Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Perturbing Endothelial biomekanik via Connexin 43 strukturel forstyrrelse

Published: October 4, 2019 doi: 10.3791/60034
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of Central Florida, 2Burnett School of Biomedical Sciences, College of Medicine, University of Central Florida

Summary

Her præsenterer vi en mekanik-baseret protokol til at forstyrre Gap Junction connexin 43 og måle den efterfølgende indvirkning, dette har på endotelal biomekanik via observation af distraktionerne og intercellulære belastninger.

Abstract

Endotelceller er blevet etableret for at generere intercellulære spændinger og tractions, men rolle Gap kryds spiller i endotelal intercellulære stress og trækkraft generation er i øjeblikket ukendte. Derfor præsenterer vi her en mekanik-baseret protokol til at sonde indflydelse af Gap Junction connexin 43 (Cx43) har på endotel biomekanik ved at udsætte flydende endotel monolag til en kendt Cx43 inhibitor 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) og måling af virkningen denne inhibitor har på distraktionerne og intercellulære belastninger. Vi præsenterer repræsentative resultater, som viser et fald i både distraktionerne og intercellulære belastninger under en høj chalcone dosering (2 μg/ml) i forhold til kontrol. Denne protokol kan anvendes til ikke blot Cx43, men også andre Gap kryds samt, forudsat den relevante inhibitor anvendes. Vi mener, at denne protokol vil være nyttig inden for områderne kardiovaskulær og mechanobiologi forskning.

Introduction

Det felt, der refererer til studiet af virkningerne af fysiske kræfter og mekaniske egenskaber på cellulære og vævs fysiologi og patologi er kendt som mechanobiology1. Et par nyttige teknikker, der er blevet udnyttet i mechanobiologi er enkeltlags stress mikroskopi og trækkraft mikroskopi. Trækkraft mikroskopi giver mulighed for beregning af distraktionerne genereret på celle-substrat interface, mens enkeltlags stress mikroskopi giver mulighed for beregning af intercellulære belastninger genereret mellem tilstødende celler inden for en enkeltlags2 ,3,4,5,6. Resultater fra tidligere metoder har antydet, at celle-afledte mekaniske belastninger spiller en afgørende rolle i fastsættelsen af skæbnen for et væld af cellulære processer3,4,5. For eksempel, ved udsættelse for en ekstern mekanisk kraft, en gruppe af celler migrere som en kollektiv kan ændre deres morfologi og polarisere deres form til at justere og migrere langs retningen af anvendt kraft ved, delvis, generering af distraktionerne7, 8. Tractions giver en måling, der kan bruges til at evaluere celle kontraktilitet og beregnes ved hjælp af Traction Force mikroskopi (TFM). Trækkraft mikroskopi (TFM) begynder med bestemmelsen af celle-induceret substrat deformationer efterfulgt af beregningen af trækkraft felt ved hjælp af en matematisk stringent, mekanik-baserede beregningsmæssige tilgang. Da evnen til at beregne distraktionerne har eksisteret i temmelig lang tid, forskere har udnyttet TFM at afsløre virkningen distraktionerne har på en række processer, herunder kræft9, sårheling10 og vurdering af manipuleret hjerte tissue11.

Gennemførelsen af TFM og MSM sammen kan opdeles i tre væsentlige trin, der skal udføres i følgende rækkefølge: for det første bestemmes de hydrogel deformationer, der produceres af cellerne; for det andet, distraktionerne er genvundet fra hydrogel deformationer; og for det tredje, en finite element tilgang bruges til at beregne normale og shear intercellulære belastninger i hele monolayer. For at beregne gel-fordrivelser blev fluorescens perle billeder med celler sammenlignet med reference vulst billedet (uden celler) ved hjælp af en Special skrevet partikel billede velocimetry (PIV) rutine. Korrelations vinduets størrelse og overlap for PIV-analyse blev valgt til henholdsvis 32 x 32 pixels og 0,5. På dette tidspunkt blev pixel Skift konverteret til mikron ved at multiplicere med en pixel-til-Micron-konverteringsfaktor (for vores mikroskop er denne omregningsfaktor 0,65) for at opnå in-plane forskydninger. Fejl, der er forbundet med at ignorere forskydninger uden for flyet, er ubetydelige12,13. Efter beregning af gel forskydninger, der er to typer af trækkraft målinger, der kan udnyttes, begrænset distraktionerne og uhæmmet distraktionerne8,14. Uindskrænket distraktionerne giver trækkraft feltet for hele synsfeltet (herunder regioner med og uden celler), mens begrænset distraktionerne giver trækkraft feltet kun for regioner, der omfatter celler14. Derefter, intercellulære belastninger beregnes ved hjælp af enkeltlags stress mikroskopi (MSM), som er en forlængelse af trækkraft mikroskopi. Gennemførelsen af MSM er baseret ud fra den antagelse, at lokale spor, der udøves af en enkeltlags af celler på celle-substrat grænsefladen skal afbalanceres af mekaniske kræfter overføres mellem celler ved celle-celle grænsefladen som krævet af Newtons love7 ,12,13. En vigtig antagelse her er, at cellen enkeltlags kan behandles som en tynd elastisk ark, fordi trækkraft fordelingen i enkeltlags er kendt og kraftbalancen ikke afhænger af cellemateriale egenskaber. En anden vigtig antagelse er, at trækkraft kræfterne opvejes af lokale intercellulære belastninger inden for det optiske synsfelt (inden for monolayer), og indflydelsen af denne styrke balance er minimal i den distale region (uden for monolayer)13. Derfor er de Grænsebetingelser, der er defineret af intercellulære belastninger, forskydninger, eller en kombination af begge ved enkeltlags grænsen afgørende for at udføre MSM13. Under hensyntagen til ovenstående oplysninger anvender vi MSM til at udføre en finite element analyse (FEM) for at genvinde den maksimale hoved belastning (σMax) og minimal hoved belastning (σmin) ved at rotere stress planet på hvert punkt i enkeltlags. Disse primære belastninger anvendes efterfølgende til at beregne 2D-gennemsnittet af normal intercellulære stress [(σMax + σmin)/2] og 2D Maximum shear intercellulære stress [(σMax -σmin)/2] inden for hele enkeltlags 12,13. Denne procedure er beskrevet mere detaljeret af Tambe et al.12,13

Enkeltlags stress mikroskopi (MSM) giver mulighed for beregning af celle-celle intercellulære belastninger genereret i en enkeltlags6,7,8,12,13. Disse intercellulære belastninger er blevet foreslået at være vigtige for vævsvækst og reparation, sårheling, og kræft metastaser12,15,16,17. Desuden, intercellulære understreger er blevet foreslået at også være vigtigt i endotel celle migration og endotel barriere funktion17,18. Mens celle celle vejkryds såsom stramme kryds og overholder kryds er begge blevet foreslået for at spille en afgørende rolle i endotel intercellulære stress generation og transmission, den rolle, Gap vejkryds forbliver flygtig. Gap kryds fysisk forbinde tilstødende celler og give en vej til elektrisk strøm og molekyler (< 1 kDa) at passere mellem tilstødende celler19,20,21. Selvom endotelceller udtrykker Cx37, Cx40 og Cx43 Gap-kryds19,22, Cx43 er formentlig det vigtigste med hensyn til sygdomsprogression23. Tegn på Cx43's betydning kan findes i det faktum, at genetisk sletning af Cx43 i mus resulterer i hypotension24 og har negative virkninger på angiogenese25. Desuden, Cx43 er blevet dokumenteret at være vigtigt for celle migration og spredning og i progression af åreforkalkning18,22,23,24,25 .

I denne protokol brugte vi TFM og MSM til at undersøge, om trækkraft og intercellulære stress generering inden for confluent, endotel enkeltlags ville blive påvirket af afbrydelsen af endotel Gap Junction Cx43. Vi afbrød Cx43 med 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), et molekyle dokumenteret for at hæmme Cx43 udtryk26. Chalcone blev brugt til at afbryde Cx43 i stedet for siRNA, da chalcone tidligere er blevet rapporteret af Lee et al. for at forstyrre Cx43 Expression26. Derudover var vi særligt interesserede i chalcone indflydelse på endotelet, da det også er blevet rapporteret at være en anti-inflammatorisk og anti-trombocytstof, der potentielt kan anvendes til forebyggelse og behandling af forskellige vaskulære patologier26. Chalcone behandlinger blev udført en time efter forsøget debut, chalcone-behandlede monolag blev afbildet i alt seks timer, og billedbehandling blev udført med en Custom-skrevet MATLAB kode til at bestemme distraktionerne og efterfølgende intercellulære Understreger. Vores resultater viste en samlet nedgang i distraktionerne og intercellulære belastninger, tyder Cx43 spiller en central rolle i endotelal biomekanik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fremstilling af polyacrylamid (PA) geler

  1. Fremstilling af Petri skål
    1. Forbered binde silan-opløsningen ved at blande 200 ml ultrarent vand med 80 μl eddikesyre og 50 μl 3-(trimethoxysilyl) propylmethacrylat. Bind silan er en løsning, der bruges til at funktionalisere glasbunden Petri skål overflade til hydrogel fastgørelse.
    2. Bind silan opløsningen omrøres på en omrørings plade i mindst 1 time.
    3. Behandl centrum godt af Petri skålen med bind silan opløsning til 45 min.
    4. Fjern binde silan opløsning og skyl Petri skålen med ultra-Pure vand 2x-3x.
    5. Tør den Petri skål overflade og opbevar ved stuetemperatur til fremtidig brug.
  2. Fremstilling af hydrogel opløsning
    1. Bland ultra-rent vand, 40% acrylamid og 2% bis-acrylamid i et 15 mL centrifugeglas i henhold til tabel 1.
    2. Tilsæt 80 μL fluorescerende perler til hydrogel opløsningen.
    3. Ryst forsigtigt røret for at blande perler med gel-opløsningen.
    4. Stram forsigtigt rørhætten på centrifugeglasset, og anbring den i et vakuumkammer.
    5. Degas gel opløsningen i mindst 45 min i vakuumkammeret.
  3. Hydrogel polymerisering
    1. Tilsæt først 75 μL 10% ammonium persulfat (opløst i ultra-rent vand), og tilsæt derefter 8 μL TEMED (N, N, N ', N'-tetramethylethane-1,2-diamin) til hydrogel opløsningen.
    2. Placer 24 μL hydrogel opløsning i midten af Petri skålen (Se tabel 2).
    3. Brug en 18 mm dækseddel til at udglatte hydrogel. Dette vil give en højde på ~ 100 μm.
    4. Vent mindst 30-40 min for gel polymerisering.
    5. Nedsænk den polymeriserede hydrogel i ultra-rent vand for at forhindre gel dehydrering.
    6. Dæk Petri skålen med aluminiumsfolie for at forhindre foto blegning af fluorescerende perler og opbevares ved 4 °C.
      Bemærk: Hydrogels kan lagres en periode på op til 3 måneder, men det foreslås, at disse geler anvendes ikke længere end 1 uge efter fabrikation for at opnå de bedste resultater.

2. cellekultur

  1. Kultur humane navle formede vene endotelceller (Huvec'er) i cellekulturmedium 200 (Se tabel over materialer) suppleret med 1% penicillin-streptomycin på 0,1% gelatine belagte kolber ved 37 °c og 5% Co2.

3. forberedelse af mikromønster stencil

  1. Kurere et tyndt lag Polydimethylsiloxan (PDMS) i en 100 mm Petri skål ved at blande silikone basen med silikone hærdnings midlet i et forhold på 20:1 (Base: Hærdningsmiddel).
    Bemærk: det er muligt at bruge anden base til at hærdemiddel ratio (ex. 10:1 eller 30:1). Men en lavere base til Hærdningsmiddel ratio vil give et stivere mønster, mens en højere base til Hærdningsmiddel ratio vil producere et blødere mønster.
  2. Forbered en 20:1 (Base: Hærdningsmiddel) PDMS opløsning og bland forsigtigt i et 50 mL centrifugeglas. Vend røret på hovedet og ryst kraftigt flere gange for at sikre korrekt blanding af PDMS-opløsningen, da ikke-ensartet blanding vil resultere i ufuldstændig polymerisering.
  3. Fjern bobler, der er blevet introduceret fra ovenstående trin ved at centrifuger PDMS-opløsningen i 1 min ved 190 x g.
  4. Hæld 5-6 mL PDMS-opløsning i midten af en 100 mm Petri skål, og omrym skålen, indtil PDMS-opløsningen dækker hele petriskål overfladen.
  5. Du bør helbrede PDMS-opløsningen natten over ved 50-60 °C. PDMS kan også helbredes ved stuetemperatur.
  6. Fjern en cirkulær, 16 mm diameter PDMS stencil med en hulpuncher.
  7. Brug en biopsi punch til at skabe små huller i PDMS stencil. Denne protokol bruger en 1,25 mm diameter biopsi punch.
  8. Steriliser PDMS stencils ved først at nedsænke dem i 70% ethanol for 2-3 min, aspirere off overskydende ethanol og derefter placere under et UV-lys i 5 min.

4. kollagen-I hydrogel belægning

  1. Fjern dæksedlen fra hydrogel og Aspirer eventuel overskydende væske.
  2. Placer PDMS-stencilen på hydrogel overfladen.
    Bemærk: tweezers kan bruges til at anvende let tryk til PDMS stencil for at sikre en vandtæt forsegling mellem PDMS stencil og hydrogel overflade. Vores PDMS stencils er vandtæt og dermed forhindre vand adgang mellem gel top overflade og PDMS stencil nederste overflade. Også, hydrogel stivhed behøver ikke at blive justeret med hensyn til PDMS stivhed.
  3. Dække hydrogel overfladen med sulfosuccinimidyl-6-(4-azido-2-nitrophenylamino) hexanoat (sulfo-SANPAH) opløst i en 0,1 M HEPES (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethansulfonsyre) bufferopløsning i en koncentration på 1:1000 og sted under en UV lampe (effekt 36 W) i 8 min.
  4. Aspirer den overskydende sulfo-SANPAH-og HEPES-opløsning og skyl hydrogel to gange med 0,1 M HEPES efterfulgt af yderligere to skylning med ultra-rent vand.
  5. Aspirere overskydende ultra-Pure vand og frakke silicagelrogeler med 0,1 mg/ml kollagen-jeg natten ved 4 °c.
  6. Dæk skålene og Beskyt fluorescerende perler fra foto blegning.
    Bemærk: PDMS stencils bruges til at oprette mikromønstrede monolayers. Mikromønstrede monolag udnyttes, da de giver mulighed for flere monolag af samme geometri og dimensioner, der skal observeres samtidigt under hvert eksperiment. Men, bør mikromønstre ikke ønskes ovenstående trin kan følges med undtagelse af trin 4,2.

5. oprettelse af HUVEC monolag på silicagelrogeler

  1. Brug 1x trypsin til at frigøre celler fra vævskultur kolber til 3-5 min i inkubator.
  2. Efter trypsinisering tilsættes cellekultur medier til trypsin-opløsningen og tilsættes til 15 mL centrifugeglasset.
  3. Centrifuger celle opløsningen i 3 min. ved 1710 x g. En lille, hvid pellet af celler skal være synlig i bunden af centrifugeglasset.
  4. Aspirér supernatanten og resuspender cellerne i medierne til en koncentration på 50 x 104 celler/ml.
  5. Fjern kollagen-I fra hydrogel og skyl 1x med PBS.
  6. Tilsæt 75 x 103 -celler til toppen af PDMS-stencilen, og lad cellerne fastgøre til hydrogel overfladen i mindst 1 time i inkubator ved 37 °c og 5% Co2.
  7. Fjern PDMS-stencilen, og tilsæt mindst 2 mL medier til Petri skålen. Nedsænk PDMS-stencilen i 10x trypsin for at fjerne eventuelle tilsluttede celler og sterilisere ved sprøjtning med 70% ethanol og derefter placere under UV-lyset i 5 min.
  8. Placer Petri skålen i inkubator og vent mindst 36 h, eller indtil der observeres et konfluent-enkeltlags.

6.2,5 dihydroxychalcone behandling for Cx43 forstyrrelse

  1. 2,5 dihydroxychalcone (chalcone) opløses i dimethylsulfoxid (DMSO) for at lave en 0,1875 mg/mL stamopløsning.
  2. Stamopløsningen fortyndes med cellekultur medier for at lave en lav chalcone-koncentration (0,2 μg/ml) alikvot og en høj chalcone-koncentration (2 μg/ml) alikvot.

7. data indsamling

  1. Find celle øerne med et mikroskop.
  2. Erhverve fasekontrast og perle billeder til billed celle morfologi og hydrogel forskydninger, hhv.
    Bemærk: denne protokol brugte en 10x-målsætning til dataindsamling.
  3. Ved afslutningen af eksperimentet fjernes celler med 10x trypsin og får et billede af gelen overflade uden celler (referencebillede).

8. immun farvning

  1. Fiksere monolag med 4% formaldehyd og Inkuber ved 37 °c i 15 minutter.
  2. Fjern 4% formaldehyd og tilsæt 0,2% Triton X-100 i 5 min ved 37 °C for at permeabilize cellerne.
  3. Fjern 0,2% Triton X-100 og skyl monolag med PBS 2x-3x.
  4. Dæk enkeltlags med 2% bovin serumalbumin (BSA) opløsning til 45 min ved 37 °c.
  5. Fjern 2% BSA-opløsningen, og skyl monolag med PBS 2x-3x.
  6. Der tilsættes primært Cx43-antistof i en koncentration på 1:400 til prøven, og der inkubates natten over ved 4 °C.
  7. Fjern primært antistof og skyl prøve med PBS 2x-3x.
  8. Tilsæt sekundært antistof i en koncentration på 3:200 og Inkuber i 2 timer ved 37 °C.
    Bemærk: prøverne skal dækkes for at forhindre foto blegning.
  9. Fjern sekundært antistof og skyl med PBS 2x-3x.
  10. Cover prøve med monterings medium (Fluromount-G DAPI) og tætning med en 18 mm Cover seddel.

9. gennemførelse af trækkraft mikroskopi (TFM) og enkeltlags stress mikroskopi (MSM)

  1. Beregning af hydrogel deformation
    Bemærk: en trin-for-trin-forskydnings beregningsprocedure ved hjælp af MATLAB er angivet nedenfor.
    1. Åbn hoved træk. m -filen i MATLAB (for alle MATLAB-rutiner Se supplerende materialer).
      Bemærk: Følg instruktionerne i koden for at indstille MATLAB-mappen.
    2. Definer følgende variabler: billedformat, pixel-til-Micron-konvertering, Youngs modulus, Poissons ratio og mål for mikroskop.
    3. Find vulst, trypsin billede og fase billede ved hjælp af openfiles subrutine.
      Bemærk: for store datasæt er det bedst at navngive filer i rækkefølge. For eksempel skal filer hedder "filnavn1. tif", "filnavn2. tif" osv.
    4. Definer et kvadrat ROI (region af interesse) omkring cellen enkeltlags og udføre cell_cropper subrutine at beskære det oprindelige billede.
    5. Udfør displacement_finder subrutine for at beregne forskydninger.
    6. Udfør Dedrift subrutine for at fjerne eventuelle yderligere ikke-cellulære forskydninger, der kan skyldes mikroskop fase drift.
  2. Beregning af distraktionerne
    Bemærk: her beregnes uhæmmet distraktionerne ved hjælp af vores brugerdefinerede MATLAB rutine. Trin for trin trækkraft beregning ved hjælp af MATLAB rutine tidligere nævnt er angivet nedenfor.
    1. Definer følgende variabler inden for trækkraft. m rutine: grænse tilstand, gel tykkelse, gel højde, og dedrift.
    2. Udfør traction_finder subrutine for at beregne tractioner og udføre plot_traction subrutinen til plot distraktionerne. Alle spor i x-retning (TX) og y-retning (ty) sammen med deres tilsvarende pixel placeringer kan findes i en Traction. dat-fil, der vil blive genereret af koden.
  3. Beregning af intercellulære belastninger
    Bemærk: trin for trin instruktioner til intercellulære stress beregning ved hjælp af MATLAB rutine tidligere nævnt er angivet nedenfor.
    1. Udfør mark_circular_domain subrutinen for at angive grænsen for enkeltlags. Denne rutine vil bede alle beskårne fase billeder sekventielt for brugeren at manuelt tegne en grænse omkring monolayer. Hold et notat af nXPts genereret i kommandovinduet og bruge dem senere som gitter parametre i både X-akse og Y-akse for FEM-analyse (Se trin 9.3.2).
    2. Udfør Run_StressCode for at beregne intercellulære belastninger. Denne subrutine læser direkte parametre fra "model.in" fil og udfører "Island. exe" for at udføre FEM analyse. Før du kører denne rutine, skal du sørge for alle parametre i model.in fil, dvs gitter parametre i X og Y, pixel til Micron konvertering, Youngs modulus af gel, Poisson ratio, enkeltlags højde, og enkeltlags mønster (strip eller hul), redigeres Korrekt.
    3. Plot alle de FEM resultater ved hjælp af plot_FEM_results subrutinen.
      Bemærk: alle genererede resultater vil automatisk blive gemt i resultat mappen i MATLAB-mappen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fasekontrast billeder af kontrol, 0,2 μg/ml, og 2 μg/ml chalcone behandlet monolag blev taget 30 minutter før behandling med chalcone (figur 1A-C) og 2 timer efter behandling med chalcone (figur 1D-F). Celle inducerede perle forskydninger (μm) blev observeret for at falde i både lavdosis-chalcone-og højdosis-chalcone-tilstande (figur 2E, F) sammenlignet med kontrol HUVEC-monolag (figur 2D). Før behandling med chalcone var RMS-distraktionerne ca. 51 ± 8 PA (figur 3A-C) under alle forhold. Efter behandling med chalcone var der en lille stigning i RMS-distraktionerne til 59 ± 11 PA i en lavdosis-chalcone-behandlet monolag (figur 3E) og et næsten 2-fold fald i RMS-tractioner til 18 ± 2 i højdosis-chalcone-behandlede monolag ( Figur 3F) sammenlignet med kontrolelementet (figur 3D). Før behandling med chalcone var de gennemsnitlige normale intercellulære spændinger ca. 220 ± 66 PA (figur 4A-C). Efter behandling med chalcone var der en stigning i den gennemsnitlige normale intercellulære stress størrelsesorden til 285 ± 75 PA med lavdosis-chalcone behandling (figur 4E), men et signifikant fald i den gennemsnitlige normale intercellulære stress størrelsesorden til 106 ± 4 PA med højdosis chalcone behandling (figur 4F) sammenlignet med kontrol gennemsnitlige normale intercellulære belastninger (235 ± 18 PA, figur 4D). Maksimale forskydnings intercellulære belastninger var omkring 241 ± 30 PA (figur 5A-C) før behandling med chalcone, men efter behandling med chalcone var der et fald til 227 ± 20 PA ved lav chalcone-koncentration (figur 5E) og et yderligere fald i maksimal forskydning intercellulære stress størrelsesorden til 91 ± 6 PA ved høj chalcone koncentration behandling (figur 5F) sammenlignet med kontrol maksimal forskydning intercellulære belastninger (270 ± 30 PA, figur 5D ). Analysen af distraktionerne og intercellulære belastninger er præsenteret i figur 6A-C. Alle plottet resultater blev testet for Statistisk signifikans (t-test og enkelt faktor ANOVA-test), og i begge test viste resultaterne at være statistisk signifikante (p < 0,05), når de sammenligner 0,2 μg/ml chalcone-koncentrationen og 2 μg/mL chalcone til at kontrollere forholdene (uden chalcone).

Figure 1
Figur 1: repræsentative fasekontrast billeder af HUVEC-monolayers. Eksempel på fasekontrast billeder af kontrol Huvec'er ved 30 min (A) og 2 h (D), fasekontrast billeder af huvecs behandlet med 0,2 μg/ml chalcone ved 30 min (B) og 2 h (E), og fasekontrast billeder af huvecs behandlet med 2 μg/ml chalcone ved 30 min (C) og 2 timer (F) af eksperimentets debut. Scale bar repræsenterer enkeltlags diameter på 1,25 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: illustration af forskydnings felt produceret af HUVEC-monolayers. Repræsentative forskydninger (μm) af kontrol Huvecer ved 30 min (A) og 2 h (D), huvecs behandlet med 0,2 μg/ml chalcone ved 30 min (B) og 2 h (E), og Huvecs behandlet med 2 μg/ml chalcone ved 30 min (C) og 2 h (F) af eksperimentets indtræden. Scale bar repræsenterer enkeltlags diameter på 1,25 mm. Color bar repræsenterer forskydninger i μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: RMS-fordeling i HUVEC-monolayers. Eksempel på RMS-distraktionerne (PA) af kontrol, 0,2 μg/ml chalcone og 2 μg/ml chalcone huvecs før behandling med chalcone (A-C) og efter en time af chalcone behandling (D-F) hhv. Scale bar repræsenterer enkeltlags diameter på 1,25 mm. Color bar repræsenterer RMS distraktionerne i PA. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: gennemsnitlig normal intercellulære stress fordeling i HUVEC-monolayers. Gennemsnitlig normal intercellulære stress (PA) fordeling af kontrol HUVECs ved 30 min (A) og 2 h (D), huvecs behandlet med 0,2 μg/ml chalcone ved 30 min (B) og 2 h (E), og Huvecs behandlet med 2 μg/ml chalcone ved 30 min (C) og 2 h (F). Scale bar repræsenterer enkeltlags diameter på 1,25 mm. Color bar repræsenterer understreger i PA. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: maksimal forskydning intercellulære stress fordeling i HUVEC monolayers. Maksimal forskydning intercellulære stress (PA) fordeling af kontrol HUVECs ved 30 min (A) og 2 h (D), huvecs behandlet med 0,2 μg/ml chalcone ved 30 min (B) og 2 h (E), og Huvecs behandlet med 2 μg/ml chalcone ved 30 min (C) og 2 h (F). Scale bar repræsenterer enkeltlags diameter på 1,25 mm. Color bar repræsenterer understreger i PA. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: sammenligning af RMS distraktionerne og intercellulære belastninger i HUVEC monolag og virkningen af chalcone behandling på HUVEC Gap Junction Cx43 strukturer. Plots af gennemsnitlig normal intercellulære stress (A), maksimal forskydning intercellulære stress (B) og RMS distraktionerne (C) viser virkningen af chalcone doser (0,2 μg/ml og 2 μg/ml) på HUVEC monolag sammenlignet med kontrol. Fejllinjer viser standardfejl. Det blev konstateret, at resultaterne var statistisk signifikante (stikprøvestørrelse = 6 øer med et konfidensniveau på 95%) ved hjælp af begge t-tests sammenlignet med kontrol (p < 0,05) og enkelt faktor ANOVA (p < 0,05). I separate retter, immunofarvning blev udført 5 h efter tilsætning af lægemidlet til øer af celler bosat på bløde 1,2 kPa hydrogels. Den grønne farve repræsenterer Cx43 og blå repræsenterer DAPI (Nucleus). Panel D skildrer følgende: kontrol (E, H), 0,2 μg/ml Chalcone behandlede celler (F, I) og 2μg/ml Chalcone-behandlede celler (G, J). Scale bar = 200 μm, mål = 20x. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1: høj opløsning Cx43 farvning i HUVEC-monolayers. Faste HUVEC-monolag blev plettet for Cx43 (grøn) og Nucleus (dapi, blå) for at observere den dosisafhængige effekt af chalcone. Højere forstørrelses billeder (63x mål) afslører Cx43 lokalisering meste omkring kernen (tydeligt fra grøn fluorescens intensitet). Vist er kontrol (A-C), 0,2 μg/ml chalcone-behandlede celler (D-F) og 2 μg/ml chalcone-behandlede celler (G-I). Scale bar = 100 μm, objektiv = 63x olie nedsænkning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

1200 PA 870 PA 1 kPa 4 kPa 6,3 kPa 11 kPa 90 kPa 150 kPa
Opløsning sammensætning 0,05% BIS 0,1% BIS 0,03% BIS 0,1% BIS 0,03% BIS 0,07% BIS 0,3% BIS 0,6% BIS
5,5% acryl 2% acryl 5% acryl 5% acryl 10% acryl 10% acryl 12% acryl 12% acryl
Ultra rent vand 12,49 mL 13,38 mL 12,78 mL 12,255 mL 10,905 mL 10,63 mL 8,30 mL 5,9 mL
40% acrylamid 2,062 mL 750 μL 1,875 mL 1,875 mL 3,75 ml 3,75 mL 4,5 mL 4,5 mL
2% BIS acrylamid 375 μL 750 μL 225 μL 750 μL 225 μL 525 μL 2,12 mL 4,5 mL
Fluroduft perler (0,2 μm eller 0,5 μm) 80 μL 80 μL 80 μL 80 μL 80 μL 80 μL 80 μL Tractions er ikke målbare

Tabel 1: polyacrylamid gel gør formuleringer til forskellige Youngs moduli.

Volumen Tykkelse Dækglas
20 mm SL-brønd Tyk 500 μL ~ 1 mm 25 mm
Tynd 24 μL ~ 100 μm 18 mm
14 mm SL-brønd Tyk 175 μL ~ 700 μm 18 mm
Tynd 10,3 μL ~ 100 μm 12 mm
14 mm 6-godt Tyk 280 μL ~ 1,5 mm 18 mm

Tabel 2: gel volumen og tykkelse.

Supplerende fil: MATLAB rutiner. Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vores gruppe, såvel som andre, har med succes brugt TFM og MSM til at sonde indflydelse af celle-celle vejkryds i forskellige patologiske og fysiologiske cellulære processer in vitro7,15,18,27 . For eksempel præsenterede Hardin et al. en meget indsigtsfuld undersøgelse, der tyder på intercellulære stress transmission guider paracellulære Gap dannelse i endotelceller15. Selv om det er muligt at relatere de Cx43-relaterede ændringer, vi rapporterer her til de ændringer, der rapporteres af Hardin et al., vi ikke specifikt adresse paracellular Gap formation i denne protokol. Her præsenterede vi en mekanik-baseret protokol til specifikt at målrette Gap Junction Cx43 og undersøge dens indflydelse på endotelal biomekanik.

For at gøre denne protokol vellykket, var der et par udfordringer, som vi var nødt til at overvinde, hvoraf nogle kunne forekomme, hvis andre forskere beslutter at vedtage vores protokol for lignende undersøgelser. En stor udfordring var at finde et optimalt chalcone-doseringsområde, hvor Cx43-ekspression kunne hæmmes, samtidig med at vores endotheliale monolag bevares intakt. IC50 af chalcone for HUVECs er tidligere blevet rapporteret til at være 10,01 μg/mL28. Men når vi udsat vores HUVEC monolag til flere chalcone koncentrationer spænder fra 0,2 μg/ml til 20 μg/ml, vi fandt en chalcone koncentration på 2 μg/ml for at være den højeste koncentration vores monolag kunne modstå mens stadig resterende confluent. En konflydende enkeltlags var afgørende for denne protokol, da en enkeltlags er nødvendig for at måle intercellulære belastninger ved hjælp af MSM. Dernæst udførte vi en immunofluorescens analyse for at afgøre, om de valgte doser af chalcone held forstyrret Cx43 struktur eller tilsyneladende udtryk. Vores resultat afslørede, at mens afbrydelse af Cx43 struktur med 0,2 μg/mL chalcone var visuelt vanskeligt at skelne fra kontrol, celler behandlet med 2 μg/mL chalcone syntes at vise en tilsyneladende forskel i Cx43 struktur og potentielt udtryk ( Figur 6D og supplerende figur 1). Desuden viste vores resultater, at Cx43 disruption faktisk påvirker endotel biomekanik ved at reducere distraktionerne og intercellulære belastninger ved sin højeste koncentration. Disse fund er efter aftale med Bazellieres et al., der viste hæmning af Cx43 med siRNA for også at reducere spor og intercellulære belastninger, men i et ark epitelceller27. Selv om vores resultater er i enighed med andre, skal det bemærkes, at molekyle vi plejede at forstyrre Cx43 udtryk, chalcone, er også blevet foreslået at påvirke aktivering af MAPK og NFkB ud over Cx43 disruption26. Derfor, da vi ikke specifikt se på de ovennævnte molekyler eller deres tilhørende veje, kan vi ikke udelukke den indflydelse, en potentiel MAPK og nfkb forstyrrelse kan have på endotel biomekanik så godt.

Et andet centralt punkt værd at nævne, er, at de genvundne spor og intercellulære belastninger er 2D i naturen og ignorere ud af flyet (z-retning) distraktionerne og intercellulære understreger12,13. Mens der er en lille fejl forbundet med at ignorere out-of-fly understreger, denne fejl er ubetydelig13. Desuden er den laterale dimension af enkeltlags tilstrækkelig stor (1,25 mm) i forhold til enkeltlags højde (~ 5 μm) sådan, at vi ikke ville forvente betydelige forskydninger i z-retningen. Desuden giver MSM-beregningen fejl ved grænsen på enkeltlags12,13. Men, Tambe et al. eksperimentelt viste, at fejlene er højest ved de optiske kanter (dvs. den enkeltlags grænse) og henfalder hurtigt distale fra grænse kanter13. Vi udfører micropatterning og beregner derefter intercellulære belastninger af hele enkeltlags for at undgå grænse fejl, der kan opstå under intercellulære stress beregning.

Monolayer stress mikroskopi udnyttes i denne protokol som den intercellulære stress information givet fra denne metode er afgørende for at have en mere komplet forståelse af rolle Gap Junction disruption har på endotelal biomekanik. Hertil kommer, at intercellulære belastninger er blevet foreslået at være vigtige i endotel barriere funktion, som foreslået af Hardin et al.15 og Krishnan et al.17, for eksempel. Desuden, mens intercellulære belastninger var korreleret til distraktionerne i de repræsentative data præsenteret her, dette er ikke altid tilfældet afhængigt af stimulus. I studiet af steward et al., for eksempel, endotel intercellulære belastninger viste sig at falde under væske forskydning, mens distraktionerne forblev relativt uændret7. Også den protokol, vi præsenterer her ikke giver mulighed for samtidig måling af celle-afledte mekaniske kræfter og farvning af kryds og fokale sammenvoksninger, men en sådan tilføjelse ville være gratis til denne protokol. Til sidst, den protokol, vi præsenterer her beskriver en mekanik-baserede metode til at undersøge den indflydelse, Cx43 har udelukkende på endotelal biomekanik, specifikt endotheliale celle-afledte kræfter. Vi mener, at vores mekanik-baserede protokol kan bruges sammen med eksisterende biologisk baserede protokoller til at give virkelig banebrydende arbejde i marken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af University of Central Florida start-up fonde og national Heart, Lung, og Blood Institute af National Institute of Health under Award K25HL132098.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm coverslip ThermoFisher 18CIR-1 Essential to flatten polyacrylamide gels
2% bis-acrylamide BIO-RAD 1610143 Component of polyacrylamide gel
2′,5′-Dihydroxychalcone SIGMA IDF00046 To disrupt Cx43 structure
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate SIGMA 2530-85-0 Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water
40% Acrylamide BIO-RAD 1610140 Component of polyacrylamide gel
Acetic acid Fisher-Sceintific 64-19-7 Essential to make bind saline solution
Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; ThermoFisher Catalog # A-11001 Secondary antibody
Ammonium persulfate BIO-RAD 1610700 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA 9048-46-8 To make blocking solution
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL Advance Biomatrix 5005-100ML Use as a extracellular matrix
Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) Fisher-Sceintific 21040CV Buffer Saline needed for cell culture
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents Fisher-Sceintific 67-68-5 To dissolve chalcone and make stock solution
Fluoromount-G with DAPI ThermoFisher 00-4959-52 Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI
Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads ThermoFisher F8812 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids
HEPES buffer solution 1 M SIGMA 7365-45-9 Essential to
LVES ThermoFisher A1460801 Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200 ThermoFisher M200500 Essential media for HUVEC cell culture
Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1) ThermoFisher Catalog #13-8300 Primary antibody for Cx43
Petri dish (35 mm dia) CellVis D35-20-1.5H 35 mm petri dish with a 20 mm center well
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg Proteochem 102568-43-4 Essential to functionalize polyacrylamide gel surface
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW corning 2646340 Silicon elastomer with curing agent to make PDMS
TEMED BIO-RAD 1610801 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Triton-X 100 SIGMA 9002-93-1 To permeabilize cells
Trypsin -EDTA ThermoFisher 25300054 Used to detach cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
  2. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  3. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  4. Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
  5. Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
  6. Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
  7. Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
  8. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
  9. Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
  10. Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
  11. Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
  12. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  13. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
  14. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
  15. Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
  16. Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
  17. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
  18. Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
  19. Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
  20. Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  21. Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
  22. Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
  23. Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
  24. Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
  25. Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).
  26. Lee, Y. N., et al. 2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
  27. Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
  28. Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).

Tags

Biokemi trækkraft mikroskopi enkeltlags stress microskopi mechanobiology Gap Junction Cx43 intercellulære stress
Perturbing Endothelial biomekanik via Connexin 43 strukturel forstyrrelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Islam, M. M., Steward, Jr., R. L.… More

Islam, M. M., Steward, Jr., R. L. Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption. J. Vis. Exp. (152), e60034, doi:10.3791/60034 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter