Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Perturbing endothelial biomekanikk via Connexin 43 strukturelle avbrudd

Published: October 4, 2019 doi: 10.3791/60034
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of Central Florida, 2Burnett School of Biomedical Sciences, College of Medicine, University of Central Florida

Summary

Her presenterer vi en mekanikk-basert protokoll for å forstyrre gapet knutepunkt connexin 43 og måle den påfølgende effekten dette har på endothelial biomekanikk via observasjon av tractions og intercellulære påkjenninger.

Abstract

Endothelial celler har blitt etablert for å generere intercellulære påkjenninger og tractions, men rolle gapet kryss spille i endothelial intercellulære stress og trekkraft generasjon er foreløpig ukjent. Derfor presenterer vi her en mekanikk-basert protokoll for å granske påvirkning av gap Junction connexin 43 (Cx43) har på endothelial biomekanikk ved å utsette confluent endothelial monolagere til en kjent Cx43 inhibitor 2,5-dihydroxychalcone (kalkon) og måle effekten denne hemmer har på tractions og intercellulære påkjenninger. Vi presenterer representative resultater, som viser en nedgang i både tractions og intercellulære påkjenninger under en høy kalkon dose (2 μg/mL) sammenlignet med kontroll. Denne protokollen kan brukes til ikke bare Cx43, men også andre gap veikryss i tillegg, forutsatt at riktig inhibitor brukes. Vi tror denne protokollen vil være nyttig innen hjerte-og mechanobiology forskning.

Introduction

Feltet som refererer til studiet av virkningene av fysiske krefter og av mekaniske egenskaper på cellulære og vev fysiologi og patologi er kjent som mechanobiology1. Noen nyttige teknikker som har blitt benyttet i mechanobiology er monolag stress mikroskopi og trekkraft kraft mikroskopi. Traction Force mikroskopi tillater beregning av tractions generert på cellen-substrat grensesnitt, mens monolag stress mikroskopi tillater beregning av intercellulære påkjenninger generert mellom tilstøtende celler i en monolag2 ,3,4,5,6. Resultater gitt fra tidligere metoder har antydet at celle-avledet mekaniske påkjenninger spille en avgjørende rolle i å bestemme skjebnen til en rekke cellulære prosesser3,4,5. For eksempel, ved eksponering for en ekstern mekanisk kraft, en gruppe celler migrerer som en kollektiv kan endre sin morfologi og polariserer deres form til å justere og migrere langs retningen av anvendt kraft ved, delvis genererer tractions7, 8i den. Tractions gi en beregning som kan brukes til å evaluere celle contractility og beregnes ved hjelp av traction Force mikroskopi (TFM). Traction Force mikroskopi (TFM) begynner med fastsettelse av celle-indusert substrat deformasjoner etterfulgt av beregning av trekkraft feltet ved hjelp av en matematisk streng, mekanikk-baserte beregningsorientert tilnærming. Siden evnen til å beregne tractions har eksistert i ganske lang tid, har forskerne benyttet TFM å avdekke virkningen tractions har på en rekke prosesser, inkludert kreft9, såret healing10 og vurdering av konstruert CARDIAC vev11.

Implementering av TFM og MSM sammen kan deles inn i tre viktige trinn som må utføres i følgende rekkefølge: først hydrogel deformasjoner produsert av cellene bestemmes; andre, tractions utvinnes fra hydrogel deformasjoner; og for det tredje brukes en endelig element tilnærming til å beregne normal og skjær intercellulære spenninger i hele monolag. For å beregne gel forskyvninger, fluorescens perle bilder med celler ble sammenlignet med referanse perle bildet (uten celler) ved hjelp av en tilpasset skrevet partikkel bilde velocimetry (PIV) rutine. Størrelsen på kryss korrelasjons vinduet og overlappingen for PIV-analyse ble valgt til henholdsvis 32 x 32 piksler og 0,5. På denne tid, pixel Skift var omvendt i mikron av multiplisere med en pixel-å-mikron omdanne faktoren (for våre mikroskop, denne omdanne faktoren er 0,65) å få inne-plan forskyvninger. Feil forbundet med ignorerer ut-av-plan forskyvninger er ubetydelig12,13. Etter beregning av gel forskyvninger, er det to typer trekkraft målinger som kan utnyttes, begrenset tractions og ubegrenset tractions8,14. Ubegrenset tractions gir trekkraft feltet for hele synsfeltet (inkludert regioner med og uten celler), mens begrensede tractions gir trekkraft feltet bare for regioner som inneholder celler14. Deretter intercellulære spenninger beregnes ved hjelp av monolag stress mikroskopi (MSM), som er en forlengelse av traction Force mikroskopi. Implementering av MSM er basert på antagelsen om at lokale tractions utøves av en monolag av celler på cellen substrat-grensesnittet må balanseres av mekaniske krefter som overføres mellom cellene på celle-celle-grensesnittet som kreves av Newtons lover7 ,12,13. En viktig forutsetning her er at celle monolag kan behandles som et tynt elastisk ark fordi trekkraft fordelingen i monolag er kjent og kraftbalansen ikke er avhengig av celle materialets egenskaper. En annen viktig forutsetning er at trekkraft kreftene er balansert av lokale intercellulære påkjenninger innenfor det optiske synsfeltet (innenfor monolag) og innflytelsen av denne kraftbalansen er minimal i den ytre regionen (utenfor monolag)13. Grense forholdene som er definert av intercellulære påkjenninger, forskyvninger eller en kombinasjon av begge ved monolag grense, er derfor avgjørende for å utføre MSM13. Tatt i betraktning ovennevnte opplysninger, bruker vi MSM å utføre en endelig element analyse (FEM) for å gjenopprette den maksimale viktigste stress (σMax) og minimum viktigste stress (σmin) ved å rotere stress planet på hvert punkt i monolag. Disse viktigste påkjenninger blir senere brukt til å beregne 2D gjennomsnittlig normal intercellulære stress [(σMax + σmin)/2] og 2D maksimal skjær intercellulære stress [(σMax -σmin)/2] innenfor hele monolag 12,13. Denne fremgangsmåten er beskrevet i mer detalj av Tambe et al.12,13

Monolag stress mikroskopi (MSM) tillater beregning av celle-celle intercellulære påkjenninger generert i en monolag6,7,8,12,13. Disse intercellulære påkjenninger har blitt foreslått å være viktig for vev vekst og reparasjon, sår helbredelse, og kreft metastasering12,15,16,17. I tillegg har intercellulære påkjenninger blitt foreslått å også være viktig i endothelial celle migrasjon og endothelial barrierefunksjon17,18. Mens celle-celle veikryss som tette veikryss og adherens knutepunkter har begge blitt foreslått å spille en avgjørende rolle i endothelial intercellulære stress generasjon og overføring, er rollen som gap knutepunkter fortsatt unnvikende. Gap knutepunkter fysisk koble tilstøtende celler og gi en vei for elektrisk strøm og molekyler (< 1 KDa) å passere mellom nabocellene19,20,21. Selv om endothelial Cells Express Cx37, Cx40, og Cx43 gap veikryss19,22, Cx43 er uten tvil det viktigste i forhold til sykdomsprogresjon23. Bevis på Cx43's betydning kan bli funnet i det faktum at genetisk sletting av Cx43 i mus resulterer i hypotensjon24 og har uheldige virkninger på angiogenese25. I tillegg har Cx43 blitt dokumentert å være viktig for celle migrasjon og spredning og i progresjon av aterosklerose18,22,23,24,25 .

I denne protokollen, vi brukte TFM og MSM å undersøke om trekkraft og intercellulære stress generasjon innenfor confluent, endothelial monolag ville bli påvirket av forstyrrelsen av endothelial gap Junction Cx43. Vi forstyrret Cx43 med 2,5-dihydroxychalcone (kalkon), et molekyl dokumentert å hemme Cx43 uttrykk26. Kalkon ble brukt til å forstyrre Cx43 i stedet for siRNA som kalkon har blitt rapportert tidligere av Lee et al. å forstyrre Cx43 uttrykket26. I tillegg var vi spesielt interessert i kalkon innflytelse på endotelet som det har også blitt rapportert å være en anti-inflammatorisk og anti-plate sammensatte som kan potensielt brukes til forebygging og behandling av ulike vaskulære patologi26. Kalkon behandlinger ble utført en time etter forsøket utbruddet, kalkon-behandlet monolagere ble avbildet i totalt seks timer, og bildebehandling ble utført med en tilpasset skrevet MATLAB kode for å bestemme tractions og senere intercellulære Understreker. Våre resultater viste en generell nedgang i tractions og intercellulære påkjenninger, antyder Cx43 spiller en nøkkelrolle i endothelial biomekanikk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Making polyakrylamid (PA) gels

  1. Utarbeidelse av Petri parabol
    1. Forbered bind silan oppløsning ved å blande 200 mL ultrarent vann med 80 μL eddiksyre og 50 μL av 3-(trimethoxysilyl) propyl akrylat. Bind silan er en løsning som brukes til å funksjonalisere glass bunnen Petri parabolen overflaten for hydrogel vedlegg.
    2. Rør bind silan løsningen på en rør plate i minst 1 time.
    3. Unn sentrum brønn av Petri parabolen med bind silan løsning for 45 min.
    4. Fjern bind silan løsning og skyll Petri parabolen med ultra-rent vann 2x-3x.
    5. Tørk Petri parabolen overflaten og oppbevar ved romtemperatur for fremtidig bruk.
  2. Utarbeidelse av hydrogel løsning
    1. Bland ultra-rent vann, 40% akrylamid og 2% BIS-akrylamid i et 15 mL sentrifugerør i henhold til tabell 1.
    2. Tilsett 80 μL av fluorescerende perler i den hydrogel løsningen.
    3. Rist røret forsiktig for å blande perler med gel-løsningen.
    4. Stram slange korken lett på sentrifuge slangen og plasser den i et vakuum kammer.
    5. Degas av gel løsning for minst 45 min i vakuum kammer.
  3. Hydrogel polymerisering
    1. Først tilsett 75 μL av 10% ammonium persulfate (oppløst i ultra-rent vann) og tilsett deretter 8 μL av TEMED (N, N, N ', N'-tetramethylethane-1, 2-diamin) til hydrogel løsningen.
    2. Sted 24 μL av hydrogel løsning i midten av Petri fatet (se tabell 2).
    3. Bruk en 18 mm dekkglass til å flate hydrogel. Dette vil gi en høyde på ~ 100 μm.
    4. Vent minst 30-40 min for gel polymerisering.
    5. Senk polymerisert hydrogel i ultra-rent vann for å forhindre gel dehydrering.
    6. Dekk Petri parabolen med aluminiumsfolie for å hindre photobleaching av fluorescerende perler og lagre ved 4 ° c.
      Merk: Hydrogeler kan lagres en periode på opptil 3 måneder, men det er antydet at disse gels brukes ikke lenger enn 1 uke etter fabrikasjon å oppnå de beste resultatene.

2. cellekultur

  1. Kultur menneskelige navle vene endothelial celler (HUVECs) i cellekultur medium 200 (se tabell over materialer) supplert med 1% penicillin-streptomycin på 0,1% gelatin-belagt flasker ved 37 ° c og 5% co2.

3. Micropattern sjablong forberedelse

  1. Cure et tynt lag av Polydimethylsiloxan (PDMS) i en 100 mm Petri parabolen ved å blande silikon base med silikon herding agent i forholdet 20:1 (Base: herding agent).
    Merk: det er mulig å bruke andre base til å kurere agent forhold (ex. 10:1 eller 30:1). Men en lavere base for herding agent ratio vil gi en stivere mønster, mens en høyere base for herding agent ratio vil produsere en mykere mønster.
  2. Forbered en 20:1 (Base: herding agent) PDMS løsning og bland forsiktig i et 50 mL sentrifugerør. Inverter røret opp ned og rist kraftig flere ganger for å sikre riktig blanding av PDMS løsning, som uniformt miksing vil resultere i ufullstendige polymerisering.
  3. Fjern bobler som har blitt innført fra ovenstående trinn ved sentrifugering PDMS-løsningen i 1 min ved 190 x g.
  4. Hell 5-6 mL PDMS-oppløsning i midten av en 100 mm Petri-rett og agitere fatet til PDMS-løsningen dekker hele Petri-parabolen.
  5. Cure PDMS løsningen over natten ved 50-60 ° c. PDMS kan også kureres ved romtemperatur.
  6. Fjern en sirkulær, 16 mm diameter PDMS sjablong med et hull puncher.
  7. Bruk en biopsi punch for å lage små hull i PDMS sjablongen. Denne protokollen bruker en 1,25 mm diameter biopsi punch.
  8. Sterilisere PDMS sjablonger ved først submerging dem i 70% etanol for 2-3 min, aspirating av overflødig etanol og deretter plassere under et UV-lys i 5 min.

4. kollagen-I hydrogel belegg

  1. Fjern dekkglass fra hydrogel og aspirer overflødig væske.
  2. Plasser PDMS-sjablongen på den hydrogel overflaten.
    Merk: pinsett kan brukes til å påføre lett trykk på PDMS sjablong for å sikre en vanntett forsegling mellom PDMS sjablong og hydrogel overflate. Våre PDMS sjablonger er vanntette og dermed hindre vann tilgang mellom gel toppen overflaten og PDMS sjablong bunn overflaten. Dessuten trenger ikke hydrogel stivhet justeres med hensyn til PDMS stivhet.
  3. Dekk til hydrogel overflate med sulfosuccinimidyl-6-(4-azido-2-nitrophenylamino) hexanoate (sulfo-SANPAH) oppløst i en 0,1 M HEPES (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid) buffer løsning ved en konsentrasjon på 1:1000 og plasser under en UV lampe (strøm 36 W) i 8 min.
  4. Aspirer det overskytende sulfo-SANPAH og HEPES løsning og skyll hydrogel to ganger med 0,1 M HEPES etterfulgt av ytterligere to skyllinger med ultra-rent vann.
  5. Aspirer overflødig ultra-rent vann og pels hydrogeler med 0,1 mg/mL kollagen-I over natten ved 4 ° c.
  6. Dekk rettene og Beskytt fluorescerende perler fra photobleaching.
    Merk: PDMS-sjablonger brukes til å lage micropatterned monolagere. Micropatterned monolagere benyttes som de tillater flere monolagere av samme geometri og dimensjoner som skal observeres samtidig under hvert eksperiment. Men bør micropatterns ikke være ønsket trinnene ovenfor kan følges med unntak av trinn 4,2.

5. opprette HUVEC monolagere på hydrogeler

  1. Bruk 1x Trypsin å løsne celler fra vev kultur kanner for 3-5 min i inkubator.
  2. Etter trypsinization legger du cellekultur medier til Trypsin løsningen og legger til 15 mL sentrifuge røret.
  3. Sentrifuger celle løsningen i 3 minutter ved 1710 x g. En liten, hvit pellet av celler skal være synlig på bunnen av sentrifuge røret.
  4. Aspirer supernatanten og resuspend celler i Media til en konsentrasjon på 50 x 104 celler/ml.
  5. Fjern kollagen-I fra hydrogel og skyll 1x med PBS.
  6. Tilsett 75 x 103 celler til toppen av PDMS sjablong og Tillat celler å feste til hydrogel overflate i minst 1 t i inkubator ved 37 ° c og 5% co2.
  7. Fjern PDMS sjablongen og Legg til minst 2 mL Media til Petri parabolen. Senk PDMS sjablong i 10x Trypsin å fjerne eventuelle vedlagte celler og sterilisere ved sprøyting med 70% etanol og deretter plassere under UV-lys i 5 min.
  8. Plasser Petri parabolen i inkubator og vente minst 36 h eller til en confluent monolag er observert.

6.2,5 dihydroxychalcone behandling for Cx43 avbrudd

  1. Oppløse 2, 5 dihydroxychalcone (kalkon) i dimetylsulfoksid (DMSO) for å lage en 0,1875 mg/mL lagerløsning.
  2. Fortynne lager løsningen med cellekultur medier for å gjøre en lav kalkon konsentrasjon (0,2 μg/mL) alikvot og en høy kalkon konsentrasjon (2 μg/mL) alikvot.

7. innhenting av data

  1. Finn celle øyer med mikroskop.
  2. Tilegne seg fase kontrast og perle bilder til bilde celle morfologi og hydrogel forskyvninger, henholdsvis.
    Merk: denne protokollen brukte et 10x mål for datainnsamling.
  3. På slutten av eksperimentet, koble celler med 10x Trypsin og få et bilde av gel overflaten uten celler (referanse bilde).

Åttende Immunostaining

  1. Fix monolagere med 4% formaldehyd og ruge ved 37 ° c i 15 min.
  2. Fjern 4% formaldehyd og tilsett 0,2% Triton X-100 i 5 min ved 37 ° c til permeabilize celler.
  3. Fjern 0,2% Triton X-100 og skyll monolagere med PBS 2x-3x.
  4. Dekk monolag med 2% serum albumin (BSA) løsning for 45 min ved 37 ° c.
  5. Fjern 2% BSA-oppløsningen og skyll monolagere med PBS 2x-3x.
  6. Tilsett primært Cx43-antistoff ved en konsentrasjon på 1:400 til prøven og ruge over natten ved 4 ° c.
  7. Fjern primær antistoff og skyll prøven med PBS 2x-3x.
  8. Tilsett sekundært antistoff ved en konsentrasjon på 3:200 og ruge for 2 timer ved 37 ° c.
    Merk: prøvene bør dekkes for å forhindre photobleaching.
  9. Fjern sekundær antistoff og skyll med PBS 2x-3x.
  10. Dekk prøve med festemiddel (Fluromount-G DAPI) og forsegle med en 18 mm deksel slip.

9. implementering av traction Force mikroskopi (TFM) og monolag stress mikroskopi (MSM)

  1. Hydrogel deformasjon beregning
    Merk: en trinnvis forskyvning prosedyren ved hjelp av MATLAB er gitt nedenfor.
    1. Åpne hoved trekkraft. m filen i MATLAB (for alle MATLAB rutiner se supplerende materialer).
      Merk: Følg instruksjonene som er oppgitt i koden for å angi MATLAB-katalogen.
    2. Definer følgende variabler: bildeformat, piksel-til-mikron-konvertering, Young-modul, Poisson-forhold og objektiv for mikroskop.
    3. Finn perlen, Trypsin bildet og fase bildet ved hjelp av OpenFiles -delrutine.
      Merk: for store datasett er det best å navngi filer i sekvensiell rekkefølge. For eksempel filer skal hete "filnavn1. tif", "filnavn2. tif", osv.
    4. Definer en kvadratisk ROI (interesseområde) rundt celle monolag, og utfør cell_cropper -rutinen for å beskjære det opprinnelige bildet.
    5. Utfør displacement_finder -rutinen for å beregne forskyvninger.
    6. Utfør Dedrift -delrutine for å fjerne eventuelle ekstra ikke-cellulære forskyvninger som kan være på grunn av mikroskop scenen drift.
  2. Beregning av tractions
    Merk: her ubegrenset tractions er beregnet ved hjelp av vår egendefinerte skrevet MATLAB rutine. Steg for steg trekkraft beregningen ved hjelp av MATLAB rutinen tidligere nevnt er gitt nedenfor.
    1. Definer følgende variabler i traction. m -rutinen: Begrensnings tilstand, gel-tykkelse, gel-høyde og dedrift.
    2. Utfør traction_finder -rutinen for å beregne tractions og kjøre plot_traction -rutinen for å tegne tractions. Alle tractions inne x-ledelsen (TX) og y-ledelsen (ty) jevnsides med deres tilsvarende pixel plasseringene kan grunnlegge inne en traction. dat arkiv det vill være utviklet av koden.
  3. Beregning av intercellulære påkjenninger
    Merk: steg for steg instruksjoner for intercellulære stress beregningen ved hjelp av MATLAB rutinen tidligere nevnt er gitt nedenfor.
    1. Kjør mark_circular_domain -rutinen for å angi monolag grense. Denne rutinen vil be alle beskjæres fase bilder sekvensielt for brukeren å manuelt tegne en grense rundt monolag. Hold et notat av nXPts generert i kommandovinduet og bruke dem senere som rutenett parametre i både X-aksen og Y-aksen for FEM-analyse (se trinn 9.3.2).
    2. Utfør Run_StressCode for å beregne intercellulære påkjenninger. Denne delrutine leser direkte parametre fra "model.in" fil og utfører "Island. exe" for å utføre FEM analyse. Før du kjører denne rutinen, må du kontrollere at alle parametere i Model.in -filen, det vil si rutenett parametere i X og Y, piksel til mikron konvertering, Youngs modul av gelen, Poisson-forholdet, monolag høyde og monolag mønster (stripe eller hull), redigeres Riktig.
    3. Plot alle FEM resultater ved hjelp av plot_FEM_results -rutine.
      Merk: alle genererte resultater vil automatisk bli lagret i resultat mappen i MATLAB-katalogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bilde av kontroll av fase kontrast, 0,2 μg/mL og 2 μg/mL kalkon behandlede monolagere ble tatt 30 minutter før behandling med kalkon (figur 1A-C) og 2 timer etter kalkon behandling (fig. 1D-F). Celle induserte perle forskyvninger (μm) ble observert å avta i både lav dose kalkon og høye dose kalkon forhold (figur 2E, F) sammenlignet med kontroll HUVEC monolagere (figur 2D). Før kalkon behandling, RMS tractions var rundt 51 ± 8 PA (Figur 3A-C) for alle forhold. Etter kalkon behandling, var det en liten økning i RMS tractions til 59 ± 11 pa i en lav dose kalkon behandlet monolagere (Figur 3E) og en nesten 2-fold nedgang i RMS tractions til 18 ± 2 i høy dose kalkon behandlet monolagere ( Figur 3F) sammenlignet med kontrollen (Figur 3D). Før kalkon behandling, gjennomsnittlig normal intercellulære påkjenninger var rundt 220 ± 66 PA (Figur 4A-C). Etter kalkon behandling, var det en økning i gjennomsnittlig normal intercellulære stress omfanget til 285 ± 75 pa med lav dose kalkon behandling (Figur 4E) men en betydelig nedgang i gjennomsnitt normal intercellulære stress størrelse til 106 ± 4 pa med høy dose kalkon behandling (Figur 4F) sammenlignet med kontroll gjennomsnittlig normal intercellulære påkjenninger (235 ± 18 pa, Figur 4D). Maksimal skjær intercellulære påkjenninger var rundt 241 ± 30 PA (figur 5A-C) før kalkon behandling, men etter kalkon behandling, var det en nedgang til 227 ± 20 pa ved lav kalkon konsentrasjon (figur 5E) og en ytterligere nedgang i maksimal skjær intercellulære stress omfanget til 91 ± 6 pa ved høy kalkon konsentrasjon behandling (figur 5F) i forhold til kontroll maksimal skjær intercellulære påkjenninger (270 ± 30 pa, figur 5D ). Analysen av tractions og intercellulære påkjenninger er presentert i figur 6A-C. Alle plottet resultatene ble testet for statistisk betydning (t-test og enkel faktor ANOVA test), og i begge testene resultatene ble funnet å være statistisk signifikant (p < 0,05) når uavhengig sammenligne 0,2 μg/ml kalkon konsentrasjon og 2 μg/mL-kalkon for å kontrollere forholdene (uten kalkon).

Figure 1
Figur 1: representative fase kontrast bilder av HUVEC-monolagere. Eksempel fase kontrast bilder av kontroll HUVECs ved 30 min (A) og 2 h (D), fase kontrast bilder av HUVECs behandlet med 0,2 μg/ml kalkon ved 30 min (B) og 2 h (E), og fase kontrast bilder av HUVECs behandlet med 2 μg/ml kalkon ved 30 min. (C) og 2 h (F) ved utbruddet av eksperimentet. Scale bar representerer den monolag diameter på 1,25 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: illustrasjon av Forskyvnings felt produsert av HUVEC monolagere. Representative forskyvninger (μm) av kontroll HUVECs ved 30 min (A) og 2 h (D), HUVECs behandlet med 0,2 μg/ml kalkon ved 30 min (B) og 2 h (E), og HUVECs behandlet med 2 μg/ml kalkon ved 30 min (C) og 2 h (F) utbruddet av eksperimentet. Skala bar representerer monolag diameter på 1,25 mm. Color bar representerer forskyvninger i μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: RMS trekkraft fordeling i HUVEC monolagere. Eksempel på RMS tractions (PA) av kontroll, 0,2 μg/mL kalkon, og 2 μg/mL kalkon HUVECs før kalkon behandling (A-C) og etter en time med kalkon behandling (D-F), henholdsvis. Skala bar representerer monolag diameter på 1,25 mm. fargelinjen representerer RMS-tractions i PA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: gjennomsnittlig normal intercellulære stress-fordeling i HUVEC-monolagere. Gjennomsnittlig normal intercellulære trykk (PA) fordeling av kontroll HUVECs ved 30 min (A) og 2 h (D), HUVECs behandlet med 0,2 μg/ml kalkon ved 30 min (B) og 2 h (E), og HUVECs behandlet med 2 μg/ml kalkon ved 30 min (C) og 2 h (F). Scale bar representerer monolag diameter på 1,25 mm. Color bar representerer spenninger i PA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: maksimal skjær intercellulære stress fordeling i HUVEC monolagere. Maksimal skjær intercellulære trykk (PA) fordeling av kontroll HUVECs ved 30 min (A) og 2 h (D), HUVECs behandlet med 0,2 μg/ml kalkon ved 30 min (B) og 2 h (E), og HUVECs behandlet med 2 μg/ml kalkon ved 30 min (C) og 2 h (F). Scale bar representerer monolag diameter på 1,25 mm. Color bar representerer spenninger i PA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: sammenligning av RMS tractions og intercellulære spenninger i HUVEC monolagere og virkningen av kalkon behandling på HUVEC gap Junction Cx43 strukturer. Plott av gjennomsnittlig normal intercellulære stress (A), maksimal skjær intercellulære stress (B) og RMS tractions (C) viser virkningen av kalkon doser (0,2 μg/ml og 2 μg/ml) på HUVEC monolagere sammenlignet med kontroll. Feil stolper viser standard feil. Resultatene ble funnet å være statistisk signifikant (utvalgsstørrelse = 6 øyer, med et sikkerhetsnivå på 95%) med begge t-testene sammenlignet med kontroll (p < 0,05) og enkel faktor Anova (p < 0,05). I separate retter ble immunostaining utført 5 h etter tilsetning av stoffet for øyer av celler som bor på myke 1,2 kPa hydrogeler. Den grønne fargen representerer Cx43 og blå representerer DAPI (nucleus). Panel D viser følgende: kontroll (E, H), 0,2 μg/ml kalkon behandlede celler (F, I) og 2μg/ml kalkon behandlede celler (G, J). Scale bar = 200 μm, objektiv = 20x. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1: høy oppløsning Cx43 farging i HUVEC monolagere. Fast HUVEC monolagere var farget for Cx43 (grønn) og nucleus (DAPI, blå) for å observere dose avhengig effekt av kalkon. Høyere forstørrelse bilder (63x objektiv) avslører Cx43 lokalisering meste rundt kjernen (tydelig fra grønne fluorescens intensitet). Vist er kontroll (A-C), 0,2 μg/ml kalkon behandlede celler (D-F) og 2 μg/ml kalkon behandlede celler (G-I). Scale bar = 100 μm, objektiv = 63x olje nedsenking. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1200 av pappa 870 av pappa 1 kPa 4 kPa 6,3 kPa 11 kPa 90 kPa 150 kPa
Sammensetning av løsning 0,05% BIS 0,1% BIS 0,03% BIS 0,1% BIS 0,03% BIS 0,07% BIS 0,3% BIS 0,6% BIS
5,5% akryl 2% akryl 5% akryl 5% akryl 10% akryl 10% akryl 12% akryl 12% akryl
Ultra rent vann 12,49 mL 13,38 mL 12,78 mL 12,255 mL 10,905 mL 10,63 mL 8,30 mL 5,9 mL
40% akrylamid 2,062 mL 750 μL 1,875 mL 1,875 mL 3,75 ml 3,75 mL 4,5 mL 4,5 mL
2% BIS akrylamid 375 μL 750 μL 225 μL 750 μL 225 μL 525 μL 2,12 mL 4,5 mL
Fluroscent perler (0,2 μm eller 0,5 μm) 80 μL 80 μL 80 μL 80 μL 80 μL 80 μL 80 μL Tractions er ikke målbare

Tabell 1: polyakrylamid gel gjør formuleringer for ulike Youngs moduli.

Volum Tykkelse Dekkglass
20 mm SL brønn Tykk 500 μL ~ 1 mm 25 mm
Tynn 24 μL ~ 100 μm 18 mm
14 mm SL brønn Tykk 175 μL ~ 700 μm 18 mm
Tynn 10,3 μL ~ 100 μm 12 mm
14 mm 6-brønn Tykk 280 μL ~ 1,5 mm 18 mm

Tabell 2: gel volum og tykkelse.

Tilleggsfil: MATLAB-rutiner. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vår gruppe, så vel som andre, har vært vellykket ved hjelp av TFM og MSM å granske påvirkning av celle-celle veikryss i ulike patologiske og fysiologiske cellulære prosesser in vitro7,15,18,27 . For eksempel Hardin et al. presentert en svært innsiktsfull studie som antyder intercellulære stress overføring guider paracellular gap dannelse i endothelial celler15. Mens det er mulig å relatere Cx43-relaterte endringer vi rapportere her til endringene som rapporteres av Hardin et al., vi ikke spesifikt adresse paracellular gap formasjon i denne protokollen. Her presenterte vi en mekanikk-basert protokoll for å spesifikt målrette gapet krysset Cx43 og undersøke dens innflytelse på endothelial biomekanikk.

For å gjøre denne protokollen vellykket, var det noen utfordringer som vi måtte overvinne, hvorav noen kan oppstå bør andre forskere bestemmer seg for å vedta vår protokoll for lignende studier. En stor utfordring var å finne en optimal kalkon dose område hvor Cx43 uttrykk kunne bli hemmet, samtidig holde våre endothelial monolagere intakt. IC50 av kalkon for HUVECs har tidligere blitt rapportert å være 10,01 μg/mL28. Men da vi utsatte våre HUVEC-monolagere for flere kalkon konsentrasjoner fra 0,2 μg/mL til 20 μg/mL, fant vi en kalkon konsentrasjon på 2 μg/mL for å være den høyeste konsentrasjonen våre monolagere kunne tåle, mens den fortsatt gjenstår confluent. En confluent monolag var avgjørende for denne protokollen, som en monolag er nødvendig for å måle intercellulære påkjenninger ved hjelp av MSM. Deretter utførte vi en immunofluorescence analysen for å avgjøre om de valgte doser av kalkon vellykket forstyrret Cx43 struktur eller tilsynelatende uttrykk. Resultatet viste at mens forstyrrelse av Cx43 struktur med 0,2 μg/mL kalkon var visuelt vanskelig å skille fra kontroll, viste celler behandlet med 2 μg/mL kalkon seg for å vise en åpenbar forskjell i Cx43 struktur og potensielt uttrykk ( Figur 6D og supplerende figur 1). I tillegg viste våre resultater at Cx43 avbrudd faktisk påvirker endothelial biomekanikk ved å redusere tractions og intercellulære påkjenninger på sitt høyeste konsentrasjon. Disse funnene er enige med Bazellieres et al. som viste demping av Cx43 med siRNA å også redusere tractions og intercellulære påkjenninger, men i et ark med epitelceller27. Selv om våre resultater er enige med andre bør det bemerkes at molekylet vi brukte til å forstyrre Cx43 uttrykk, kalkon, har også blitt foreslått å påvirke aktivering av MAPK og NFkB i tillegg til Cx43 avbrudd26. Derfor, siden vi ikke spesielt se på ovennevnte molekyler eller deres tilknyttede trasé, kan vi ikke utelukke påvirke en potensiell MAPK og NFkB forstyrrelsene kan ha på endothelial biomekanikk også.

Et annet viktig poeng verdt å nevne er at de gjenopprettede tractions og intercellulære påkjenninger er 2D i naturen og ignorere ut av flyet (z-retning) tractions og intercellulære spenninger12,13. Mens det er en liten feil knyttet ignorerer ut-av-fly spenninger, er denne feilen ubetydelig13. I tillegg er den laterale dimensjonen av monolag tilstrekkelig stor (1,25 mm) i forhold til monolag høyde (~ 5 μm) slik at vi ikke ville forvente betydelige forskyvninger i z-retning. Videre tilbyr MSM-beregningen feil ved monolag grense12,13. Imidlertid viste Tambe et al. eksperimentelt at feil er høyest i de optiske kantene (dvs. monolag grense) og henfall raskt kan fjernes fra grense kantene13. Vi utfører micropatterning og deretter beregne intercellulære påkjenninger av hele monolag for å unngå grense feil som kan oppstå under intercellulære stress beregningen.

Monolag stress mikroskopi benyttes i denne protokollen som intercellulære stress informasjon gitt fra denne metoden er avgjørende for å få en mer fullstendig forståelse av rolle gapet knutepunkt avbrudd har på endothelial biomekanikk. I tillegg intercellulære påkjenninger har blitt foreslått å være viktig i endothelial barrierefunksjon, som foreslått av Hardin et al.15 og Krishnan et al.17, for eksempel. Videre, mens intercellulære påkjenninger ble korrelert til tractions i representative data som presenteres her, er dette ikke alltid tilfelle avhengig av stimulans. I studiet av forvalteren et al., for eksempel, endothelial intercellulære påkjenninger ble vist å redusere under Fluid skjær, mens tractions forble relativt uendret7. Dessuten tillater protokollen vi presenterer her ikke for samtidig måling av celle-avledet mekaniske krefter og farging av veikryss og fokal adhesjon, men et slikt tillegg vil være gratis til denne protokollen. Til slutt, den protokollen vi presenterer her beskriver en mekanikk-basert metode for å undersøke innflytelsen Cx43 har utelukkende på endothelial biomekanikk, spesielt endothelial celle-avledet styrker. Vi tror at vår mekanikk-baserte protokoll kan brukes sammen med eksisterende biologiske protokoller for å gi virkelig banebrytende arbeid på området.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av University of Central Florida oppstart midler og National Heart, Lung, og Blood Institute of National Institute of Health under prisen K25HL132098.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm coverslip ThermoFisher 18CIR-1 Essential to flatten polyacrylamide gels
2% bis-acrylamide BIO-RAD 1610143 Component of polyacrylamide gel
2′,5′-Dihydroxychalcone SIGMA IDF00046 To disrupt Cx43 structure
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate SIGMA 2530-85-0 Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water
40% Acrylamide BIO-RAD 1610140 Component of polyacrylamide gel
Acetic acid Fisher-Sceintific 64-19-7 Essential to make bind saline solution
Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; ThermoFisher Catalog # A-11001 Secondary antibody
Ammonium persulfate BIO-RAD 1610700 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA 9048-46-8 To make blocking solution
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL Advance Biomatrix 5005-100ML Use as a extracellular matrix
Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) Fisher-Sceintific 21040CV Buffer Saline needed for cell culture
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents Fisher-Sceintific 67-68-5 To dissolve chalcone and make stock solution
Fluoromount-G with DAPI ThermoFisher 00-4959-52 Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI
Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads ThermoFisher F8812 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids
HEPES buffer solution 1 M SIGMA 7365-45-9 Essential to
LVES ThermoFisher A1460801 Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200 ThermoFisher M200500 Essential media for HUVEC cell culture
Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1) ThermoFisher Catalog #13-8300 Primary antibody for Cx43
Petri dish (35 mm dia) CellVis D35-20-1.5H 35 mm petri dish with a 20 mm center well
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg Proteochem 102568-43-4 Essential to functionalize polyacrylamide gel surface
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW corning 2646340 Silicon elastomer with curing agent to make PDMS
TEMED BIO-RAD 1610801 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Triton-X 100 SIGMA 9002-93-1 To permeabilize cells
Trypsin -EDTA ThermoFisher 25300054 Used to detach cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
  2. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  3. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  4. Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
  5. Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
  6. Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
  7. Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
  8. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
  9. Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
  10. Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
  11. Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
  12. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  13. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
  14. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
  15. Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
  16. Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
  17. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
  18. Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
  19. Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
  20. Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  21. Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
  22. Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
  23. Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
  24. Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
  25. Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).
  26. Lee, Y. N., et al. 2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
  27. Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
  28. Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).

Tags

Biokjemi utgave 152 traction Force mikroskopi monolag stress mikroskopi mechanobiology gap Junction Cx43 intercellulære stress
Perturbing endothelial biomekanikk via Connexin 43 strukturelle avbrudd
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Islam, M. M., Steward, Jr., R. L.… More

Islam, M. M., Steward, Jr., R. L. Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption. J. Vis. Exp. (152), e60034, doi:10.3791/60034 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter