Summary
La presencia de células madre cancerosas se ha asociado con recaídas o malos resultados después de la radioterapia. Este manuscrito describe los métodos para estudiar la radiosensibilidad de las células madre cancerosas en las líneas celulares de cáncer de pulmón.
Abstract
La presencia de células madre cancerosas (CSC) se ha asociado con recaídas o malos resultados después de la radioterapia. El estudio de las CCS radiorresistentes puede proporcionar pistas para superar la radiorresistencia. Se ha notificado la isoforma 5 del canal de calcio cerrado por voltaje n.o 21 como un marcador para los CCS radiorresistentes en líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Utilizando la subunidad del canal de calcio 2-1 como ejemplo de un marcador CSC, se presentan métodos para estudiar la radicalidad de los CSC en las líneas celulares NSCLC. Las CSC se clasifican con marcadores putativos por citometría de flujo, y la capacidad de auto-renovación de las células ordenadas se evalúa mediante el ensayo de formación de esferas. El ensayo de formación de colonias, que determina cuántas células pierden la capacidad de generar descendientes que forman la colonia después de una cierta dosis de radiación, se realiza para evaluar la radiación de las células ordenadas. Este manuscrito proporciona los primeros pasos para estudiar la radiosensibilidad de las SC, que establece la base para una mayor comprensión de los mecanismos subyacentes.
Introduction
La radioterapia desempeña un papel importante en el tratamiento del cáncer. Sin embargo, la existencia de células madre de cáncer radioresistentes (CCS) puede provocar recaídas o malos resultados después de la radioterapia1,2. Las CSC se caracterizan por su capacidad de auto-renovación y capacidad para generar células cancerosas heterogéneas3. Blindados con una capacidad de reparación de daños por ADN más eficiente o niveles más altos de sistemas de barrido de radicales libres u otros mecanismos, los CSC son relativamente resistentes a la radioterapia4,5,6,7 , 8. Identificar los marcadores CSC y explorar sus mecanismos facilitará el desarrollo de fármacos que superarán la radiorresistencia sin aumentar el daño tisular normal.
Se ha notificado la isoforma 5 del canal de calcio cerrado por tensión n.o 21 como un marcador para los CCS radiorresistentes en las líneas celulares DeNC9. El número 2 1 fue identificado originalmente como un marcador CSC para el carcinoma hepatocelular (HCC)10. Utilizando la inmunización sustractiva con un par de líneas celulares hcc derivadas de los tumores primarios y recurrentes en el mismo paciente, se identificó un anticuerpo llamado 1B50-1 para apuntar específicamente a las células recurrentes del HCC. Las células 1B50-1-positivas mostraron una alta eficiencia de formación de esferas in vitro y alta tumorigeniidad in vivo. Su antígeno fue identificado por espectrometría de masas, como el canal de calcio 2-1 subunidad isoform 5. El n.o 21 expresa específicamente en los CoS y es indetectable en la mayoría de los tejidos normales, lo que lo convierte en un candidato potencial para apuntar a los CSC10. El número 21 también puede servir como un marcador CSC para las líneas celulares NSCLC, y se ha demostrado que imparteradiorresistencia a las células NSCLC parcialmente mejorando la eficiencia de la reparación de daños al ADN en respuesta a la radiación 9.
El estudio de las CCS radiorresistentes puede proporcionar pistas para superar la radiorresistencia. Utilizando el n.o 2-1 en el NSCLC como ejemplo, se presentan los métodos principales para estudiar la radiosensibilidad de los SCP. Por lo general, los CCS se aíslan con un marcador de superficie putativa, y se comparan las características de las células madre y la radiosensibilidad de las poblaciones de células positivas y negativas. La formación de esferas en un medio libre de suero complementado con factores de crecimiento que apoyan la autorrenovación es un ensayo útil para evaluar la talla de las células in vitro. Es probable que las células con alta capacidad de formación de esferas muestren una alta tumorigeniidad cuando se inyectan en ratones inmunodeficientes10,11,12. El ensayo de formación de colonias se utiliza entonces para evaluar la radiación de las células, que determina cuántos han perdido la capacidad de generar descendientes que forman la colonia después de una dosis de radiación13.
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Protocol
NOTA: Los pasos se realizan bajo la temperatura indicada. Para los pasos en los que no se menciona la temperatura, realice bajo temperatura ambiente (18-25 oC). El medio de cultivo celular debe almacenarse a 4 oC, y otros reactivos deben almacenarse de acuerdo con las guías del fabricante. El medio se debe precalentar a 37 oC antes de añadirse a las células.
1. Clasificación de celdas
- Conjugación de anticuerpos
NOTA: Teniendo en cuenta el menor tiempo de incubación, se prefiere el anticuerpo con etiqueta directa para la clasificación celular. Si no se dispone de anticuerpos comerciales con etiqueta directa, utilice reactivos conjugados de fluoresceína para conjugar el anticuerpo con un colorante fluorescente de acuerdo con la guía del fabricante (ver Tabla de materiales). Como las células se cultivarán después de la clasificación, todos los pasos deben realizarse en un gabinete de seguridad biológica o banco limpio laminar. Para evitar la contaminación, se recomienda añadir antibióticos (penicilina y estreptomicina) al medio de cultivo después de la clasificación.- Añadir 1 l de reactivo modificador por cada 10 ml de anticuerpo que se va a etiquetar. Mezclar suavemente.
- Añadir la mezcla de anticuerpos y modificador directamente sobre la fluoresceína liofilizada. Pipet suavemente. Deje el vial de pie durante 3 h o durante la noche a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad.
- Añadir 1 l de reactivo quencher por cada 10 oL de anticuerpo. El conjugado se puede utilizar después de 30 min. El conjugado de fluoresceína se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 18 meses.
- Antes de la clasificación, se recomienda la valoración de los anticuerpos conjugados. Prepare las células que expresan (p. ej., H1299 o A549 para el n.o 2o 1) y no expresan (p. ej., H1975) el marcador. Alíspe las células e incubarlas con anticuerpos a diferentes concentraciones (p. ej., 15 g/ml, 7,5 g/ml, 1,5 g/ml y 0,75 g/ml, respectivamente).
- Realice el análisis citométrico de flujo (con histograma o gráfica de puntos) y elija la concentración en la que las celdas positivas de H1299 o A549 se pueden separar del control de isotipo y las células H1975 tienen pocas señales inespecíficas.
- Etiquetado celular
- Células de cultivo A549 en rpm 1640 mediana suplementadas con 10% suero bovino fetal (FBS) en platos de 10 cm a 37 oC y 5% CO2 en una incubadora de cultivo celular. Digerir las células de la siguiente manera para la clasificación cuando alcanzan entre el 80% y el 90% de la confluencia (alrededor de 5-10 x 106 células por plato).
- Retire el medio de referencia cultural. Lave brevemente las células con 3 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 3 ml de 0,05% de trippsina a cada plato. Retire la trippsina y deje que la trippsina residuaria digiere las células a 37 oC durante 1-3 min. Compruebe el desprendimiento de las células con frecuencia para evitar la sobredigestión.
NOTA: Algunas líneas de celda pueden ser relativamente difíciles de digerir, como las líneas de celda NSCLC H520 y PC9. En tal situación, 3 ml de tripsina se pueden dejar en el plato, en lugar de la digestión con la trippsina residuaria. Además, el tiempo de digestión se puede extender. - Cuando las células se aflojen y comiencen a desprenderse de los platos, agregue 3 ml de medio RPMI 1640 complementado con 10% FBS y pipetee la suspensión celular en un tubo de 50 ml.
- Centrífuga a 300 x g a 4oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Agregue 10 mL de PBS para resuspender las celdas. Transfiera 0,5 ml (o al menos 5 x 105 células) de suspensión celular a un tubo nuevo como control de isotipo. Las celdas restantes son para ordenar.
- Centrifugar tanto los tubos de control como los experimentales a 300 x g a 4 oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Preparar la solución de trabajo para la tinción diluyendo el control de isotipo conjugado con tinte fluorescente o anticuerpo en PBS a la concentración óptima valorada como se mencionó anteriormente.
NOTA: En este experimento, el 1B50-1 conjugado por FITC (el anticuerpo de 2x1) se diluyó en 7,5 g/ml. El volumen de la solución de trabajo depende de la cantidad de celda. - Resuspenda las células de control y experimentales con cada solución de trabajo a aproximadamente 2-5 x 107 células/ml y mezcle suavemente. Incubar las muestras en RT durante 30-40 minutos en la oscuridad.
- Lavar las células añadiendo 10 ml de PBS a las muestras, mezclar suavemente y centrifugar a 300 x g a 4 oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Resuspenda las células con 10 ml de PBS.
- Poner tensores de células de 40 m en nuevos tubos de 50 ml para el control y las células experimentales respectivamente. Aplique la suspensión celular en el colador y recoja el flujo.
NOTA: Este paso elimina los grumos celulares que pueden bloquear el capilar del clasificador de células. - Centrifugar el flujo a través de 300 x g a 4 oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Resuspenda las celdas con PBS de 0,2–1,0 ml y luego transfiera a un tubo de 5 ml para la citometría de flujo.
- Clasificación celular por citometría de flujo
- Preparar dos tubos de 5 ml para recoger las poblaciones celulares positivas y negativas. Añadir 1 ml de medio RPMI 1640 en cada tubo. Coloque los tubos en la plataforma de recolección del clasificador de células.
- Analice las celdas de control y las celdas experimentales respectivamente con la gráfica de puntos. Atraviese las celdas vivas con los parámetros de dispersión hacia adelante (FSC) y dispersión lateral (SSC). Atraviese la población positiva y negativa de las células vivas de acuerdo con la intensidad FL-1.
- Recoger las células positivas de 2 1 y las células negativas de 2. Registre el número de celdas obtenidas.
- Para confirmar que las poblaciones de células cosechadas tienen un nivel diferente de expresión de 2o1, se puede realizar una reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (QPCR).
- Extraer ARN de células positivas y negativas con reactivo de tiocianato de guanidinio y transcripción inversa del ARN en ADNc nm según la guía del fabricante. Realice QPCR con el reactivo verde SYBR. Las secuencias de imprimaciones son las siguientes: 2-F, CAGTTGAGATGGAGGATGATG; 2-1-R, TTGTATGAGCAGTCGTGTC; GAPDH-F, GTCGGAGTCAACGGATTTGG; y GAPDH-R, AAAAGCAGCCCTGGTGACC.
2. Ensayo de formación de esferas
NOTA: El ensayo de formación de esferas se aplica para determinar la capacidad de autorenovación de las células. Las células con capacidad de autorenovación podrían formar esferas en este medio semisólido libre de suero complementado con factores de crecimiento. Todos los pasos deben realizarse en un armario de seguridad biológica o en un banco limpio laminar. Para evitar la contaminación, se recomienda añadir antibióticos (penicilina y estreptomicina) al medio de cultivo después de la clasificación.
- Preparación media
- Preparar 2x DMEM/F-12 medio mediante la reconstitución de un paquete de 1 L de polvo DMEM/F-12 en 475 ml de agua destilada. Añadir 2.438 g de NaHCO3. Ajuste el pH a 7.0–7.2 agregando lentamente 1 N NaOH o 1 N HCl con agitación. Añadir agua destilada a un volumen final de 500 ml. Esterilice el medio filtrando a través de un filtro de 0,2 m.
- Preparar una solución de metilcelulosa al 2% añadiendo 2 g de metilcelulosa en 100 ml de agua destilada. Autoclave la solución. La metilcelulosa puede mostrar un estado similar al algodón después de la autoclave. Mezcle hacia arriba y hacia abajo suavemente por algunas veces y déjela para un enfriamiento natural. Se convertirá en un semisólido transparente de la noche a la mañana.
- Para obtener 20 ml de medio de auto-renovación, añadir 10 mL de 2x DMEM/F-12 medio a un tubo de 50 ml. Añadir 400 sl de B27 al medio. Añadir factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF) a una concentración final de 25 ng/ml. Añadir el factor de crecimiento de fibroblastos básico humano recombinante (bFGF) a una concentración final de 25 ng/ml. Añadir 2% de metilcelulosa para alcanzar un volumen final de 20 ml.
- Mezclar el medio por vórtice para obtener el medio de auto-renovación.
- Sembrado celular
- Transfiera las células cosechadas al medio de auto-renovación para alcanzar 2000 células/ml y mezclarlas con un breve vórtice. Añadir 100 l de suspensión celular a cada pocal de una placa de 96 pocillos de fijación ultrabaja. No utilice los pozos en el borde de la placa, ya que el medio es más propenso a evaporarse en estos pozos. Agregue agua esterilizada a estos pozos.
- Cultivo a 37oC con 5% de CO2 en incubadora de cultivo celular durante 10-14 días. Añadir 50 l de medio de auto-renovación en el día 5–7.
- Conteo y cálculo de esferas
- 10–14 días después de la sembración, cuente el número de esferas con más de 50 células (aproximadamente) o con un diámetro superior a 100 m bajo un microscopio (lente objetivo 4x, ocular 10x).
NOTA: A partir de la parte superior izquierda del pozo, cuente las esferas mientras mueve la tabla objetiva horizontalmente hacia la derecha con el joystick del microscopio. A continuación, mueva la tabla de objetivos a la fila central del campo visual y cuente las esferas de derecha a izquierda. A continuación, vaya a la fila inferior y cuente de izquierda a derecha. Un pozo de 96 pozos placa se puede contar dentro de tres filas. - Calcule la eficiencia de la formación de esferas como el número de esferas dividido por el número de celdas sembradas. Compare la eficiencia de la formación de esferas entre las poblaciones de células positivas y negativas.
- 10–14 días después de la sembración, cuente el número de esferas con más de 50 células (aproximadamente) o con un diámetro superior a 100 m bajo un microscopio (lente objetivo 4x, ocular 10x).
3. Ensayo de formación de colonias
NOTA: El ensayo de formación de colonias se aplica para determinar la radiasensibilidad de las células. La radiación puede ser suministrada por un acelerador lineal utilizado para la radioterapia. El sistema de irradiación celular para uso en laboratorio también se puede utilizar si el equipo está disponible. Los pasos 3.1, 3.2.3 y 3.2.6 deben realizarse en un armario de seguridad biológica o en un banco limpio laminar. Para evitar la contaminación, se recomienda añadir antibióticos (penicilina y estreptomicina) al medio de cultivo después de la clasificación.
- Sembrado celular
- Prepare una placa de 6 pocillos para cada dosis de radiación, incluido el grupo 0 Gy. Añadir 1,5 ml de medio a cada pozo de 6 pocillos. El medio de cultivo para el ensayo de formación de colonias es el medio RPMI 1640 convencional complementado con 10% FBS (llamado como "completado 1640").
- Células cosechadas diluidas con 1640 medias a 1000 células/ml completas.
- Agregue la suspensión celular a los pozos. Agitar las placas horizontalmente para hacer que las células se distribuyan uniformemente en los pozos. Registre el volumen añadido en cada grupo de dosis.
NOTA: Generalmente, semilla 200 células por pozo para 0 Gy, 200 células para 2 Gy, 400 células para 4 Gy, 800 células para 6 Gy, y 1600 células para 8 Gy, respectivamente. Es mejor ajustar los números de celda en celdas no ordenadas en preexperimentos. - Cultivo a 37oC con 5% de CO2 en incubadora de cultivos celulares.
- Radiación
- Después de que las células se han unido a la parte inferior de los pozos (generalmente un día después de la sembración, y no se recomienda más tiempo teniendo en cuenta la proliferación celular), proceder a realizar la radiación celular.
- Calcular el número de unidades de monitor (MU) para cada dosis a una profundidad de 1 cm en un campo de radiación de 20 cm x 20 cm.
NOTA: Número de MU - dosis (cGy)/factor de salida para la dosis de campo de radiación/profundidad porcentual (PDD) para la profundidad. Por ejemplo, el factor de salida para un campo de 20 cm x 20 cm es 1.066, PDD para 1.0 cm es 0.987, y el número de MU para 8 Gy (800 cGy) es 760 (800/1.066/0.987 a 760.35). Si es necesario irradiar varias placas para cada dosis, también se puede utilizar un campo más grande y los números de MU deben volver a calcularse según el tamaño del campo. El factor de salida y el PDD difieren en diferentes aceleradores. Consulte a los físicos de radiación para conocer estos parámetros. - Añadir 1640 completado a cada pozo para alcanzar 1 cm para la altura del medio.
NOTA: El área de crecimiento celular de la placa de 6 pozos se puede encontrar en la guía del fabricante. Por ejemplo, si el área de crecimiento es de 9,5 cm2 para cada pozo de 6 pocillos, y se ha añadido 1,5 ml de suspensión media y 0,4 ml de suspensión celular el día anterior, añada 7,6 ml de medio al pozo. La altura es necesaria para la acumulación de dosis. No se recomienda una altura media inferior a 0,8 cm.
NOTA: Mantenga las placas cubiertas durante la radiación. Cuando las placas se transfieran entre la sala de cultivo celular y la sala de radioterapia, envuelva las placas con papel de aluminio o colóquelas en una caja limpia para evitar la contaminación. Sostenga las placas planas para evitar que se derrame un medio. - Establezca un campo de radiación de 20 cm x 20 cm. Coloque un bolo equivalente a un tejido de 1,0 cm de espesor en el sofá de tratamiento y coloque la placa de 6 pocillos en el bolo para mantenerlos en contacto. Asegúrese de que toda la placa esté dentro del campo de radiación. Establezca la distancia de la piel de origen como 100 cm. Alinee el nivel de superficie medio con el nivel del láser ajustando la altura del sofá de tratamiento.
NOTA: Las placas con la misma dosis de radiación se pueden irradiar al mismo tiempo. Para este caso, se necesita un campo de radiación más grande, y el número de MU debe ser recalculado de acuerdo con el factor de salida correspondiente. Asegúrese de que todas las placas estén dentro del campo de radiación. - Entregue cada dosis asignada a cada placa en secuencia.
ADVERTENCIA: El acelerador lineal sólo puede ser operado por técnicos cualificados. Manténgase alejado de la radiación. - Lleve los platos de vuelta a la sala de cultivo celular. Cambiar el medio con 2 ml de medio completado para cada pocto. Cultivo a 37oC con 5% de CO2 en incubadora de cultivos celulares. Cambie el medio cada 3-5 días.
- Tinción
- 7-10 días después de la radiación, cuando se forman muchas colonias y antes de que crezcan demasiado grandes y se fusionen, luego realice la tinción y el conteo de la siguiente manera. Retire el medio y lávelo brevemente con PBS. Agregue 1 ml de 4% de formaldehído a cada pocto para fijar las células.
ADVERTENCIA: El formaldehído es volátil. Use formaldehído en una campana de humo. - Después de 10 minutos de fijación, retire el formaldehído y lave con 2 ml de agua destilada cada poca.
- Añadir 1 mL de 1% de solución de manchas violetas de cristal a cada poca. Mancha durante 10 minutos. Retire la solución de manchas violetas cristalinas y lave con agua destilada 3 veces. Retire el agua y seque las placas.
- 7-10 días después de la radiación, cuando se forman muchas colonias y antes de que crezcan demasiado grandes y se fusionen, luego realice la tinción y el conteo de la siguiente manera. Retire el medio y lávelo brevemente con PBS. Agregue 1 ml de 4% de formaldehído a cada pocto para fijar las células.
- Conteo y cálculo de colonias
- Cuente el número de colonias con más de 50 células. No incluya colonias pequeñas con menos de 50 células. Revise las colonias bajo un microscopio para obtener una impresión de una colonia constituida por 50 células y márquela en la parte inferior de la placa con un rotulador.
NOTA: Fotografiar los pozos y utilizar el software ImageJ facilitará el proceso de conteo. - Calcular la eficiencia de la formación de colonias como el número de colonias divididas por el número de células sembradas. Calcular la fracción de supervivencia como la eficiencia de formación de la colonia a una cierta dosis de irradiación dividida por la eficiencia de formación de la colonia en 0 Gy.
- Utilizando la dosis como el eje X y la fracción de supervivencia como el eje Y, se puede obtener una curva de supervivencia. Compare las curvas de supervivencia entre las poblaciones de células positivas y negativas.
- Cuente el número de colonias con más de 50 células. No incluya colonias pequeñas con menos de 50 células. Revise las colonias bajo un microscopio para obtener una impresión de una colonia constituida por 50 células y márquela en la parte inferior de la placa con un rotulador.
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Representative Results
Se clasificaron las células A549 de 2-1-alto y 2-bajo A549 (Figura1A). Algunos marcadores pueden mostrar poblaciones distintas y son fáciles de gatear. Sin embargo, algunos marcadores solo muestran patrones de expresión altos y bajos, en lugar de poblaciones positivas y negativas distintas. En esta situación, un control de isotipo es muy importante para el gating. La expresión de 2x1 en las celdas ordenadas es validada por qPCR. La expresión de CACNA2D1, el gen que codifica el número 2, es mayor en células ordenadas de 2 a 1-alto en comparación con las células bajas de 21 (Figura1B).
La morfología típica de las esferas se muestra en la Figura 2A. La eficiencia de la formación de la esfera se calcula en las células de 2-alto y 2-1-bajo (Figura2B). Las células de 2o1-alta mostraron una mayor eficiencia en la formación de esferas, lo que sugiere una mayor capacidad de auto-renovación. Las imágenes típicas de las colonias celulares se muestran en la Figura 3A. Una colonia con unas 50 células puede ser examinada bajo un microscopio y marcada como referencia. Se puede calcular una fracción de supervivencia en cada dosis, y las curvas de supervivencia se presentan en la Figura 3B. Las células de 2o 1-alto son relativamente resistentes a la radiación en comparación con las células de 2o 1-bajo.
La prueba t-test de alumno de dos cara no emparejada se realizó para evaluar la importancia entre los grupos. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo. Los datos se representan con la media y la desviación estándar (SD). Se presentan datos representativos de al menos tres experimentos biológicamente independientes con resultados similares.
Figura 1: Clasificación de las células de 2-1-alto y -2-1-baja en A549. (A) Análisis representativo de la citometría de flujo de la expresión n.o 21. Las celdas se cierran en función del control de isotipo. (B) Confirmación de la expresión de 2o1 en poblaciones altas y bajas por QPCR. Las barras de error indican SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ensayo de formación de esferas de células A549 de 2o1-alto y A549 bajo. (A) Morfología representativa de las esferas formadas por las células ordenadas de 2a 1 y 2-baja (barra de 200 m). (B) Eficiencia de la formación de la esfera de las células de 2o 1-alto y -2-1-bajo. Las barras de error indican SD (***p < 0.001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ensayo de formación de colonias de células A549 de 2o1-alto y A549 bajo. (A) Imágenes representativas de las colonias formadas por las células ordenadas de 2-alto y 2-bajo. (B) Curvas de supervivencia de las células de 2o 1-alto y -2-bajo. El número de células sembradas fue de 200 células por pozo para 0 Gy, 400 células por pozo para 4 Gy, y 800 células para 8 Gy. Las barras de error indican SD (**p < 0.05, ***p < 0.001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe métodos para estudiar la radiosensibilidad de los CI en las líneas celulares cancerosas in vitro. En este estudio, la expresión de 2s 1 es continua en las líneas celulares DeNc. Por lo tanto, el gating se basa en un control de isotipo. Antes de ordenar, la expresión de 2o 1 debe examinarse en varias líneas de celda mediante citometría de flujo y validarse mediante QPCR o western blot. Se recomienda volver a analizar la expresión de 2o1 de las células ordenadas de 2a 1 y 2-baja por citometría de flujo, observando la fluorescencia bajo un microscopio fluorescente, o por QPCR (después de la clasificación).
El ensayo de formación de esferas es una forma sencilla de evaluar la capacidad de autorenovación, que puede utilizarse para caracterizar preliminarmente las CO putativas. Este método se ha utilizado para cultivar neuroesferas o mamesferas para caracterizar células madre en células de glioma o cáncer de mama, y la fórmula se modifica para cultivar otros tipos de cáncer4,6,10. EGF y bFGF pueden apoyar la auto-renovación de las células madre en medio libre de suero; sin embargo, los factores básicos de crecimiento y medio pueden diferir para el cultivo de diferentes tipos de células. El medio semisólido se utiliza para inmovilizar las células de modo que las esferas se formen por la proliferación celular en lugar de agruparse. La placa de fijación ultrabaja se utiliza en el experimento para mantener la morfología de la esfera. Además, a medida que las COSe enriquecen después del cultivo de la esfera, cuando las esferas se recogen, digieren y se sembran para la formación de esferas secundarias, es probable que la eficiencia de la formación de la esfera aumente en la propagación serial posterior9,10. Un criterio más riguroso para caracterizar los CIS es in vivo limitando el ensayo de dilución, en el que una serie de números de células positivas y negativas ordenadas se inyectan subcutáneamente en ratones inmunodeficientes, luego las frecuencias de las células tumorigénicas en positivo y las poblaciones de células negativas se calculan10,14. Si un marcador de células madre de cáncer putativo se identifica mediante el ensayo de formación de esferas, se recomienda una mayor caracterización mediante el ensayo de dilución limitante in vivo.
En este estudio se evalúa la radiación de las SC. El ensayo de formación de colonias es una forma clásica de evaluar la radiosensibilidad. Separación del mismo número de células en pozos paralelos en importancia. Ajuste el número de celda por ml a un rango adecuado para asegurarse de que el volumen de suspensión celular añadido a cada pozo sea superior a 100 ml. Si el volumen es demasiado pequeño, es probable que el error aumente. Para la radiación celular, se añade un medio con una altura de 1 cm para la acumulación de dosis, y se coloca un bolo equivalente a tejido debajo de la placa para la retrodispersión de dosis. Se recomienda a los investigadores que se refieran a los físicos y técnicos de radiación para configurar el modelo de radiación celular y calcular la dosis.
Este manuscrito proporciona los pocos pasos iniciales para el estudio de la radiosensibilidad de las CSC. Otros estudios de mecanismos pueden incluir proteínas relacionadas con la reparación del daño del ADN, aclaramiento de especies reactivas de oxígeno, detención del ciclo celular, etc.15. Estos experimentos necesitan una gran cantidad de células; por lo tanto, se necesitan muchos platos de células para ser preparados. La sobreexpresión o el derribo de genes CSC también proporcionan información importante sobre cómo los CSC ganan radiorresistencia.
Estos métodos pueden aplicarse potencialmente para identificar los CSC en los tejidos cancerosos. Zhang y otros describieron el aislación de células Lin-negativas positivas de CD166 a partir de muestras quirúrgicas de NSCLC12. Los tejidos fueron picados con una cuchilla estéril y digeridos con un cóctel enzimático. Las células recogidas al pasar a través de los coladores celulares fueron etiquetadas para la clasificación, y luego se caracterizaron por el ensayo de formación de esferas y el ensayo de dilución limitante in vivo. Para el número 21 como marcador de CSC, se ha informado de aislar la CSC en los tejidos quirúrgicos del carcinoma hepatocelular y los tejidos xenoinjertos derivados del paciente con cáncer de pulmón de células pequeñas10,16. Teniendo en cuenta que se requiere un alto número de células para el análisis, es relativamente difícil aislar los CSC en biopsias o células tumorales circulantes. Alternativamente, la tinción de las secciones de las biopsias puede potencialmente proporcionar pistas para la existencia de CSC en los tumores. Sin embargo, esta aplicación presunta debe evaluarse en los tejidos del paciente y en los datos clínicos.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (81402535 y 81672969) y National Key Research and Development Project (2016YFC0904703).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
- Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Wang, W. J., et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells. Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Gomez-Casal, R., et al. Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes. Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).
- Mihatsch, J., et al. Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro. Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).
- Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. Calcium channel α2δ1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).
- Zhao, W., et al. 1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel α2δ1 subunit. Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C.
- O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
- Morgan, M. A., Lawrence, T. S. Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways. Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).
- Yu, J., et al. Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel α2δ1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).
