Summary
Burada, connexin 43 arasındaki boşluk kavşağını bozacak ve bunun endotel biyomekaniği üzerindeki etkisini çekişler ve hücreler arası gerilimlerin gözlemi yoluyla ölçmek için mekanik tabanlı bir protokol salıyoruz.
Abstract
Endotel hücreleri hücreler arası gerilmeler ve çekişler oluşturmak için kurulmuştur, ancak endotel selüloz ve çekiş üretiminde rol boşluğu kavşakları oynamak şu anda bilinmemektedir. Bu nedenle, burada gap junction connexin 43 (Cx43) endotel biyomekanik üzerinde bilinen bir Cx43 inhibitörü 2,5-dihidroksichalcone (chalcone) ve confluent endotel monolayers maruz kalarak etkisini araştırmak için mekanik tabanlı bir protokol sasürdeyiz bu inhibitörün çekişler ve hücreler arası gerilmeler üzerindeki etkisini ölçmek. Kontrole kıyasla yüksek bir chalcone dozu (2 μg/mL) altında hem çekişlerde hem de hücreler arası streslerde azalma gösteren temsili sonuçlar salıyoruz. Bu protokol sadece Cx43'e değil, uygun inhibitörün kullanıldığı varsayarak diğer boşluk kavşaklarına da uygulanabilir. Bu protokolün kardiyovasküler ve mekanobiyoloji araştırma alanlarında yararlı olacağına inanıyoruz.
Introduction
Fiziksel kuvvetlerin ve mekanik özelliklerin hücresel ve doku fizyolojisi ve patolojisi üzerindeki etkilerinin incelenmesine atıfta bulunan alan mekobiyoloji1olarak bilinir. Mekanobiyolojide kullanılan birkaç yararlı teknik monolayer stres mikroskobu ve traksiyon kuvveti mikroskobutur. Çekiş kuvveti mikroskopisi hücre-substrat arabiriminde üretilen çekişlerin hesaplanmasına olanak sağlarken, monokatmanlı stres mikroskobu, tek katmanlı hücreler arasında oluşan hücreler arası gerilimlerin tek katmanlı olarak hesaplanmasına olanak sağlar2 ,3,4,5,6. Önceki yöntemlerden elde edilen sonuçlar hücre kaynaklı mekanik gerilmeler hücresel süreçlerin bir dizi kaderi belirlemede önemli bir rol oynadığını ileri sürmüşlerdir3,4,5. Örneğin, harici bir mekanik kuvvete maruz kaldıktan sonra, kolektif olarak göç eden bir grup hücre morfolojilerini değiştirebilir ve şekillerini polarize ederek, kısmen çekiş ler üreterek, uygulanan kuvvet inisi boyunca hizalayabilir ve göç edebilir. 8 . Çekişler hücre kontraksiyonu değerlendirmek için kullanılabilecek ve çekiş kuvveti mikroskobu (TFM) kullanılarak hesaplanan bir metrik sağlar. Traksiyon kuvveti mikroskobu (TFM), matematiksel olarak titiz, mekanik tabanlı hesaplamalı bir yaklaşımla çekiş alanının hesaplanmasının ardından hücre kaynaklı substrat deformasyonlarının belirlenmesiyle başlar. Çekiş hesaplama yeteneği oldukça uzun bir süre için yaklaşık olduğundan, araştırmacılar tfm etkileri çekişler bir dizi süreçler üzerinde ortaya çıkarmak için kullandık9, yara iyileşmesi10 ve mühendislik kardiyak değerlendirilmesi doku11.
TFM ve MSM'nin birlikte uygulanması aşağıdaki sırayla yürütülmesi gereken üç temel adıma ayrılabilir: birincisi, hücreler tarafından üretilen hidrojel deformasyonları belirlenir; ikincisi, çekişler hidrojel deformasyonlarından kurtarılır; ve üçüncüsü, sonlu elemanlar yaklaşımı tüm monolayer içinde normal ve makas hücreler arası gerilmeleri hesaplamak için kullanılır. Jel yer değiştirmelerini hesaplamak için, hücrelerle floresan boncuk görüntüleri, özel olarak yazılmış parçacık görüntüsü velocimetry (PIV) rutini kullanılarak referans boncuk görüntüsü (hücresiz) ile karşılaştırıldı. PIV analizi için çapraz korelasyon pencere boyutu ve çakışması sırasıyla 32 x 32 piksel ve 0,5 olarak seçilmiştir. Şu anda, piksel kaymaları bir piksel-mikron dönüştürme faktörü ile çarpılarak mikronlara dönüştürüldü (mikroskobumuz için, bu dönüşüm faktörü 0,65'tir) düzlem içi yer değiştirmeleri elde etmek için. Düzlem dışı yer değiştirmeleri yoksayma ile ilişkili hatalar ihmal edilebilir12,13. Jel deplasmanları hesaplandıktan sonra, kullanılabilir çekiş ölçümleri iki türü vardır, kısıtlı çekiş ler ve sınırlandırılmamış çekişler8,14. Sınırlandırılmamış çekişler tüm görüş alanı için çekiş alanı sağlarken (hücreleri olan ve olmayan bölgeler dahil), kısıtlı çekişler ise yalnızca hücreleri içeren bölgeler için çekiş alanını sağlar14. Daha sonra, hücreler arası gerilmeler çekiş kuvveti mikroskobu bir uzantısı olan monolayer stres mikroskobu (MSM) kullanılarak hesaplanır. MSM'nin uygulanması, hücre-substrat arabiriminde tek hücre katmanı tarafından uygulanan yerel çekişlerin Newton yasalarının gerektirdiği hücre-hücre arabirimindeki hücreler arasında iletilen mekanik kuvvetler tarafından dengelenmesi gerektiği varsayımına dayanır7 ,12,13. Burada önemli bir varsayım hücre monolayer ince bir elastik levha olarak tedavi edilebilir, çünkü monolayer çekiş dağılımı bilinen ve kuvvet dengesi hücre malzeme özelliklerine bağlı değildir. Başka bir önemli varsayım çekiş kuvvetleri görüş optik alan içinde yerel hücreler arası stresler tarafından dengeli olduğunu (monolayer içinde) ve bu kuvvet dengesinin etkisi distal bölgede en az (monolayer dışında)13. Bu nedenle, hücreler arası gerilmeler, yer değiştirmeler veya her ikisinin tek katmanlı sınırdaki bir kombinasyonu tarafından tanımlanan sınır koşulları MSM13'ügerçekleştirmek için çok önemlidir. Yukarıdaki bilgileri dikkate alarak, msm'yi sonlu elemanlar analizi (FEM) yaparak maksimum ana gerilimi (σmax)ve minimum ana gerilimi (σmin)içinde her noktada döndürerek geri alabiliriz. tek katmanlı. Bu temel gerilmeler daha sonra 2B ortalama normal hücreler arası gerilimi [(σmax + σmin) ve 2D maksimum kesme hücre içi gerilimi [(σmax - σmin) /2] tüm monolayer içinde hesaplamak için kullanılır 12,13. Bu prosedür Tambe ve ark.12,13 tarafından daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır
Monolayer stres mikroskobu (MSM) bir monolayeriçindeoluşturulan hücre-hücre içi gerilmelerin hesaplanması için izin verir 6,7,8,12,13. Bu hücreler arası stresler doku büyüme ve onarım, yara iyileşmesi ve kanser metastazı için önemli olduğu ileri sürülmüşlerdir12,15,16,17. Buna ek olarak, intersellüler stresler de endotel hücre göçü ve endotel bariyer fonksiyonu önemli olduğu ileri sürülmüştür17,18. Sıkı kavşaklar ve yapışık kavşaklar gibi hücre-hücre kavşaklarının hem endotel hücreiçi stres oluşumunda ve iletiminde kritik bir rol oynadığı öne sürülürken, boşluk bağlantılarının rolü hala belirsizdir. Gap kavşakları fiziksel olarak komşu hücreleri bağlamak ve elektrik akımı ve moleküller (<1 KDa) komşu hücreler arasında geçmek için bir yol sağlamak19,20,21. Endotel hücreleri Cx37 ifade rağmen, Cx40, ve Cx43 boşluk kavşaklar19,22, Cx43 muhtemelen hastalığın ilerlemesi açısından en önemli23. Cx43'ün önemine dair kanıtlar, farelerde Cx43'ün genetik olarak silinmesi hipotansiyon24 ile sonuçlanır ve anjiyogenez üzerinde yan etkileri vardır25. Buna ek olarak, Cx43 hücre göçü ve çoğalması için önemli olduğu belgelenmiştir ve aterosklerozilerlemesi 18,22,23,24,25 .
Bu protokolde, endotelsel boşluk kavşak Cx43 bozulmasından etkilenecek confluent, endotel yaltekerlik içinde çekiş ve hücreler arası stres oluşumunu araştırmak için TFM ve MSM'yi kullandık. Biz 2,5-dihidroksikalson (chalcone), cx43 ifade26inhibe belgelenmiş bir molekül ile Cx43 bozdu. Chalcone cx43 ifade26bozmak için Lee ve ark. tarafından daha önce bildirilmiştir olarak siRNA yerine Cx43 bozmak için kullanılmıştır . Buna ek olarak, biz özellikle endotel üzerinde chalcone etkisi de potansiyel olarak çeşitli vasküler önlenmesi ve tedavisi için kullanılabilecek bir anti-inflamatuar ve anti-trombosit bileşik olduğu bildirilmiştir ilgilendi patolojiler26. Chalcone tedavileri deney başlangıcından bir saat sonra yapıldı, chalcone ile tedavi edilen monolayers toplam altı saat boyunca görüntülendi ve görüntü işleme çekiş belirlemek için özel olarak yazılmış mATLAB kodu ile yapıldı ve daha sonra hücreler arası strese neden olabilir. Sonuçlarımız çekişlerde ve hücreler arası streslerde genel bir düşüş olduğunu göstererek, Cx43'ün endotel biyomekaniğinde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Poliakrilamid (PA) jelleri yapma
-
Petri kabının hazırlanması
- 200 mL ultrasaf suyu 80 μL asetik asit ve 50 μL 3-(trimethoxysilyl)propil metakrilat ile karıştırarak bağlama silane çözeltisini hazırlayın. Bind silane hidrojel eki için cam alt Petri çanak yüzeyini işlevselleştirmek için kullanılan bir çözümdür.
- En az 1 saat boyunca bir karıştırma plakası üzerinde bağlayıcı silane çözeltisi karıştırın.
- 45 dakika boyunca bind silane çözeltisi ile Petri kabının merkezini iyi tedavi edin.
- Bağlama silane çözeltisini çıkarın ve Petri kabını ultra saf su 2x-3x ile durulayın.
- Petri çanak yüzeyini kurulayın ve ileride kullanmak üzere oda sıcaklığında saklayın.
-
Hidrojel çözeltisinin hazırlanması
- Tablo 1'egöre 15 mL'lik bir santrifüj tüpte ultra saf su, %40 akrilamid ve %2 bis-akrilamid ikar.
- Hidrojel çözeltisine 80°L floresan boncuk ekleyin.
- Yavaşça jel çözeltisi ile boncuk karıştırmak için tüp sallayın.
- Hafifçe santrifüj tüp üzerinde tüp kapağı sıkın ve bir vakum odasına yerleştirin.
- Vakum odasında en az 45 dk jel çözeltisi degas.
-
Hidrojel polimerizasyonu
- İlk olarak hidrojel çözeltisine %10 amonyum persülfat (ultra saf suda çözünmüş) 75°L'lik amonyum persülfat ekleyin ve ardından 8 μL TEMED (N,N,N', N'-tetramethylethane-1,2-diamin) ekleyin.
- Petri kabının ortasına 24 μL hidrojel çözeltisi yerleştirin (Bkz. Tablo 2).
- Hidrojeli düzleştirmek için 18 mm'lik bir kapak kaydırma kullanın. Bu ~ 100 μm bir yükseklik verecektir.
- Jel polimerizasyonu için en az 30-40 dk bekleyin.
- Jel dehidratasyon önlemek için ultra saf su polimerize hidrojel batırın.
- Floresan boncukların fotobeyazmasını önlemek için Petri kabını alüminyum folyo ile kaplayın ve 4 °C'de saklayın.
NOT: Hidrojeller 3 aya kadar bir süre saklanabilir, ancak bu jellerin en iyi sonuçları elde etmek için imalattan en fazla 1 hafta sonra kullanılması önerilmektedir.
2. Hücre kültürü
- Kültür insan göbek ven endotel hücreleri (HUVECs) hücre kültürü orta 200 (Malzemeler Tablosubakınız) ile desteklenmektedir 1% penisilin-streptomisin ile desteklenmektedir 0.1% jelatin kaplı şişeler üzerinde 37 ° C ve 5% CO2.
3. Mikro desen şablon hazırlama
- Silikon tabanı silikon kür maddesi ile 20:1 (baz: kür leme maddesi) oranında karıştırarak 100 mm Petri kabında ince bir polidimethylsiloxane (PDMS) tabakasını tedavi edin.
NOT: Madde oranlarının kavisi için başka bir taban kullanmak mümkündür (ör. 10:1 veya 30:1). Ancak, kür ajan oranı için daha düşük bir taban daha sert bir desen verecektir, kür ajan oranı daha yüksek bir taban daha yumuşak bir desen üretecek. - 20:1 (baz:kürleme ajanı) PDMS çözeltisi hazırlayın ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde dikkatlice karıştırın. Tekdüze olmayan karıştırma eksik polimerizasyona neden olacağından, PDMS çözeltisinin doğru şekilde karıştırılmasını sağlamak için tüpü ters çevirin ve birden fazla kez sallayın.
- 1 90 x g1 dk için PDMS çözüm santrifüj tarafından yukarıdaki adımdan tanıtılan kabarcıklar kaldırın.
- 100 mm Petri kabının ortasına 5-6 mL PDMS çözeltisi dökün ve PDMS çözeltisi tüm Petri kabı yüzeyini kaplayana kadar kabı çalkalayın.
- PDMS çözeltisini bir gecede 50-60 °C'de tedavi edin. PDMS oda sıcaklığında da tedavi edilebilir.
- Bir delik zımba ile dairesel, 16 mm çapında PDMS şablon u çıkarın.
- PDMS şablonküçük delikler oluşturmak için bir biyopsi yumruk kullanın. Bu protokolde 1.25 mm çapında biyopsi yumruğu kullanılmıştır.
- PDMS şablonlarını ilk olarak 2-3 dakika boyunca %70 etanol le batırarak, aşırı etanolün sinpire edilerek ve 5 dakika uv ışığı altına yerleştirerek sterilize edin.
4. Kollajen-I hidrojel kaplama
- Hidrojelden kapak kaymasını çıkarın ve fazla sıvıyı aspire edin.
- PDMS şablonunu hidrojel yüzeyine yerleştirin.
NOT: Cımbız, PDMS şablonu ile hidrojel yüzeyi arasında su geçirmez bir conta sağlamak için PDMS şablonuna Hafif basınç uygulamak için kullanılabilir. PDMS şablonlarımız su geçirmezdir ve böylece jel üst yüzeyi ile PDMS şablon alt yüzeyi arasında su girişini engeller. Ayrıca, hidrojel sertliği PDMS sertliği açısından ayarlanması gerekmez. - Hidrojel yüzeyini sulfosuccinimidyl-6-(4-azido-2-nitrofenilmino) hekzanomuat (sulfo-SANPAH) 0,1 M HEPES (4-(2-hidroksitil)-1-piperazineeesulfonic asit) tampon çözeltisi ile kaplayın 1 : 1000 ve uv altında yer lamba (güç 36 W) için 8 dk.
- Aşırı sulfo-SANPAH ve HEPES çözeltisini aspire edin ve hidrojeli 0,1 M HEPES ile iki kez durulayın ve ardından ultra saf suile iki durulama daha.
- 4 °C'de bir gecede 0,1 mg/mL kollajen-I ile aşırı ultra saf su ve kat hidrojelleri aspire edin.
- Bulaşıkları kapatın ve floresan boncukları fotobeyazlamalardan koruyun.
NOT: PDMS şablonları mikro desenli monolayers oluşturmak için kullanılır. Mikro desenli monolayers her deney sırasında aynı geometri ve boyutlarda birden fazla monolayers için izin olarak kullanılır. Ancak, mikro desenler istenmiyorsa, 4.2.
5. Hidrojeller üzerinde HUVEC monolayers oluşturma
- Kuvözde 3-5 dakika boyunca hücreleri doku kültürü şişelerinden ayırmak için 1x tripsin kullanın.
- Tripsinizasyondan sonra, hücre kültürü ortamını tripsin çözeltisine ekleyin ve 15 mL santrifüj tüpüne ekleyin.
- 1710 x g3 dk için hücre çözeltisi santrifüj . Santrifüj tüpünün altında küçük, beyaz bir hücre peleti görülmelidir.
- Medyadaki süpernatant hücreleri 50 x 104 hücre/mL konsantrasyonuna aspire edin.
- Kollajen-I'yi hidrojelden çıkarın ve PBS ile 1x durula.
- PDMS şablonunun üstüne 75 x 103 hücre ekleyin ve hücrelerin 37 °C ve %5 CO2'dekuvözde en az 1 saat hidrojel yüzeyine bağlanmasını bekleyin.
- PDMS şablonunu çıkarın ve Petri kabına en az 2 mL ortam ekleyin. Herhangi bir bağlı hücreleri kaldırmak ve% 70 etanol ile püskürtme ve daha sonra 5 dakika uv ışığı altına yerleştirerek sterilize etmek için 10x trypsin PDMS şablon batırın.
- Petri kabını kuvöze yerleştirin ve en az 36 saat bekleyin veya enfluent bir monolayer gözlemlenene kadar bekleyin.
6. Cx43 bozulması için 2,5 dihidroksikalklon tedavisi
- 0,1875 mg/mL stok çözeltisi yapmak için dimethylsulfoxide (DMSO) içinde 2,5 dihidroksikalon (kalkson) çözün.
- Düşük kalkon konsantrasyonu (0.2 g/mL) aliquot ve yüksek kalkon konsantrasyonu (2 μg/mL) aliquot yapmak için hücre kültürü ortamı ile stok çözeltisini seyreltin.
7. Veri toplama
- Bir mikroskop ile hücre adaları bulmak.
- Görüntü hücre morfolojisi ve hidrojel deplasmanları için faz kontrastı ve boncuk görüntüleri elde edin.
NOT: Bu protokol veri toplama için 10x hedefi kullandı. - Deneyin sonunda, hücreleri 10x tripsin ile ayırın ve hücre olmadan jel yüzeyinin görüntüsünü elde edin (referans görüntü).
8. İmmünoboyama
- Monolayers% 4 formaldehit ve inkübat ile 37 °C 15 dakika için düzeltin.
- Hücreleri permeabilize etmek için %4 formaldehit çıkarın ve 37 °C'de 5 dakika için %0,2 Triton X-100 ekleyin.
- % 0.2 Triton X-100 çıkarın ve PBS 2x-3x ile monolayers durulamak.
- 37 °C'de 45 dk için %2 büyükbaş serum albumin (BSA) çözeltisi ile tek kat örtün.
- %2'lik BSA çözeltisini çıkarın ve PBS 2x-3x ile monokatmanları durulayın.
- Numuneye 1:400 konsantrasyonda birincil Cx43 antikorekleyin ve gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- PBS 2x-3x ile primer antikor ve durulama örneğini çıkarın.
- 3:200 konsantrasyonunda sekonder antikor ekleyin ve 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Örnekler fotobeyazlama önlemek için kaplı olmalıdır. - Sekonder antikor çıkarın ve PBS 2x-3x ile durula.
- Montaj ortamı (Fluromount-G DAPI) ile kapak numunesi ve 18 mm'lik kapak lı sızdırmazlık.
9. Çekiş kuvveti mikroskobu (TFM) ve monolayer stres mikroskobu (MSM) uygulanması
-
Hidrojel deformasyon hesaplama
NOT: MATLAB kullanılarak adım adım yer değiştirme hesaplama yordamı aşağıda verilmiştir.- Ana traction.m dosyasını MATLAB'da açın (tüm MATLAB yordamları için Ek Malzemeler'e bakın).
NOT: MATLAB dizinini ayarlamak için kodda verilen yönergeleri izleyin. - Aşağıdaki değişkenleri tanımlayın: görüntü biçimi, pikselden mikrona dönüştürme, Young modülü, Poisson oranı ve mikroskop hedefi.
- OpenFiles alt yordamını kullanarak boncuk, tripsin görüntüsünü ve faz görüntüsünü bulun.
NOT: Büyük veri kümeleri için dosyaları sırayla adlandırmak en iyisidir. Örneğin, dosyalar "filename1.tif", "filename2.tif" vb. olarak adlandırılmalıdır. - Hücre monokatmanı nın etrafında bir kare Yatırım Getirisi (ilgi alanı) tanımlayın ve orijinal görüntüyü kırpmak için cell_cropper alt yordamını çalıştırın.
- Yer değiştirmeleri hesaplamak için displacement_finder alt yordamını çalıştırın.
- Mikroskop evre kaymasınedeniyle olabilecek hücresel olmayan ek yer değiştirmeleri kaldırmak için Dedrift alt yordamını çalıştırın.
- Ana traction.m dosyasını MATLAB'da açın (tüm MATLAB yordamları için Ek Malzemeler'e bakın).
-
Çekişlerin hesaplanması
NOT: Burada, özel olarak yazılmış MATLAB rutinimiz kullanılarak sınırlandırılmamış çekişler hesaplanır. Daha önce bahsedilen MATLAB rutini kullanılarak adım adım çekiş hesaplaması aşağıda verilmiştir.- Çekiş.m rutini içinde aşağıdaki değişkenleri tanımlayın: sınır durumu, jel kalınlığı, jel yüksekliği ve dedrift.
- Çekişleri hesaplamak ve çekişleri çizmek için plot_traction alt yordamını yürütmek için traction_finder alt yordamını çalıştırın. X yönünde (Tx) ve y yönünde (Ty) tüm çekişler ve karşılık gelen piksel konumları kod tarafından oluşturulacak bir traction.dat dosyasında bulunabilir.
-
Hücreler arası gerilimlerin hesaplanması
NOT: Daha önce bahsedilen MATLAB rutinini kullanarak hücreler arası stres hesaplaması için adım adım talimatlar aşağıda verilmiştir.- Tek katmanlı sınırı belirtmek için mark_circular_domain alt yordamını çalıştırın. Bu yordam, kullanıcının tek katmanlı etrafında el ile bir sınır çizmesi için sırayla kırpılan tüm faz görüntülerini ister. Komut penceresinde oluşturulan nXPts bir not tutun ve FEM analizi için hem X ekseni ve Y ekseninde ızgara parametreleri olarak daha sonra kullanabilirsiniz (adım 9.3.2 bakınız).
- Hücreler arası gerilimleri hesaplamak için Run_StressCode'u çalıştırın. Bu alt yordam doğrudan "model.in" dosyasından parametreleri okur ve FEM çözümlemesi gerçekleştirmek için "island.exe" yürütür. Bu rutinçalıştırmadan önce, model.in dosyasındaki tüm parametrelerin, yani X ve Y'deki ızgara parametrelerinin, pikselden mikron dönüştürmeye, Young'ın jel modülünden, Poisson'un oranına, tek katmanlı yüksekliğine ve tek katmanlı desenin (şerit veya delik) düzenlendiğinden emin olun Doğru.
- Plot_FEM_results alt yordamını kullanarak tüm FEM sonuçlarını çizin.
NOT: Oluşturulan tüm sonuçlar otomatik olarak MATLAB dizinindeki Sonuçlar klasöründe depolanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kontrol faz kontrast görüntüleri, 0.2 μg/mL, ve 2 μg/mL tedavi monokatları chalcone tedavisinden 30 dakika önce alındı(Şekil 1A-C) ve 2 saat sonra kalkon tedavisi (Şekil 1D-F). Hücre kaynaklı boncuk yer değiştirmelerinin (μm) huvec monolayers kontrol karşılaştırıldığında hem düşük doz kalkon ve yüksek doz kalkon koşullarında azalma gözlenmiştir(Şekil 2E,F) (Şekil 2D). Chalcone tedavisinden önce rms traksiyonları tüm durumlar için 51 ± 8 Pa(Şekil 3A-C)civarındaydı. Chalcone tedavisinden sonra düşük doz da chalcone tedavi monokatmanlarında 59 ± 11 Parms çekişlerinde küçük bir artış ve rms çekişlerinde neredeyse 2 kat azalma 18 ± 2'ye düştü ( yüksek doz chalkon tedavi edilen monolayers ' da ( Şekil 3F) kontrole göre (Şekil 3D). Chalcone tedavisinden önce ortalama normal hücreler arası gerilmeler 220 ± 66 Pa(Şekil 4A-C)civarındaydı. Chalcone tedavisinden sonra, düşük doz alsikon tedavisi ile ortalama normal hücreler arası stres büyüklüğü 285 ± 75 Pa'ya kadar artış oldu (Şekil 4E) ancak ortalama normal hücreler arası stres büyüklüğünde önemli bir düşüş 106'ya ± 4 Pa yüksek doz kalkon tedavisi ile(Şekil 4F) kontrol ortalama normal hücreler arası streslere göre (235 ± 18 Pa, Şekil 4D). Maksimum kesme intersellüler gerilmeleri chalcone tedavisinden önce 241 ± 30 Pa(Şekil 5A-C)civarındaydı, ancak chalcone tedavisinden sonra düşük chalkon konsantrasyonunda 227 ± 20 Pa'ya azalma oldu (Şekil 5E) ve yüksek chalcone konsantrasyonu tedavisinde (Şekil 5F)maksimum kesme hücre içi stres büyüklüğünde 91 ± 6 Pa'ya kadar bir azalma daha(Şekil 5F ) ). Çekiş ve hücreler arası gerilmelerin analizi Şekil 6A-C'deveremevvetlerdir. Tüm çizilen sonuçlar istatistiksel anlamlılık (t-testi ve tek faktörlü ANOVA testi) açısından test edildi ve her iki testte de 0.2 μg/mL chalcone konsantrasyonu ve 2 ile bağımsız olarak karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı olduğu sapedildi(p < 0.05) koşulları kontrol etmek için μg/mL chalcone (chalcone olmadan).
Şekil 1: HUVEC monolayers temsili faz kontrast görüntüleri. 30 dk (A) ve 2 h(D),30 dk(B) ve 2 saat(E)ile tedavi edilen HUVEC'lerin faz kontrast görüntüleri ve 2 μg/mL kalkson ile tedavi edilen HUVEC'lerin faz kontrast görüntüleri 30 dk (C) ve 2 saat(F)deney başlangıcında. Ölçek çubuğu 1,25 mm'lik tek katmanlı çapı temsil eder.
Şekil 2: HUVEC monolayers tarafından üretilen deplasman alanının çizimi. 30 dk (A) ve 2 h(D)kontrol HUVECs (μm) ve 2 h(D),HUVECs 30 dakika(B) ve 2 h(E)0.2μg/mL chalcone ile tedavi ve HUVECs 30 dk 2 μg / mL chalcone ile tedavi (C) ve 2 h ( F ) deneme başlangıcı. Ölçek çubuğu 1,25 mm. Renk çubuğunun tek katmanlı çapını temsil eder.
Şekil 3: HUVEC monokatmanlarında RMS çekiş dağılımı. Kontrol rms çekiş (Pa), 0.2 μg/mL chalcone ve 2 μg/mL chalcone HUVECs chalcone tedavi öncesi(A-C)ve chalcone tedavisi(D-F)bir saat sonra sırasıyla. Ölçek çubuğu 1,25 mm. Renk çubuğunun tek katmanlı çapını temsil eder.
Şekil 4: HUVEC monolayers ortalama Normal Hücrelerarası Stres dağılımı. Kontrol HUVECs ortalama normal hücreler arası stres (Pa) dağılımı 30 dk (A) ve 2 h(D), HUVECs 30 dk 0.2 μg/mL chalcone ile tedavi (B) ve 2 h (E), ve HUVECs 30 dk 2 μg/mL chalcone ile tedavi (C) ve 2 saat (F). Ölçek çubuğu 1,25 mm. Renk çubuğunun tek katmanlı çapını temsil eder.
Şekil 5: HUVEC monolayers Maksimum Kesme Hücrelerarası Stres dağılımı. 30 dk(A)ve 2 h(D),30 dk(B) ve 2 saat(E)ile 0,2μg/mL chalcone ile tedavi edilen HUVEC'ler ve 30 dk(C) de 2 μg/mL chalcone ile tedavi edilen HUVEC'lerin maksimum kesme hücre içi stresi (Pa) dağılımı ( C ) ve 2 saat (F). Ölçek çubuğu 1,25 mm. Renk çubuğunun tek katmanlı çapını temsil eder.
Şekil 6: HUVEC monolayers RMS çekişve Hücrelerarası Stresler ve HUVEC boşluk kavşak Cx43 yapıları üzerinde chalcone tedavisinin etkisi karşılaştırılması. Ortalama normal hücreler arası stresin(A),maksimum yakalama intersellüler gerilim(B)ve RMS çekişlerinin(C)çizerleri, kontrole kıyasla HUVEC monolayers üzerindeki chalcone dozlarının (0,2 g/mL ve 2 μg/mL) etkisini gösterir. Hata çubukları standart hata gösterir. Sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı bulundu (örneklem büyüklüğü = 6 adalar, güven düzeyi %95 kontrole göre her iki t testi(p < 0.05) ve tek faktörlü ANOVA(p < 0.05) kullanılarak yapılır. Ayrı yemeklerde, immünboyama yumuşak 1.2 kPa hidrojeller üzerinde yaşayan hücrelerin adalar için ilacın 5 saat sonra ekuygulandı. Yeşil renk Cx43'ü, mavi ise DAPI'yi (çekirdek) temsil eder. Panel D aşağıdakileri tasvir eder: kontrol (E,H), 0.2 μg/mL chalcone tedavi hücreleri(F,I)ve 2μg/mL chalcone tedavi hücreleri(G,J). Ölçek çubuğu = 200 μm, amaç = 20x. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: HUVEC monokatmanlarında yüksek çözünürlüklü Cx43 boyama. Sabit HUVEC monolayers Cx43 için boyandı (yeşil) ve çekirdek (DAPI, mavi) chalcone doza bağlı etkisini gözlemlemek için. Daha yüksek büyütme görüntüleri (63x objektif) çoğunlukla çekirdek etrafında Cx43 lokalizasyonu ortaya (yeşil floresan yoğunluğu belirgin). Gösterilen kontrol(A-C), 0.2 μg/mL chalcone tedavi hücreleri(D-F) ve 2 μg/mL chalcone tedavi hücreleri(G-I). Ölçek çubuğu = 100 μm, objektif = 63x yağ daldırma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| 1200 Pa | 870 Pa | 1 kPa | 4 kPa | 6.3 kPa | 11 kPa | 90 kPa | 150 kPa | |
| Çözüm kompozisyonu | %0.05 BIS | %0.1 BIS | %0.03 BIS | %0.1 BIS | %0.03 BIS | %0.07 BIS | %0.3 BIS | %0.6 BIS |
| 5.5% Akril | %2 Akril | %5 Akril | %5 Akril | %10 Akril | %10 Akril | %12 Akril | %12 Akril | |
| Ultra saf su | 12,49 mL | 13,38 mL | 12,78 mL | 12.255 mL | 10.905 mL | 10,63 mL | 8.30 mL | 5,9 mL |
| %40 Akrilamid | 2.062 mL | 750 μL | 1.875 mL | 1.875 mL | 3.75 ml | 3,75 mL | 4,5 mL | 4,5 mL |
| 2% BIS Akrilamid | 375 μL | 750 μL | 225 μL | 750 μL | 225 μL | 525 μL | 2,12 mL | 4,5 mL |
| Griniş boncuklar (0,2 μm veya 0,5 m) | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | Çekişler ölçülebilir değildir |
Tablo 1: Farklı Young'ın modüllü leri için poliakrilamid jel formülasyonları yapma.
| Birim | Kalın -lığı | Kapak kayması | ||
| 20-mm sl iyi | Kalın | 500 μL | ~1 mm | 25mm |
| Ince | 24 μL | ~100 μm | 18 mm | |
| 14-mm sl iyi | Kalın | 175 μL | ~700 μm | 18 mm |
| Ince | 10.3 μL | ~100 μm | 12 mm | |
| 14 mm 6-kuyu | Kalın | 280 μL | ~1,5 mm | 18 mm |
Tablo 2: Jel hacmi ve kalınlığı.
Ek Dosya: MATLAB Yordamları. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Grubumuz, yanı sıra diğerleri, başarıyla çeşitli patolojik ve fizyolojik hücresel süreçlerde hücre-hücre kavşaklarının etkisini araştırmak için TFM ve MSM kullanarak olmuştur in vitro7,15,18,27 . Örneğin, Hardin ve ark. endotel hücrelerinde hücreiçi stres iletimkılavuzları15. Burada bildirdiğimiz Cx43 ile ilgili değişiklikleri Hardin ve ark.'nın bildirdiği değişikliklerle ilişkilendirmek mümkün olsa da, bu protokolde özellikle parasellüler boşluk oluşumuna değinmeyiz. Burada, özellikle gap kavşak Cx43 hedef ve endotel biyomekanik üzerindeki etkisini araştırmak için mekanik tabanlı bir protokol sundu.
Bu protokolün başarılı olması için, üstesinden gelmemiz gereken birkaç zorluk vardı, bazıları diğer araştırmacılar ın benzer çalışmalar için protokolümüzü benimsemeye karar vermeleri halinde ortaya çıkabilir. Önemli bir sorun cx43 ekspresyonu inhibe edilebilir optimum bir kalkson doz aralığı bulmak oldu, aynı anda bizim endotel monolayers bozulmadan tutarken. HUVECs için chalcone IC50 daha önce 10.01 μg/mL28olduğu bildirilmiştir. Ancak, HUVEC monolayers'ımızı 0,2 μg/mL ile 20 μg/mL arasında değişen birden fazla kalkon konsantrasyonuna maruz bıraktığımızda, monolayers'ın hala confluent kalırken dayanabileceği en yüksek konsantrasyon olarak 2 μg/mL'lik bir kalkon konsantrasyonu bulduk. MSM kullanarak hücreler arası gerilimleri ölçmek için tek katmanlı bir monolayer gerekli olduğundan, bu protokol için bir konfluent monolayer gerekliydi. Daha sonra, seçili dozlarda kalkçının Cx43 yapısını veya belirgin ekspresyonu başarıyla bozduğunu belirlemek için immünoresans tetkikini yaptık. Sonuç olarak, 0.2 μg/mL likla Cx43 yapısının bozulması kontrolden ayırt etmek görsel olarak zor iken, 2 μg/mL chalkon ile tedavi edilen hücrelerin Cx43 yapısında belirgin bir fark ve potansiyel ifade ( Şekil 6D ve Ek Şekil 1). Buna ek olarak, sonuçlarımız Cx43 bozulmasıgerçekten en yüksek konsantrasyonda çekiş ve hücreler arası gerilmeleri azaltarak endotel biyomekaniği etkiler gösterdi. Bu bulgular bazellieres ve ark. ile uyum içinde olan siRNA ile Cx43 susturma gösterdi da çekiş ve hücreler arası stresleri azaltmak için, ama epitel hücrelerinin bir levha27. Sonuçlarımız başkalarıyla aynı fikirde olmasına rağmen, Cx43 ekspresyonunu bozmak için kullandığımız molekülün, chalcone'un da Cx43 bozulmasına ek olarak MAPK ve NFkB aktivasyonunu etkilediği öne sürülmelidir26. Bu nedenle, yukarıda bahsedilen moleküllere veya bunların ilişkili yollarına özellikle bakmadığımız için, potansiyel bir MAPK ve NFkB perturbasyonunun endotel biyomekaniği üzerindeki etkisini de göz ardı edemeyiz.
Kayda değer bir diğer önemli nokta kurtarılan çekiş ler ve hücreler arası gerilmeler doğada 2D ve düzlem (z-yönü) çekiş ve hücreler arası gerilimler 12 ,13göz ardı olmasıdır. Düzlem dışı gerilimleri yok saymakla ilişkili küçük bir hata olsa da, bu hata ihmal edilebilir13'tür. Buna ek olarak, monolayer lateral boyutu yeterince büyük (1.25 mm) monolayer yüksekliğine göre (~ 5 μm) z yönünde önemli yer değiştirmeler beklemeyin. Ayrıca, MSM hesaplamamonolayer sınır12,13hata sunuyor. Ancak, Tambe ve ark. deneysel hataları optik kenarları (yani, monolayer sınır) en yüksek olduğunu gösterdi ve hızlı bir şekilde sınır kenarlarından distal bozunması13. Biz mikrodesen gerçekleştirmek ve daha sonra hücreler arası stres hesaplama sırasında oluşabilir sınır hataları önlemek için tüm monolayer hücreler arası gerilmeleri hesaplamak.
Bu yöntemden elde edilen hücreler arası stres bilgileri endotel biyomekaniküzerinde boşluk kavşak bozulmasının daha tam bir şekilde anlaşılması için monolayer stres mikroskobu kullanılmaktadır. Buna ek olarak, hücre içi gerilmelerin endotel bariyer fonksiyonunda önemli olduğu ileri sürülmüş, hardin ve ark.15 ve Krishnan ve ark.17tarafından önerilmiştir, örneğin. Ayrıca, burada sunulan temsili verilerde hücreler arası gerilmeler çekişlerle ilişkili yken, uyarıcıya bağlı olarak bu durum her zaman geçerli değildir. Steward ve ark.'nın çalışmasında, örneğin, endotelsel hücreler arası gerilmelerin sıvı makası altında azaldığı gösterilmiştir, çekişler ise nispeten değişmeden7. Ayrıca, burada sunduğumuz protokol hücre kaynaklı mekanik kuvvetlerin eşzamanlı ölçümü ve kavşakve odak yapışıklıklarının boyanması için izin vermez, ancak böyle bir ek bu protokole ücretsiz olacaktır. Kapanışta, burada sunduğumuz protokol, Cx43'ün sadece endotel biyomekaniği, özellikle endotel hücre kaynaklı kuvvetler üzerindeki etkisini araştırmak için mekanik tabanlı bir yöntemi tanımlar. Mekanik tabanlı protokolümüzün, şu anda mevcut biyolojik temelli protokollerle birlikte çalışarak sahada gerçekten çığır açan çalışmalar sağlayabileceğine inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Merkezi Florida Üniversitesi start-up fonları ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüsü ödül K25HL132098 altında desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm coverslip | ThermoFisher | 18CIR-1 | Essential to flatten polyacrylamide gels |
| 2% bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610143 | Component of polyacrylamide gel |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | To disrupt Cx43 structure |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | SIGMA | 2530-85-0 | Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water |
| 40% Acrylamide | BIO-RAD | 1610140 | Component of polyacrylamide gel |
| Acetic acid | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Essential to make bind saline solution |
| Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Secondary antibody |
| Ammonium persulfate | BIO-RAD | 1610700 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | To make blocking solution |
| Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Use as a extracellular matrix |
| Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Buffer Saline needed for cell culture |
| Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | To dissolve chalcone and make stock solution |
| Fluoromount-G with DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI |
| Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads | ThermoFisher | F8812 | 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids |
| HEPES buffer solution 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Essential to |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Essential HUEVC media 200 supplement |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | Essential media for HUVEC cell culture |
| Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Primary antibody for Cx43 |
| Petri dish (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 35 mm petri dish with a 20 mm center well |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Essential to functionalize polyacrylamide gel surface |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW corning | 2646340 | Silicon elastomer with curing agent to make PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | To permeabilize cells |
| Trypsin -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Used to detach cells |
References
- Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
- Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
- Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
- Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
- Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
- Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
- Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
- Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
- Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
- Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
- Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
- Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
- Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).
- Lee, Y. N., et al. 2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
- Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
- Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).
