 . Till exempel presenterade Hardin et al. en mycket insiktsfull studie som antyder intercellulära stress överföring guider paracellulär gap formation i endotelceller15. Även om det är möjligt att relatera Cx43-relaterade förändringar vi rapporterar här till de förändringar som rapporterats av Hardin et al., vi inte specifikt adress paracellulära gap formation i detta protokoll. Här presenterade vi ett mekanisbaserat protokoll för att specifikt rikta in gap Junction Cx43 och undersöka dess påverkan på endotelial biomekanik.
För att göra detta protokoll lyckat, fanns det några utmaningar som vi måste övervinna, av vilka en del skulle kunna inträffa om andra forskare beslutar att anta vårt protokoll för liknande studier. En stor utmaning var att hitta en optimal Chalkon dosintervall där Cx43 uttryck kunde hämmas, samtidigt hålla våra endotelceller enskiktslager intakt. IC50 av Chalkon för huvecs har tidigare rapporterats vara 10,01 μg/ml28. Men när vi exponerade våra huvec enskiktslager till flera Chalkon koncentrationer från 0,2 μg/ml till 20 μg/ml, fann vi en Chalkon koncentration av 2 μg/ml vara den högsta koncentrationen våra enskiktslager kunde motstå medan fortfarande kvar confluent. En konfluenta enskiktslager var viktigt för detta protokoll, som en enskiktslager krävs för att mäta intercellulära spänningar med maskinurbenat kött. Därefter utförde vi en immunofluorescenstest för att avgöra om de valda doserna av Chalkon framgångsrikt störde Cx43 struktur eller skenbara uttryck. Vårt resultat visade att medan störning av Cx43 struktur med 0,2 μg/ml Chalkon var visuellt svårt att skilja från kontroll, verkade celler som behandlades med 2 μg/ml av Chalkon att visa en uppenbar skillnad i Cx43 struktur och potentiellt uttryck ( Figur 6D och kompletterande figur 1). Dessutom visade våra resultat att Cx43 störningar verkligen påverkar endotelial biomekanik genom att reducera Tractions och intercellulära spänningar vid dess högsta koncentration. Dessa fynd är överens med bazellieres et al. som visade ljuddämpnings av Cx43 med siRNA att också minska Tractions och intercellulära spänningar, men i ett ark av epitelceller27. Även om våra resultat är i samförstånd med andra bör det noteras att molekylen vi brukade störa Cx43 Expression, chalcone, har också föreslagits för att påverka aktiveringen av MAPK och NFkB förutom Cx43 avbrott26. Därför, eftersom vi inte specifikt titta på de ovan nämnda molekyler eller deras associerade vägar, vi kan inte utesluta det inflytande en potentiell MAPK och NFkB störning kan ha på endotelceller biomekanik också.
En annan viktig punkt värt att nämna är att de återvunna Tractions och intercellulära spänningar är 2D i naturen och ignorera ur plan (z-riktning) Tractions och intercellulära spänningar12,13. Även om det finns ett litet fel i samband med ignorerar out-of-Plane spänningar, är detta fel försumbar13. Dessutom är den laterala dimensionen av enskiktslager tillräckligt stor (1,25 mm) i förhållande till enskiktslager höjd (~ 5 μm) så att vi inte skulle förvänta sig betydande förskjutningar i z-riktning. Dessutom erbjuder MSM-beräkningen fel vid enskiktslager-gränsen12,13. Men tambe et al. experimentellt visade att fel är störst vid de optiska kanterna (dvs. den enskiktslager gränsen) och sönderfaller snabbt distalt från gräns kanterna13. Vi utför micropatterning och sedan beräkna intercellulära spänningar av hela enskiktslager att undvika gräns fel som kan uppstå under intercellulära stress beräkning.
Monolayer stress mikroskopi utnyttjas i detta protokoll som intercellulära stress information som framkommit från denna metod är viktigt för att få en mer fullständig förståelse av den roll gap korsningen störningar har på endotelceller biomekanik. Dessutom har intercellulära spänningar föreslagits vara viktiga i endotelial barriärfunktion, som föreslagits av Hardin et al.15 och Ulrica et al.17, till exempel. Dessutom, medan intercellulära spänningar var korrelerade till Tractions i representativa uppgifter som presenteras här, detta är inte alltid fallet beroende på stimulans. I studien av Steward et al., till exempel, endoteliala intercellulära spänningar visade sig minska under Fluid skjuvning, medan Tractions förblev relativt oförändrad7. Också, det protokoll som vi presenterar här inte tillåter samtidig mätning av cell-härledda mekaniska krafter och färgning av korsningar och fokala sammanväxningar, men ett sådant tillägg skulle vara gratis att detta protokoll. Avslutningsvis beskriver det protokoll som vi presenterar här en mekanisbaserad metod för att undersöka inflytandet Cx43 har enbart på endotelial biomekanik, specifikt endotelceller härledda styrkor. Vi tror att vårt mekanisbaserade protokoll kan användas tillsammans med befintliga biologiskt baserade protokoll för att ge verkligt banbrytande arbete inom området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av University of Central Florida start-up fonder och National Heart, lung, och Blood Institute i National Institute of Health under Award K25HL132098.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm coverslip | ThermoFisher | 18CIR-1 | Essential to flatten polyacrylamide gels |
| 2% bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610143 | Component of polyacrylamide gel |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | To disrupt Cx43 structure |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | SIGMA | 2530-85-0 | Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water |
| 40% Acrylamide | BIO-RAD | 1610140 | Component of polyacrylamide gel |
| Acetic acid | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Essential to make bind saline solution |
| Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Secondary antibody |
| Ammonium persulfate | BIO-RAD | 1610700 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | To make blocking solution |
| Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Use as a extracellular matrix |
| Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Buffer Saline needed for cell culture |
| Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | To dissolve chalcone and make stock solution |
| Fluoromount-G with DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI |
| Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads | ThermoFisher | F8812 | 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids |
| HEPES buffer solution 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Essential to |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Essential HUEVC media 200 supplement |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | Essential media for HUVEC cell culture |
| Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Primary antibody for Cx43 |
| Petri dish (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 35 mm petri dish with a 20 mm center well |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Essential to functionalize polyacrylamide gel surface |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW corning | 2646340 | Silicon elastomer with curing agent to make PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | To permeabilize cells |
| Trypsin -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Used to detach cells |
References
- Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
- Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
- Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
- Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
- Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
- Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
- Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
- Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
- Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
- Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
- Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
- Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
- Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).
- Lee, Y. N., et al. 2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
- Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
- Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).
