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Biochemistry

コネクシン43構造破壊による内皮バイオメカニクスの摂動

doi: 10.3791/60034 Published: October 4, 2019

Summary

ここでは、ギャップ接合コネクシン43を破壊する力学ベースのプロトコルを提示し、トラクションと細胞間応力の観察を通じて内皮バイオメカニクスに及ぼすその後の影響を測定する。

Abstract

内皮細胞は細胞間ストレスやトラクションを生成するために確立されているが、内皮細胞間ストレスおよびトラクション生成におけるギャップ接合が果たす役割は現在知られていない。そこで、我々は、公知のCx43阻害剤2,5−ジヒドロキシカルボン(カルコン)にコンフルエント内皮単層を露出することにより、ギャップ接合コネクシン43(Cx43)が内皮バイオメカニクスに及ぼす影響を調べるための力学ベースのプロトコルを提示する。この阻害剤がトラクションおよび細胞間ストレスに与える影響を測定する。我々は、対照と比較した場合、高いカルコーン投与量(2 μg/mL)の下でトラクションと細胞間ストレスの両方の減少を示す代表的な結果を提示する。このプロトコルは、Cx43だけでなく、適切な阻害剤が使用されると仮定して、他のギャップジャンクションにも適用できます。このプロトコルは、心臓血管およびメカノバイオロジー研究の分野で有用であると考えています。

Introduction

細胞および組織の生理学および病理学に対する物理的な力および機械的特性の影響の研究を指す分野は、メカノバイオロジー1として知られている。メカノバイオロジーで利用されているいくつかの有用な技術は、単層ストレス顕微鏡と牽引力顕微鏡です。トラクション力顕微鏡は、細胞基板界面で生成されたトラクションの計算を可能にする一方、単層応力顕微鏡は、単層2内の隣接する細胞間で発生する細胞間ストレスの計算を可能にする。 ,3,4,5,6.以前の方法から得られた結果は、細胞由来の機械的ストレスが細胞プロセス3、4、5のホストの運命を決定する上で重要な役割を果たしていることを示唆している。例えば、外部の機械的力にさらされると、集団として移動する細胞のグループは、その形態を変更し、その形状を偏光させ、加えた力の方向に沿って整列し、移動することができ、部分的には、牽引を発生させる7、 8.トラクションは、細胞収縮性を評価するために使用できるメトリックを提供し、牽引力顕微鏡(TFM)を使用して計算されます。トラクション力顕微鏡(TFM)は、細胞誘発基板変形の決定から始まり、数学的に厳格な力学ベースの計算アプローチを用いて牽引場の計算を行います。トラクションを計算する能力はかなり長い間あるので、研究者はTFMを利用して、がん9、創傷治癒10、工学的心臓の評価を含む多くのプロセスに対するトラクションの影響を明らかにしました。ティッシュ11.

TFMとMSMの実装は、次の順序で実行する必要がある3つの重要なステップに分けることができます:最初に、細胞によって生成されるヒドロゲル変形が決定されます。第二に、トラクションはヒドロゲル変形から回収されます。第三に、有限要素アプローチは、単層全体の中で正常およびせん断間のストレスを計算するために使用されます。ゲル変位を計算するために、細胞を用いた蛍光ビーズ画像を、カスタム書き込み粒子画像ベロシメトリー(PIV)ルーチンを用いて参照ビーズ画像(細胞なし)と比較した。PIV解析の交差相関ウィンドウサイズとオーバーラップは、それぞれ32 x 32ピクセルと0.5ピクセルに選択されました。このとき、ピクセルシフトを、ピクセルからミクロンへの変換係数を乗算してミクロンに変換し(顕微鏡の場合、この変換係数は0.65)、平面内変位を得た。平面外の変位を無視に関連するエラーは、ごくわずか12,13です。ゲル変位の計算後、利用できるトラクション測定には、拘束されたトラクションと非拘束トラクション8、14の2種類があります。拘束されていないトラクションは、視野全体(セルの有無にかかわらず)のトラクションフィールドを提供し、拘束された牽引はセル14を含む領域に対してのみ牽引フィールドを提供します。次に、細胞間ストレスは、牽引力顕微鏡の延長である単層応力顕微鏡(MSM)を用いて計算される。MSMの実装は、ニュートンの法則7で要求されているように、細胞界面で細胞間で伝達される機械的力によって、細胞の単層によって発揮される局所的な牽引力のバランスをとらなければならないという仮定に基づいている7 1213.ここでの重要な仮定は、単層における牽引分布が知られており、力のバランスが細胞材料特性に依存しないため、セル単層を薄い弾性シートとして扱うことができるということです。もう一つの重要な仮定は、牽引力が光学視野内(単層内)内の局所細胞間応力によってバランスされ、この力バランスの影響は遠位領域(単層の外側)13において最小限である。したがって、細胞間応力、変位、または単層境界における両方の組み合わせによって定義される境界条件は、MSM13を実行するために重要である。上記の情報を考慮して、MSMを使用して有限要素解析(FEM)を実行し、最大主応力(σmax)と最小主応力(σ力)を回復し、単層。これらの主応力は、その後、2D平均法線間間応力[(σmax + σmin)/2]および2D最大せん断間応力[(σmax - σmin)/2]を単層全体で計算するために使用されます。12、13.この手順については、Tambe et al.12,13 によって詳細に説明されています。

単層ストレス顕微鏡(MSM)は、単層6、7、8、12、13内で生成される細胞細胞間ストレスの計算を可能する。これらの細胞間ストレスは、組織の成長および修復、創傷治癒、および癌転移12、15、16、17にとって重要であることが示唆されている。また、細胞間ストレスは、内皮細胞移動および内皮バリア機能17,18においても重要であることが示唆されている。タイトジャンクションや接着接合部などの細胞間接合部は、細胞間ストレスの生成と伝達において重要な役割を果たすることが示唆されているが、ギャップ接合部の役割は依然として不明である。ギャップ接合部は、隣接する細胞を物理的に接続し、隣接する細胞19、20、21の間を通過する電流および分子(<1 KDa)の経路を提供する。内皮細胞はCx37、Cx40、およびCx43ギャップ接合部19、22、Cx43を発現するが、間違いなく疾患進行23の点で最も重要である。Cx43の重要性の証拠は、マウスにおけるCx43の遺伝的欠失が低血圧24を生じ、血管新生25に悪影響を及ぼすという事実で見出されうる。さらに、Cx43は、細胞の移動および増殖およびアテローム性動脈硬化症の進行において重要であることが文書化されている18、22、23、24、25.

このプロトコルでは、TFMとMSMを用いて、コンフルエント内のトラクションおよび細胞間ストレス発生が、内皮単層が内皮ギャップ接合部Cx43の破壊によって影響を受けるかどうかを調べた。我々は、2,5−ジヒドロキシカルゾン(カルコーン)でCx43を破壊し、Cx43発現26を阻害する分子である。カルコーンは、Cx43式26を破壊するために以前にLeeらによって報告されているように、siRNAの代わりにCx43を破壊するために使用された。また、様々な血管の予防と治療に使用できる抗炎症および抗血小板化合物であることが報告されているため、カルコンが内皮に与える影響に特に関心を持っていました。病理26.カルコーン処理は実験開始の1時間後に行い、カルコーン処理単層を合計6時間画像化し、画像処理をカスタム書き込みMATLABコードで行い、トラクションを決定し、その後細胞間を決定した。応力。我々の結果は、トラクションと細胞間ストレスの全体的な減少を示し、Cx43が内皮バイオメカニクスにおいて重要な役割を果たすことを示唆した。

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Protocol

1. ポリアクリルアミド(PA)ゲルの製造

  1. ペトリ皿の調製
    1. 200 mLの超純水を80μL酢酸と50μLの3-(トリメトキシシル)プロピルメタクリレートと混合して結合シラン溶液を調製する。バインドシランは、ヒドロゲル取り付け用のガラス底ペトリ皿表面を機能させるために使用される溶液である。
    2. 少なくとも1時間攪拌プレート上のバインドシラン溶液をかき混ぜます。
    3. 45分間、バインドシラン溶液でペトリ皿の中心をよく扱います。
    4. バインドシラン溶液を除去し、超純粋な水2x-3xでペトリ皿をすすいでください。
    5. ペトリ皿表面を乾燥させ、将来の使用のために室温で保管してください。
  2. ヒドロゲル溶液の調製
    1. 表1に従って、15 mL遠心管に超純水、40%アクリルアミド、および2%ビスアクリルアミドを混合する。
    2. ヒドロゲル溶液に80μLの蛍光ビーズを添加します。
    3. チューブをそっと振り、ビーズとゲル溶液を混ぜます。
    4. 遠心管のチューブキャップを軽く締め、真空チャンバに入れます。
    5. 真空チャンバで少なくとも45分間ゲル溶液を脱気する。
  3. ヒドロゲル重合
    1. まず、10%のツル酸アンモニウム(超純水に溶解)の75 μLを加え、8 μLのTEMED(N、N'、N'、N'-テトラメチルタン-1,2-ジアミン)をヒドロゲル溶液に加えます。
    2. ペトリ皿の中心に24 μLのヒドロゲル溶液を置きます(表2参照)。
    3. ヒドロゲルを平らにするには、18 mm のカバースリップを使用します。これは〜100 μmの高さを与える。
    4. ゲル重合のために少なくとも30-40分待ちます。
    5. ゲル脱水を防ぐために、超純水に重合されたヒドロゲルを浸します。
    6. ペトリ皿をアルミホイルで覆い、蛍光ビーズの光漂白を防ぎ、4°Cに保管してください。
      注:ヒドロゲルは、最大3ヶ月の期間を保存することができますが、最良の結果を得るために製造後1週間以内にこれらのゲルを使用することをお勧めします。

2. 細胞培養

  1. 細胞培養培地200におけるヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を37°Cおよび5%CO2で0.1%ゼラチン被覆フラスコに1%ペニシリン-ストレプトマイシンで補成した。

3. マイクロパターンステンシル製剤

  1. シリコーンベースとシリコーン硬化剤を20:1の比で混合して100mmペトリ皿にポリジメチルシロキサン(PDMS)の薄層を硬化させる(ベース:硬化剤)。
    注:硬化剤比(例:10:1または30:1)に他の塩基を使用することが可能です。ただし、硬化剤比に対するベースが低いほど硬いパターンが得られ、硬化剤比に対するベースが高いほど柔らかいパターンが生成されます。
  2. 20:1(ベース:硬化剤)PDMS溶液を準備し、50 mL遠心管で慎重に混ぜます。チューブを逆さまに反転し、PDMS溶液の適切な混合を確実にするために、複数回激しく振ると、不均一な混合は不完全な重合をもたらす。
  3. 190 x gで1分間PDMS溶液を遠心分離することにより、上記のステップから導入された気泡を除去します。
  4. 100 mm ペトリ皿の中央に 5-6 mL の PDMS 溶液を注ぎ、PDMS 溶液がペトリ皿表面全体を覆うまで皿を攪拌します。
  5. 50-60 °Cで一晩PDMS溶液を硬化します。PDMSは室温で硬化することもできる。
  6. 穴パンチャーで円形の直径16mmのPDMSステンシルを取り外します。
  7. 生検パンチを使用して、PDMSステンシルに小さな穴を作ります。このプロトコルは1.25のmmの直径の生検のパンチを使用する。
  8. PDMSステンシルを最初に70%エタノールに2~3分間浸し、余分なエタノールを吸引し、次に5分間UV光の下に置くことによって殺菌する。

4. コラーゲン-Iヒドロゲルコーティング

  1. ヒドロゲルからカバースリップを取り外し、余分な液体を吸引します。
  2. PDMSステンシルをヒドロゲル表面に置きます。
    注:ピンセットは、PDMSステンシルとヒドロゲル表面の間の水密シールを確保するために、PDMSステンシルに光圧を適用するために使用することができます。私たちのPDMSステンシルは水密であるため、ゲル上面とPDMSステンシル底面との間の水アクセスを防ぎます。また、ヒドロゲル剛性は、PDMS剛性に対して調整する必要はありません。
  3. ヒドロゲル表面をスルホスクシニミジル-6-(4-azido-2-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート(スルホ-SANPAH)で0.1M HEPES(4-(2-ヒドロキシチル)-1-ピペラジネエタンスルホン酸)緩衝液を1の濃度で1:10の濃度で覆うランプ(電源36 W)を8分間使用します。
  4. 過剰なスルフォ-SANPAHおよびHEPES溶液を吸引し、0.1 M HEPESでヒドロゲルを2回すすいで、その後、超純水でさらに2回のすすが続きます。
  5. 余分な超純水を吸引し、0.1 mg/mLコラーゲン-Iを4°Cで一晩使用します。
  6. 皿を覆い、蛍光ビーズを光漂白から守ります。
    注: PDMS ステンシルは、マイクロパターン化された単層を作成するために使用されます。マイクロパターン化された単層は、各実験中に同じ形状と寸法の複数の単層を同時に観察できるように利用されます。ただし、マイクロパターンが望ましくない場合は、ステップ 4.2 を除き、上記の手順に従うことができます。

5. ヒドロゲル上にHUVEC単層を作成する

  1. 1xトリプシンを使用して、インキュベーターで3〜5分間組織培養フラスコから細胞を切り離します。
  2. トリプシン化後、トリプシン溶液に細胞培養培養培養培養培養液を加え、15 mL遠心管に添加する。
  3. 1710 x gで3分間の細胞溶液を遠心分離する。細胞の小さな白いペレットは遠心管の底部に見えるべきである。
  4. 上清を吸引し、培中の細胞を50 x 104細胞/mLの濃度に再中断する。
  5. ヒドロゲルからコラーゲン-Iを取り出し、PBSで1xをすすいで下します。
  6. PDMSステンシルの上部に75 x 103セルを追加し、37°Cおよび5%CO2のインキュベーターで少なくとも1時間ヒドロゲル表面に細胞を付着させます。
  7. PDMSステンシルを取り外し、ペトリ皿に少なくとも2 mLのメディアを追加します。PDMSステンシルを10倍トリプシンに沈め、付属の細胞を除去し、70%のエタノールで噴霧し、5分間UV光の下に置くことによって殺菌します。
  8. ペトリ皿をインキュベーターに入れ、少なくとも36時間またはコンフルエント単層が観察されるまで待ちます。

6. Cx43破壊に対する2,5ジヒドロキシカルゾン処理

  1. ジメチルスルホキシド(DMSO)に2,5ジヒドロキシカルゾン(カルコン)を溶解し、0.1875 mg/mLストック溶液を作ります。
  2. 細胞培養培地でストック溶液を希釈し、低カルコーン濃度(0.2 μg/mL)のアリコートと高いカルコーン濃度(2μg/mL)のアリコートを作ります。

7. データ取得

  1. 顕微鏡で細胞島を探す。
  2. 相コントラストとビーズ画像を画像細胞形態およびヒドロゲル変位にそれぞれ取得する。
    注: このプロトコルは、データ取得に 10 倍の目的を使用しました。
  3. 実験の最後に、10倍トリプシンで細胞を剥離し、細胞を使わずにゲル表面の画像を取得する(参考画像)。

8. 免疫染色

  1. 4%ホルムアルデヒドで単層を固定し、37°Cで15分間インキュベートします。
  2. 4%ホルムアルデヒドを除去し、細胞を透過させるために37°Cで5分間0.2%トリトンX-100を追加します。
  3. 0.2%のトリトンX-100を取り外し、PBS 2x-3xで単層をすすいで下します。
  4. 2%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液で単層を37°Cで45分間覆う。
  5. 2%のBSA溶液を取り出し、PBS 2x-3xで単層をすすいで下します。
  6. 1:400の濃度で一次Cx43抗体を試料に添加し、4°Cで一晩インキュベートする。
  7. 一次抗体を除去し、PBS 2x-3xでサンプルをすすいで下します。
  8. 3:200の濃度で二次抗体を追加し、37°Cで2時間インキュベートします。
    注:サンプルは、光漂白を防ぐためにカバーする必要があります。
  9. 二次抗体を取り除き、PBS 2x-3xですすいで下します。
  10. 取り付け媒体(Fluromount-G DAPI)と18 mmカバースリップでシールしてサンプルをカバーします。

9. トラクション力顕微鏡(TFM)及び単層ストレス顕微鏡(MSM)の実施

  1. ヒドロゲル変形計算
    注: MATLAB を使用したステップバイステップの変位計算手順を以下に示します。
    1. MATLAB でメイントラクション.mファイルを開きます(すべての MATLAB ルーチンについては、補足資料を参照してください)。
      注: MATLAB ディレクトリを設定するには、コードに記載されている指示に従ってください。
    2. 画像フォーマット、ピクセル対ミクロン変換、ヤング率、ポアソン比、顕微鏡の目的:次の変数を定義します。
    3. OpenFilesサブルーチンを使用して、ビード、トリプシン イメージ、およびフェーズ イメージを見つけます。
      注: 大きなデータ・セットの場合は、ファイルに順番に名前を付けることをお知りください。たとえば、ファイルの名前は "filename1.tif" "filename2.tif" などです。
    4. セル単一層の周囲に正方形の ROI (対象領域) を定義し、cell_cropperサブルーチンを実行して元のイメージをトリミングします。
    5. 変位を計算するには、変位_finderサブルーチンを実行します。
    6. Dedriftサブルーチンを実行して、顕微鏡ステージドリフトに起因する可能性のある追加の非細胞変位を除去します。
  2. トラクションの計算
    注: ここでは、制約のないトラクションは、カスタム記述された MATLAB ルーチンを使用して計算されます。前述の MATLAB ルーチンを使用したステップ バイ ステップ トラクション計算を以下に示します。
    1. トラクション.mルーチン内で次の変数を定義します: 境界条件、ゲルの厚さ、ゲルの高さ、およびドリフト解除。
    2. トラクションを計算し、トラクションをプロットするためにplot_tractionサブルーチンを実行するために、トラクションを実行します。X 方向 (Tx) と Y 方向 (Ty) のすべてのトラクションと対応するピクセル位置は、コードによって生成される traction.dat ファイルにあります。
  3. 細胞間応力の計算
    注: 前述の MATLAB ルーチンを使用した細胞間ストレス計算のステップバイステップの指示を以下に示します。
    1. mark_circular_domainサブルーチンを実行して、単層境界を指定します。このルーチンは、ユーザーがモノレイヤーの周りに手動で境界を描画するように、すべてのトリミングされたフェーズ イメージを順番に求める。コマンド ウィンドウで生成された nXPts をメモし、FEM 解析用の X 軸と Y 軸の両方のグリッド パラメータとして後で使用します (ステップ 9.3.2 を参照)。
    2. Run_StressCodeを実行して、細胞間応力を計算します。このサブルーチンは、"model.in" ファイルからパラメーターを直接読み取り、FEM 分析を実行するために "island.exe" を実行します。このルーチンを実行する前に、model.inファイル内のすべてのパラメータ、すなわちXとYのグリッドパラメータ、ピクセルからミクロン変換、ゲルのヤングの係数、ポアソンの比率、単層の高さ、および単層パターン(ストリップまたは穴)が編集されていることを確認してください。正しく。
    3. plot_FEM_resultsサブルーチンを使用して、すべての FEM 結果をプロットします。
      注: 生成されたすべての結果は、MATLAB ディレクトリの結果フォルダーに自動的に保存されます。

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Representative Results

対照の相コントラスト画像は、0.2 μg/mL、および2μg/mLカルコーン処理単層を、カルコーン処理の30分前(図1A-C)およびカルコーン処理後2時間後に撮影した(図1D-F)。細胞誘導ビーズ変位(μm)は、HUVEC単層を対照した場合に低用量カルコーンおよび高用量カルコーン条件の両方で減少することが観察された(図2E,F)。カルコーン処理の前に、rmsトラクションは、すべての条件について約51±8 Pa(図3A-C)であった。カルモン処理後、低用量カルコーン処理単層(図3E)ではrmsトラクションが59±11Paに小さく増加し、高用量カルモン処理単層ではrmsトラクションが18±2にほぼ2倍減少しました(図3F)を対照と比較した(図3D)。カルモン治療の前に、平均正常細胞間ストレスは約220±66Pa(図4A-C)であった。カルモン治療後、低用量カルモン治療で平均正常細胞間ストレスの大きさが285±75Paに増加した(図4E)が、平均正常細胞間ストレスの大きさは106に有意に減少した。±4 Pa高用量カルコーン処理(図4F)を対照平均正常細胞間ストレスと比較した場合(235±18Pa、図4D)。最大せん断細胞間ストレスは、カルコーン処理前に241±30Pa(図5A-C)であったが、カルコーン処理後、低カルコーン濃度で227±20Paに減少した(図5E)。高カルコーン濃度治療における最大せん断間ストレスの最大減少率91±6Pa(図5F)を対照比で最大せん断細胞間ストレス(270±30Pa、図5D)).トラクションと細胞間ストレスの分析を図6A-Cに示す。すべてのプロットされた結果は、統計的有意性(t検定および単一因子分散分析)について試験され、両方の試験結果では、0.2 μg/mLカルコーン濃度と2を個別に比較した場合、統計的に有意であることが判明しました(p< 0.05)。μg/mLカルコーンは、条件を制御する(カルボンなし)。

Figure 1
図1:HUVEC単層の代表的な位相コントラスト画像。30分(A)および2h(D)での制御HUVECの位相コントラスト画像、0.2 μg/mLカルコーンで処理したHUVECの位相コントラスト画像(B)および2h(E))、および2 μg/mLカルコーンで処理したHUVECの位相コントラスト画像実験発症の30分(C)および2時間(F)で。スケールバーは1.25mmの単層直径を表し、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。

Figure 2
図2:HUVEC単層によって生成された変位場の図。30分(A)および2h(D)での制御HUVECの代表的な変位(μm)、HUVECを30分(B)および2h(E)で0.2μg/mLカルコーンで処理し、HUVECを30分(C)および2h(F)で2μg/mLカルコーンで処理した。実験の発症。スケールバーは1.25mmの単層直径を表し、カラーバーはμmの変位を表します。

Figure 3
図 3: HUVEC 単層における RMS トラクション分布。コントロールのrmsトラクション(Pa)の例、0.2 μg/mLカルコーン、および2 μg/mLカルコーンHUVECの前にカルコーン処理(A-C)および1時間後のカルコーン処理(D-F)の後。スケールバーは1.25mmの単層直径を表し、カラーバーはPa.のRMSトラクションを表し、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。

Figure 4
図4:HUVEC単層における平均正規細胞間ストレス分布30分(A)および2h(D)での制御HUVECの平均正常細胞間ストレス(Pa)分布、0.2 μg/mLカルコーンで30分(B)および2h(E)で処理したHUVEC、およびHUVECを30分(C)で2 μg/mLカルコーンで処理したHUVECそして2時間(F)。スケールバーは1.25mmの単層直径を表し、カラーバーはPa.の応力を表し、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。

Figure 5
図5:HUVEC単層における最大せん断細胞間応力分布最大せん断細胞間応力(Pa)30分(A)及び2h(D)での制御HUVECの分布、0.2μg/mLカルコーンで30分(B)及び2h(E)で処理したHUVEC、およびHUVECを30分(C)で2μg/mLカルコーンで処理し、2 h(F)スケールバーは1.25mmの単層直径を表し、カラーバーはPa.の応力を表し、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。

Figure 6
図6:HUVEC単層におけるRMSトラクションと細胞間ストレスの比較とHUVECギャップ接合部Cx43構造に対するカルボン処理の影響平均正常細胞間ストレス(A)、最大せん断間細胞間ストレス(B)およびRMSトラクション(C)のプロットは、制御と比較してHUVEC単層に対するカルコン用量(0.2 μg/mLおよび2 μg/mL)の影響を示す。エラー バーには標準エラーが表示されます。結果は統計的に有意であることが判明しました(サンプルサイズ = 6つの島、信頼水準は95%)コントロール(p<0.05)と単一因子分散分析(p<0.05)の両方のt検定を使用します。 別々の皿では、免疫染色は、軟部1.2kPaヒドロゲル上に存在する細胞の島に対する薬剤の添加後5時間を行った。緑色は Cx43 を表し、青は DAPI (核) を表します。パネルDは、対照(E,H)、0.2μg/mLカルコーン処理細胞(F,I)および2μg/mLカルコーン処理細胞(G,J)を示す。スケールバー = 200 μm、目的 = 20x。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Supplementary Figure 1
補足図1:HUVEC単層における高解像度Cx43染色。固定HUVEC単層をCx43(緑色)および核(DAPI、青色)に染色し、カルコンの用量依存効果を観察した。高い倍率画像(63倍の目的)は、主に核の周りにCx43局在化を明らかにする(緑色蛍光強度から明らか)。示されているのは対照(A-C)、0.2μg/mLカルコーン処理細胞(D-F)および2μg/mLカルコーン処理細胞(G-I)である。スケールバー = 100 μm、目的 = 63x オイル浸漬。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

1200パ 870パ 1 kPa 4 kPa 6.3 kPa 11 kPa 90 kPa 150 kPa
溶液組成 0.05% BIS 0.1% BIS 0.03% BIS 0.1% BIS 0.03% BIS 0.07% BIS 0.3% BIS 0.6% BIS
5.5% アクリル 2% アクリル 5% アクリル 5% アクリル 10% アクリル 10% アクリル 12% アクリル 12% アクリル
超純水 12.49 メートル 13.38 メートル 12.78 メートル 12.255メートル 10.905メートル 10.63メートル 8.30 mL 5.9 mL
40% アクリルアミド 2.062 mL 750 μL 1.875メートル 1.875メートル 3.75ミリリットル 3.75 メートル 4.5 mL 4.5 mL
2% BISアクリルアミド 375 μL 750 μL 225 μL 750 μL 225 μL 525 μL 2.12 mL 4.5 mL
フルロセントビーズ (0.2 μm または 0.5 μm) 80 μL 80 μL 80 μL 80 μL 80 μL 80 μL 80 μL トラクションは測定可能ではありません

表1:異なるヤングモジュリの製剤を作るポリアクリルアミドゲル。

ボリューム 厚さ カバースリップ
20 mm sl ウェル 厚い 500 μL ~1ミリメートル 25ミリメートル
薄い 24 μL ~100 μm 18 ミリメートル
14 mm sl ウェル 厚い 175 μL ~700 μm 18 ミリメートル
薄い 10.3 μL ~100 μm 12 ミリメートル
14ミリメートル6ウェル 厚い 280 μL ~1.5ミリメートル 18 ミリメートル

表2:ゲルの体積と厚さ。

補足ファイル: MATLAB ルーチン。このファイルを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。

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Discussion

我々のグループは、他のグループと同様に、TFMおよびMSMを使用して、インビトロ7、15、18、27における様々な病理学的および生理学的細胞プロセスにおける細胞接合部の影響を調べている。.例えば、Hardinらは、細胞間ストレス伝達が内皮細胞における準細胞間ギャップ形成を示唆する非常に洞察に満ちた研究を提示した15。ここで報告するCx43関連の変化をHardinらによって報告された変化に関連づけることは可能ですが、このプロトコルにおける細胞間ギャップ形成には特に取り組みはありません。ここでは、ギャップ接点Cx43を具体的に標的とし、内皮バイオメカニクスに及ぼす影響を調べるための力学ベースのプロトコルを提示した。

このプロトコルを成功させるためには、克服しなければならない課題がいくつかありましたが、他の研究者が同様の研究のためにプロトコルを採用することを決定した場合に発生する可能性があります。大きな課題は、Cx43発現を阻害できる最適なカルコーン線量範囲を見つけ、同時に内皮単層をそのまま維持することであった。HUVEC用カルコーンのIC50は、以前に10.01 μg/mL28であると報告されている。しかし、HUVEC単層を0.2μg/mLから20μg/mLの範囲の複数のカルコン濃度に曝露したところ、2μg/mLのカルコン濃度が、モノレイヤーが耐えうる最高濃度であることがわかった。MSMを用いて細胞間ストレスを測定するには単層が必要なため、このプロトコルにはコンフルエント単層が不可欠でした。次に、選択したカルコーンの用量がCx43構造または明らかな発現を破壊したかどうかを決定するために免疫蛍光アッセイを行った。我々の結果は、0.2 μg/mLカルコーンを用いたCx43構造の破壊が制御と区別することは視覚的に困難であったが、2 μg/mLのカルコーンで処理された細胞は、Cx43構造と潜在的に発現の明らかな違いを示すように見えたことを明らかにした(図 6Dおよび補足図 1)さらに、我々の結果は、Cx43破壊が実際に最高濃度でトラクションと細胞間ストレスを減少させることによって内皮バイオメカニクスに影響を与えることを示した。これらの知見は、SiRNAを用いてCx43のサイレンシングを示したBazellieresらと一致しており、トラクションおよび細胞間ストレスを低減するが、上皮細胞27のシート中にある。我々の結果は他者と一致しているが、我々がCx43発現を破壊するために使用した分子、カルコーンは、Cx43破壊26に加えてMAPKおよびNFkBの活性化に影響を与えることも示唆されている。したがって、上記の分子やその関連経路を具体的に見ていなかったため、MAPKやNFkB摂動が内皮バイオメカニクスに与える影響を排除することはできません。

言及する価値のあるもう一つの重要なポイントは、回収されたトラクションと細胞間応力が本質的に2Dであり、平面(Z方向)トラクションと細胞間応力12、13を無視することです。平面外の応力を無視すると関連する小さなエラーがありますが、このエラーはごくわずかです 13.また、単層の横寸法は単層高さ(約5μm)に対して十分に大きく(1.25mm)、Z方向に大きな変位が期待できない。さらに、MSM 計算は単層境界12,13でエラーを提供します。しかし、Tambeらは実験的に、誤差が光学エッジ(すなわち、単層境界)で最も高く、境界エッジ13から素早く遠離して崩壊することを示した。マイクロパターニングを行い、単層全体の細胞間応力を計算し、細胞間ストレス計算中に発生する可能性のある境界誤差を回避します。

この方法から得られた細胞間ストレス情報は、内皮バイオメカニクスに対するギャップ接合破壊が及ぼす役割をより完全に理解するために不可欠であるとして、単層ストレス顕微鏡検査がこのプロトコルで利用されている。加えて、細胞間ストレスは、例えばHardin etal.15およびクリシュナンら17によって示唆されているように、内皮バリア機能において重要であることが示唆されている。さらに、細胞間応力は、ここで提示される代表的なデータのトラクションと相関していたが、これは必ずしも刺激に応じては限らない。スチュワードらの研究では、例えば、内皮間細胞間ストレスは流体せん断下で減少することが示され、トラクションは比較的変化しなかった7.また、ここで提示するプロトコルは、細胞由来の機械的力と接合部と焦点接着の染色の同時測定を可能にしませんが、そのような追加は、このプロトコルに無料になります。最後に、ここで提示するプロトコルは、Cx43が内皮バイオメカニクス、特に内皮細胞由来力に及ぼす影響を調べるための力学ベースの方法について説明する。私たちは、当社の力学ベースのプロトコルは、現在の生物学的ベースのプロトコルと組み合わせて使用することができ、現場で真に画期的な作業を提供することができると信じています。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

この研究は、セントラルフロリダ大学のスタートアップファンドと国立心臓、肺、および国立衛生研究所の賞K25HL132098の下で血液研究所によってサポートされました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm coverslip ThermoFisher 18CIR-1 Essential to flatten polyacrylamide gels
2% bis-acrylamide BIO-RAD 1610143 Component of polyacrylamide gel
2′,5′-Dihydroxychalcone SIGMA IDF00046 To disrupt Cx43 structure
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate SIGMA 2530-85-0 Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water
40% Acrylamide BIO-RAD 1610140 Component of polyacrylamide gel
Acetic acid Fisher-Sceintific 64-19-7 Essential to make bind saline solution
Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; ThermoFisher Catalog # A-11001 Secondary antibody
Ammonium persulfate BIO-RAD 1610700 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA 9048-46-8 To make blocking solution
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL Advance Biomatrix 5005-100ML Use as a extracellular matrix
Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) Fisher-Sceintific 21040CV Buffer Saline needed for cell culture
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents Fisher-Sceintific 67-68-5 To dissolve chalcone and make stock solution
Fluoromount-G with DAPI ThermoFisher 00-4959-52 Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI
Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads ThermoFisher F8812 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids
HEPES buffer solution 1 M SIGMA 7365-45-9 Essential to
LVES ThermoFisher A1460801 Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200 ThermoFisher M200500 Essential media for HUVEC cell culture
Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1) ThermoFisher Catalog #13-8300 Primary antibody for Cx43
Petri dish (35 mm dia) CellVis D35-20-1.5H 35 mm petri dish with a 20 mm center well
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg Proteochem 102568-43-4 Essential to functionalize polyacrylamide gel surface
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW corning 2646340 Silicon elastomer with curing agent to make PDMS
TEMED BIO-RAD 1610801 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Triton-X 100 SIGMA 9002-93-1 To permeabilize cells
Trypsin -EDTA ThermoFisher 25300054 Used to detach cells

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References

  1. Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
  2. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853, (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  3. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10, (23), 4047-4055 (2014).
  4. Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16, (4), 2633-2638 (2016).
  5. Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107, (3), 548-554 (2014).
  6. Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17, (3), (2019).
  7. Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308, (8), C657-C664 (2015).
  8. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
  9. Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9, (48), 19039-19044 (2017).
  10. Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, (9), 683-690 (2014).
  11. Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13, (3), e0194706 (2018).
  12. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10, (6), 469-475 (2011).
  13. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8, (2), e55172 (2013).
  14. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282, (3), C595-C605 (2002).
  15. Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495, (1), 749-754 (2018).
  16. Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29, (19), 2292-2302 (2018).
  17. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300, (1), C146-C154 (2011).
  18. Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
  19. Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11, (2), 251-266 (2009).
  20. Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2, (3), 1981-2035 (2012).
  21. Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62, (2), 228-232 (2004).
  22. Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62, (2), 345-356 (2004).
  23. Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818, (8), 1985-1992 (2012).
  24. Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (17), 9989-9994 (2001).
  25. Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284, (2), 479-498 (2005).
  26. Lee, Y. N., et al. 2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179, (1-2), 51-60 (2002).
  27. Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17, (4), 409-420 (2015).
  28. Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27, (6), 581-588 (2004).
コネクシン43構造破壊による内皮バイオメカニクスの摂動
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Islam, M. M., Steward, Jr., R. L. Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption. J. Vis. Exp. (152), e60034, doi:10.3791/60034 (2019).More

Islam, M. M., Steward, Jr., R. L. Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption. J. Vis. Exp. (152), e60034, doi:10.3791/60034 (2019).

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