Summary
Närvaron av cancer stamceller har förknippats med återfall eller dåliga resultat efter strålbehandling. Detta manuskript beskriver metoderna för att studera radio känslighet av cancer stamceller i lungcancer cellinjer.
Abstract
Närvaron av cancer stamceller (CSCs) har förknippats med recidiv eller dåliga resultat efter strålbehandling. Att studera radioresistenta CSCs kan ge ledtrådar för att övervinna radio resistens. Spännings-gated kalcium kanal α2δ1 subenhet isoform 5 har rapporterats som en markör för radioresistent CSCs i icke-småcellig lungcancer (NSCLC) cellinjer. Använda kalcium kanal α2δ1 subenhet som ett exempel på en CSC markör, metoder för att studera radiosensitivitet av CSCs i NSCLC cellinjer presenteras. CSCs sorteras med förmodade markörer av flödescytometri, och självförnyelse kapaciteten hos sorterade celler utvärderas av Sphere formation assay. Colony formation assay, som avgör hur många celler förlorar förmågan att generera ättlingar bildar kolonin efter en viss dos av strålning, utförs sedan för att bedöma radiosensitivitet av sorterade celler. Detta manuskript ger inledande steg för att studera radiosensitivitet hos CSCs, vilket skapar grunden för ytterligare förståelse för de bakomliggande mekanismerna.
Introduction
Strålbehandling spelar en viktig roll vid cancerbehandling. Förekomst av röntgen resistenta cancer stamceller (CSCS) kan dock leda till återfall eller dåliga resultat efter strålbehandling1,2. CSCs kännetecknas av sin självförnyelse kapacitet och förmåga att generera heterogena cancerceller3. Bepansrade med en effektivare DNA-skadereparations kapacitet eller högre nivåer av fria radikaler eller andra mekanismer är CSCs relativt resistenta mot strålbehandling4,5,6,7 , 8. identifiera CSC markörer och utforska deras mekanismer kommer att underlätta utvecklingen av läkemedel som kommer att övervinna radio resistens utan att öka normal vävnadsskada.
Spännings-gated kalcium kanal α2δ1 subenhet isoform 5 har rapporterats som en markör för radioresistent CSCs i NSCLC cellinjer9. α2δ1 identifierades ursprungligen som en CSC-markör för Hepatocellulär cancer (HCC)10. Med subtrantiv immunisering med ett par HCC-cellinjer härledda från de primära och återkommande tumörerna i samma patient identifierades en antikropp som hette 1B50-1 för att rikta återkommande HCC-celler specifikt. 1B50-1-positiva celler visade hög sfär formation effektivitet in vitro och hög tumorigenicitet in vivo. Dess antigen identifierades med masspektrometri, som kalcium kanal α2δ1 subenhet isoform 5. α2δ1 uttrycker särskilt CSCs och är omöjlig att upptäcka i de flesta normala vävnader, vilket gör det till en potentiell kandidat för att rikta CSCs10. α2δ1 kan också fungera som en CSC-markör för NSCLC-cellinjer, och det har visat sig förmedla radioresistens till NSCLC-celler delvis genom att öka effektiviteten av DNA-skadereparation som svar på strålning9.
Att studera radioresistenta CSCs kan ge ledtrådar för att övervinna radio resistens. Att använda α2δ1 i NSCLC som ett exempel, stora metoder för att studera radiosensitivitet av CSCs presenteras. Vanligtvis är CSCs isolerade med en förmodade yta markör, och stamcells egenskaper och radio känslighet av de positiva och negativa cellpopulationer jämförs. Sfär bildning i ett serumfritt medium kompletterat med tillväxtfaktorer som stöder självförnyelse är en användbar analys för att utvärdera stemness av celler in vitro-. Celler med hög sfär formation kapacitet kommer sannolikt att Visa hög tumorigenicitet när injiceras i immunbrist möss10,11,12. Colony formation assay används sedan för att bedöma radio känslighet av celler, som avgör hur många har förlorat förmågan att generera ättlingar bildar kolonin efter en dos av strålning13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: steg utförs under den angivna temperaturen. För steg där temperaturen inte nämns, utför under rumstemperatur (18 – 25 ° c). Cell odlingsmediet ska förvaras vid 4 ° c och andra reagenser ska förvaras i enlighet med tillverkarens anvisningar. Medel ska förvärmas till 37 ° c innan de tillsätts i cellerna.
1. cell sortering
- Konjugering av antikroppar
Obs: med tanke på den kortare inkubationstiden, är direktmärkt antikropp att föredra för cell sortering. Om ingen kommersiell direktmärkt antikropp finns tillgänglig, Använd fluorescekonjugerat reagens för att konjugera antikroppen till ett fluorescerande färgämne enligt tillverkarens anvisningar (se tabell över material). Som celler kommer att odlas efter sortering, alla steg bör utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp eller laminärt ren bänk. För att undvika kontaminering, antibiotika (penicillin och streptomycin) rekommenderas att läggas till odlingsmediet efter sortering.- Tillsätt 1 μL modifieringsmedel för varje 10 μL antikropp som ska märkas. Blanda försiktigt.
- Tillsätt blandningen av antikropp och modifierare direkt på den frystorkade fluorescein. Pipet försiktigt. Låt injektionsflaskan stå i 3 h eller över natten i rumstemperatur (RT) i mörker.
- Tillsätt 1 μL quencherreagens för varje 10 μL antikropp. Konjugaten kan användas efter 30 min. Fluorescekonjugaten kan förvaras vid 4 ° c i upp till 18 månader.
- Före sortering rekommenderas titrering av konjugerad antikropp. Förbered celler som uttrycker (t. ex. H1299 eller A549 för α2δ1) och inte uttrycker (t. ex. H1975) markören. Alikvot cellerna och inkubera dem med antikroppar vid olika koncentrationer (t. ex. 15 μg/mL, 7,5 μg/mL, 1,5 μg/mL och 0,75 μg/mL).
- Utför flödescytometrisk analys (med histogram eller dot Plot) och välj den koncentration i vilken positiva celler av H1299 eller A549 kan separeras från isotypen kontroll och H1975 celler har lite ospecifika signaler.
- Cell märkning
- Culture A549 celler i RPMI 1640 medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) i 10 cm rätter vid 37 ° c och 5% CO2 i en cellkultur inkubator. Smälta cellerna enligt följande för sortering när de når 80% – 90% sammanflödet (om 5 – 10 x 106 celler per maträtt).
- Ta bort odlingsmediet. Tvätta celler med 3 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) en kort stund. Tillsätt 3 mL 0,05% trypsin till varje maträtt. Ta bort trypsin och lämna restkompetens trypsin att smälta cellerna vid 37 ° c för 1 – 3 min. Kontrollera avlossning av cellerna ofta för att undvika övernedbrytning.
Obs: vissa cellinjer kan vara relativt svåra att smälta, såsom NSCLC-celllinjer H520 och PC9. I en sådan situation, 3 ml trypsin kan lämnas i skålen, snarare än matsmältningen med restkompetens trypsin. Dessutom kan digestionstiden förlängas. - När celler lossnar och börjar lossna från disken, tillsätt 3 mL RPMI 1640 medium kompletterat med 10% FBS och Pipettera cellsuspensionen till en 50 mL tub.
- Centrifugera vid 300 x g vid 4 ° c i 5 min. Kassera supernatanten. Tillsätt 10 mL PBS för att Omsuspendera cellerna. Överför 0,5 mL (eller minst 5 x 105 celler) cellsuspensionen till ett nytt rör som isotyp-kontroll. De återstående cellerna är för sortering.
- Centrifugera både kontroll-och experimentella rör vid 300 x g vid 4 ° c i 5 min. Kassera supernatanten.
- Bered arbetslösningen för färgning genom att späda den fluorescerande färg-konjugerade isotypkontrollen eller antikroppen i PBS till den optimala koncentrationen som titreras enligt ovan.
Anmärkning: i detta experiment späddes FITC-konjugerat 1B50-1 (antikroppen av α2δ1) till 7,5 μg/mL. Arbets lösningens volym är beroende av cell beloppet. - Omsuspendera kontroll-och experiment cellerna med varje fungerande lösning på ca 2 – 5 x 107 celler/ml och blanda försiktigt. Inkubera proverna vid RT under 30 – 40 minuter i mörker.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 10 mL PBS till prover, blanda försiktigt och centrifugera vid 300 x g vid 4 ° c i 5 min. Kassera supernatanten. Omsuspendera celler med 10 mL PBS.
- Sätt 40 μm cell silar på nya 50 mL rör för kontroll och experimentella celler respektive. Applicera cellsuspensionen på sil och samla genomflödet.
Anmärkning: det här steget tar bort cell klumpar som kan blockera kapillär cell Sorteraren. - Centrifugera genomflödet vid 300 x g vid 4 ° c i 5 min. Kassera supernatanten. Omsuspendera cellerna med 0,2 – 1,0 mL PBS och överför sedan till en 5 mL tub för flödescytometri.
- Cell sortering efter flödescytometri
- Bered två 5 mL-rör för att samla in positiva och negativa cellpopulationer. Tillsätt 1 mL RPMI 1640-medium i varje tub. Placera rören på cell Sorteraren samlings plattform.
- Analysera kontrollceller och experimentella celler respektive med dot Plot. Grind de levande cellerna med parametrarna framåt scatter (FSC) och Side scatter (SSC). Den positiva och negativa populationen av levande celler i enlighet med FL-1-intensiteten.
- Samla in α2δ1-positiva celler och α2δ1-negativa celler. Registrera antalet celler som erhållits.
- För att bekräfta att de skördade cell populationerna har olika nivåer av α2δ1-uttrycket kan en kvantitativ polymeraskedjereaktion (QPCR) utföras.
- Extrahera RNA av positiva och negativa celler med guanidinium kaliumtiocyanat reagens och omvänd avskrift RNA i cDNA enligt tillverkarens guide. Utför QPCR med SYBR Green reagens. Sekvenserna av primers är följande: α2δ1-F, CAGTTGAGATGGAGGATGATG; α2δ1-R, TTGTATGAGCAGTCGTGTGTC; GAPDH-F, GTCGGAGTCAACGGATTTGG; och GAPDH-R, AAAAGCAGCCCTGGTGACC.
2. analys av sfär bildning
Obs: Sphere formation assay används för att bestämma självförnyelse kapaciteten hos celler. Celler med självförnyelse kapacitet kan bilda sfärer i detta serumfritt semimassivt medium kompletterat med tillväxtfaktorer. Alla steg ska utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp eller laminärt ren bänk. För att undvika kontaminering, antibiotika (penicillin och streptomycin) rekommenderas att läggas till odlingsmediet efter sortering.
- Medelstora preparat
- Förbered 2x DMEM/F-12 medium genom beredning av ett 1 L-paket av DMEM/F-12 pulver i 475 mL destillerat vatten. Tillsätt 2,438 g NaHCO3. Justera pH till 7,0 – 7,2 genom att långsamt tillsätta 1 N NaOH eller 1 N HCl under omrörning. Tillsätt destillerat vatten till en slutlig volym på 500 mL. Sterilisera mediet genom att filtrera genom ett 0,2 μm filter.
- Bered en 2% metylcellulosalösning genom att tillsätta 2 g metylcellulosa i 100 mL destillerat vatten. Autoklav lösningen. Metylcellulosa kan visa en bomullsliknande tillstånd efter autoklavering. Blanda det genom att vända flaskan upp och ner försiktigt för några gånger och lämna den för naturlig kylning. Det kommer att bli en transparent halvfasta över natten.
- För att få 20 mL självförnyelse medium, tillsätt 10 mL 2x DMEM/F-12 medium till en 50 mL tub. Tillsätt 400 μL B27 till mediet. Tillsätt rekombinant human Epidermal tillväxtfaktor (EGF) till en slutlig koncentration på 25 ng/mL. Tillsätt rekombinant human basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) till en slutlig koncentration på 25 ng/mL. Tillsätt 2% metylcellulosa för att nå en slutlig volym på 20 mL.
- Blanda mediet med Vortex så att självförnyelse mediet erhålls.
- Cell sådd
- Överför de skördade cellerna till självförnyelse mediet för att nå 2000 celler/mL och blanda dem med en kort virvel. Tillsätt 100 μL cellsuspension till varje brunn i en ultra-låg infästning 96 väl plattan. Använd inte brunnarna vid plattans kant eftersom mediet är mer sannolikt att avdunta i dessa brunnar. Tillsätt steriliserat vatten till dessa brunnar.
- Kultur vid 37 ° c med 5% CO2 i cellkultur inkubator för 10 – 14 dagar. Tillsätt 50 μL självförnyelse medium dag 5 – 7.
- Sfärräkning och beräkning
- 10 – 14 dagar efter seedning, räkna antalet sfärer med mer än 50 celler (ungefär) eller med en diameter mer än 100 μm under ett mikroskop (4x objektiv, 10X okular).
Obs: med början från det övre vänstra av brunnen, räkna sfärerna medan du flyttar måltabellen horisontellt mot höger med joysticken i mikroskopet. Flytta sedan måltabellen till den mellersta raden i det visuella fältet och räkna sfärerna från höger till vänster. Flytta sedan till den undre raden och räkna från vänster till höger. En brunn på 96 väl plattan kan räknas inom tre rader. - Beräkna sfär bildningen effektivitet som antalet sfärer dividerat med antalet celler seedade. Jämför sfär bildningen effektivitet mellan positiva och negativa cellpopulationer.
- 10 – 14 dagar efter seedning, räkna antalet sfärer med mer än 50 celler (ungefär) eller med en diameter mer än 100 μm under ett mikroskop (4x objektiv, 10X okular).
3. analys av kolonibildning
Anmärkning: Colony formation analys används för att bestämma radiosensitivitet av celler. Strålning kan levereras med en linjär Accelerator som används för strålbehandling. Cell bestrålnings system för laboratoriebruk kan också användas om utrustningen finns tillgänglig. Steg 3,1, 3.2.3 och 3.2.6 ska utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp eller en laminär ren bänk. För att undvika kontaminering, antibiotika (penicillin och streptomycin) rekommenderas att läggas till odlingsmediet efter sortering.
- Cell sådd
- Förbered en 6 väl-platta för varje stråldos inklusive 0 Gy-gruppen. Tillsätt 1,5 mL medium till varje brunn på 6 väl plattan. Odlingssubstrat för kolonibildande analys är det konventionella RPMI 1640-mediet kompletterat med 10% FBS (benämnd som "färdigställda 1640").
- Späd skördade celler med färdig 1640 medium till 1000 celler/mL.
- Tillsätt cellsuspensionen till brunnarna. Skaka plattorna horisontellt för att göra cellerna fördela jämnt i brunnarna. Anteckna volymen som lagts till i varje dos grupp.
Anmärkning: generellt, utsäde 200 celler per brunn för 0 Gy, 200 celler för 2 Gy, 400 celler för 4 Gy, 800 celler för 6 Gy, och 1600 celler för 8 Gy, respektive. Det är bättre att justera cellnumren i osorterade celler i för experiment. - Kultur vid 37 ° c med 5% CO2 i cellkultur inkubator.
- Strålning
- Efter celler har fäst till botten av brunnarna (vanligtvis en dag efter sådd, och längre tid rekommenderas inte med tanke på cellproliferation), fortsätta att utföra cellstrålning.
- Beräkna antalet Monitor enheter (MU) för varje dos på ett djup av 1 cm i ett 20 cm x 20 cm strålningsfält.
Anmärkning: antal MU = dos (cGy)/produktionsfaktor för strålningsfältet/procentuell djupdos (PDD) för djupet. Till exempel är utgångs faktorn för ett 20 cm x 20 cm fält 1,066, PDD för 1,0 cm är 0,987, och antalet MU för 8 Gy (800 cGy) är 760 (800/1.066/0.987 = 760,35). Om flera plattor måste utstrålas för varje dos, kan ett större fält också användas, och antalet MU behöver räknas om enligt fältets storlek. Utgångs faktorn och PDD skiljer sig åt mellan olika acceleratorer. Se strålfysikerna för dessa parametrar. - Lägg färdiga 1640 till varje brunn för att nå 1 cm för höjden av mediet.
Obs: cell tillväxtområde på 6 väl plattan finns på tillverkarens guide. Till exempel, om tillväxtområdet är 9,5 cm2 för varje brunn av 6 väl tallrik, och 1,5 ml medium och 0,4 ml cellsuspension har lagts på dagen innan, tillsätt sedan 7,6 ml medium till brunnen. Höjden behövs för dos uppbyggnad. En medelhög höjd på mindre än 0,8 cm rekommenderas inte.
Observera: Förvara plattorna täckta under strålningen. När plattorna överförs mellan cellkultur rum och strålterapi rum, Linda plattorna med aluminiumfolie eller Lägg dem i en ren låda för att undvika kontaminering. Håll plattorna Plant för att undvika att mediet rinner ut. - Ställ in ett 20 cm x 20 cm strålfält. Placera en vävnad motsvarande bolus på 1,0 cm tjocklek på behandlingen soffan, och placera 6 väl plattan på bolus att hålla dem i kontakt. Se till att hela plattan är inom strålnings området. Ställ in käll hudens avstånd som 100 cm. Justera den medelhöga ytan till laser nivån genom att justera höjden på behandlings soffan.
Anmärkning: plattor med samma strålningsdos kan utstrålas samtidigt. I detta fall behövs ett större strålfält, och antalet MU ska räknas om enligt motsvarande utgångs faktor. Se till att alla plattorna är inom strålnings området. - Leverera varje tilldelad dos till varje platta i sekvens.
Varning: den linjära acceleratorn kan endast drivas av kvalificerade tekniker. Förvaras åtskilt från strålning. - Ta plattorna tillbaka till cellkultur rummet. Byt medium med 2 mL färdigt medium för varje brunn. Kultur vid 37 ° c med 5% CO2 i cellkultur inkubator. Ändra mediet var 3 – 5 dagar.
- Färgning
- 7 – 10 dagar efter strålning, när många kolonier bildas och innan de växer för stora och slås samman, sedan utföra färgning och räkna enligt följande. Ta bort mediet och tvätta kort med PBS. Tillsätt 1 mL 4% formaldehyd till varje brunn för att fixera cellerna.
FÖRSIKTIGHET: formaldehyd är volatil. Använd formaldehyd i ett draghuv. - Efter 10 min fixering, ta bort formaldehyd och tvätta med 2 mL destillerat vatten varje brunn två gånger.
- Tillsätt 1 mL 1% kristall violett fläck lösning till varje brunn. Fläcken i 10 min. ta bort kristallviolett fläck lösning, och tvätta med destillerat vatten 3 gånger. Ta bort vattnet och torka plattorna.
- 7 – 10 dagar efter strålning, när många kolonier bildas och innan de växer för stora och slås samman, sedan utföra färgning och räkna enligt följande. Ta bort mediet och tvätta kort med PBS. Tillsätt 1 mL 4% formaldehyd till varje brunn för att fixera cellerna.
- Koloniräkning och beräkning
- Räkna antalet kolonier med mer än 50 celler. Ta inte med små kolonier med mindre än 50 celler. Kontrollera kolonierna under ett mikroskop för att få ett intryck av en koloni som utgörs av 50 celler och markera den på botten av plattan med en märkpenna.
Obs: fotografering av brunnar och använda programvaran ImageJ kommer att underlätta inventeringsprocessen. - Beräkna kolonibildningen effektivitet som antalet kolonier dividerat med antalet celler seedade. Beräkna överlevnad fraktion som kolonin bildandet effektivitet vid en viss bestrålnings dos dividerat med kolonin bildandet effektivitet vid 0 Gy.
- Använda dosen som x-axeln och överlevnad fraktion som y-axeln, en överlevnads kurva kan erhållas. Jämför överlevnadskurvor mellan positiva och negativa cellpopulationer.
- Räkna antalet kolonier med mer än 50 celler. Ta inte med små kolonier med mindre än 50 celler. Kontrollera kolonierna under ett mikroskop för att få ett intryck av en koloni som utgörs av 50 celler och markera den på botten av plattan med en märkpenna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
α2δ1-High och α2δ1-Low A549 cells sorterades (figur 1a). Vissa markörer kan visa distinkta populationer och är lätta att utfärda utegångsförbud för. Men vissa markörer visar bara höga och låga uttrycksmönster, snarare än distinkta positiva och negativa populationer. I det här fallet är en isotypen-kontroll mycket viktigt för gating. Uttrycket av α2δ1 i sorterade celler valideras av qPCR. Uttrycket av CACNA2D1, genen som kodar α2δ1, är högre i sorterade α2δ1-höga celler jämfört med α2δ1-Low Cells (figur 1b).
Typiska morfologiska områden visas i figur 2A. Sfär bildnings effektiviteten beräknas i α2δ1-High och α2δ1-Low Cells (figur 2b). α2δ1-höga celler visade högre sfär bildning effektivitet, vilket tyder på en högre självförnyelse kapacitet. Typiska bilder av cellkolonier visas i figur 3a. En koloni med ca 50 celler kan undersökas under mikroskop och markeras som referens. En överlevnads fraktion vid varje dos kan beräknas och överlevnads kurvorna presenteras i figur 3b. α2δ1-höga celler är relativt motståndskraftiga mot strålning jämfört med α2δ1-låga celler.
Unparade tvåsidig students t-test utfördes för att utvärdera betydelsen mellan grupperna. Värdet p < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant. Data representeras med medelvärdet och standardavvikelsen (SD). Representativa data från minst tre biologiskt oberoende experiment med liknande resultat presenteras.
Figur 1: sortering av α2δ1-High och α2δ1-Low cells i A549. A representativ flödescytometri analys av α2δ1-uttrycket. Celler är gated baserat på isotypen-kontroll. B) bekräftelse av α2δ1-uttryck i höga och låga populationer med qPCR. Felstaplarna indikerar SD. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: sfär bildnings analys av α2δ1-High och α2δ1-Low A549 Cells. A) representativ morfologi för de områden som bildas av de sorterade α2δ1-High-och α2δ1-Low-cellerna (bar = 200 μm). B) sfäriskt bildande verkningsgrad för α2δ1-High och α2δ1-Low Cells. Felstaplar indikerar SD (* * * p < 0,001). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kolonibildande analys av α2δ1-High och α2δ1-Low A549 Cells. A representativa bilder av de kolonier som bildas av de sorterade α2δ1-High-och α2δ1-Low-cellerna. B överlevnadskurvor av α2δ1-High-och α2δ1-Low-celler. Antalet seedade celler var 200 celler per brunn för 0 Gy, 400 celler per brunn för 4 Gy, och 800 celler för 8 Gy. Felstaplar indikerar SD (* * p < 0,05, * * * p < 0,001). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver metoder för att studera radiosensitivitet av CSCs i cancer cellinjer in vitro. I denna studie är uttrycket av α2δ1 kontinuerligt i NSCLC-cellinjer. Därför är gating baserad på en isotypen-kontroll. Före sortering skall α2δ1-uttrycket undersökas i flera cellinjer med flödescytometri och valideras av QPCR eller Western blot. Det rekommenderas att analysera α2δ1-uttrycket för de sorterade α2δ1-High-och α2δ1-Low-cellerna med flödescytometri genom att observera fluorescens under ett fluorescerande Mikroskop, eller genom QPCR (efter sortering).
Sphere formation assay är ett enkelt sätt att utvärdera självförnyelse kapacitet, som kan användas för att preliminärt karakterisera förmodade CSCs. Denna metod har använts för att odla neurosfärer eller mammosfärer för att karakterisera stamceller i gliom eller bröstcancerceller, och formeln är modifierad för att odla andra typer av cancer4,6,10. EGF och bFGF kan stödja självförnyelse av stamceller i serumfritt medium. men grundläggande medel-och tillväxtfaktorer kan variera för odling av olika celltyper. Det semisolida mediet används för att immobilisera celler så att sfärer bildas genom cellproliferation snarare än klustring tillsammans. Ultralow fästplatta används i experimentet för att bibehålla sfär morfologi. Dessutom, som CSCs berikas efter sfär kultur, när sfärerna samlas in, smält, och seedade för sekundär sfär bildning, sfär bildning effektivitet kommer sannolikt att öka i efterföljande seriell förökning9,10. Ett mer rigoröst kriterium för karakterisering av CSCs är in vivo begränsande utspädnings analys, där en serie av antal sorterade positiva och negativa celler injiceras subkutant i möss med nedsatt immunförsvar, då frekvenserna av tumorigena celler i positiva och negativa cellpopulationer beräknas10,14. Om en förmodade cancer stamcells markör identifieras genom Sphere formation assay, ytterligare karakterisering av in vivo begränsande utspädning assay rekommenderas.
I denna studie utvärderas radiosensitiviteten hos CSCs. Colony formation assay är ett klassiskt sätt att bedöma radiosensitivitet. Sådd samma antal celler i parallella brunnar i viktiga. Justera cellnumret per mL till ett lämpligt intervall för att säkerställa att volymen av cellsuspensionen tillsätts till varje brunn är mer än 100 μL. Om volymen är för liten, är felet sannolikt att öka. För cellstrålning tillsätts medel med en höjd på 1 cm för dos uppbyggnad, och en vävnadsekvivalent bolus placeras under plattan för dos-Backscatter. Forskare rekommenderas att hänvisa till strålnings fysiker och tekniker för att ställa in cellstrålningsmodellen och beräkna dosen.
Detta manuskript ger de inledande stegen för radiosensitivitetsstudien av CSCs. Ytterligare mekanismer studier kan omfatta proteiner relaterade till DNA-skador reparation, clearance av reaktiva syreradikaler, cellcykelarrest, etc.15. Dessa experiment behöver en stor mängd celler; Därför, många rätter av celler behövs för att förberedas. Överuttryck eller knockout/knockdown av CSC gener ger också viktiga insikter i hur CSCs få radioresistens.
Dessa metoder kan potentiellt tillämpas för att identifiera CSCs i cancer vävnader. Zhang et al. beskrev isolera CD166-positiva lin-negativa celler från NSCLC kirurgiska prover12. Vävnader hackades med ett sterilt blad och smältes med en enzym cocktail. Celler som samlats in genom att passera genom cell silar var märkta för sortering, och sedan kännetecknas av sfär formation analys och in vivo begränsande utspädning assay. För α2δ1 som en CSC-markör, har det rapporterats att isolera CSC i Hepatocellulär cancer kirurgiska vävnader och småcellig lungcancer patient-härledda xenograft vävnader10,16. Med tanke på ett stort antal celler krävs för analys, är det relativt svårt att isolera CSCs i biopsier eller cirkulerande tumörceller. Alternativt kan färgning av delar av biopsier potentiellt ge ledtrådar för förekomsten av CSC i tumörerna. Emellertid, denna presumtiva ansökan måste utvärderas i patientens vävnader och kliniska data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81402535 och 81672969) och nationella viktiga forsknings-och utvecklingsprojekt (2016YFC0904703).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
- Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Wang, W. J., et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells. Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Gomez-Casal, R., et al. Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes. Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).
- Mihatsch, J., et al. Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro. Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).
- Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. Calcium channel α2δ1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).
- Zhao, W., et al. 1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel α2δ1 subunit. Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C.
- O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
- Morgan, M. A., Lawrence, T. S. Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways. Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).
- Yu, J., et al. Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel α2δ1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).
