Summary
Cell divisioner kan visualiseras i realtid med hjälp av fluorescerande märkta proteiner och tidsfördröjd mikroskopi. Med hjälp av protokollet som presenteras här, kan användare analysera cell Division timing dynamik, mitotisk spindel församling, och kromosom kongression och segregering. Defekter i dessa händelser efter RNA-interferens (RNAi)-medierad genknockdown kan bedömas och kvantifieras.
Abstract
Drosophila S2-celler är ett viktigt verktyg för att studera Mitos i vävnads kulturen, vilket ger molekylära insikter i denna grundläggande cellulära process på ett snabbt och högt genomflöde. S2-celler har visat sig mottagliga för både fast-och Live-cell Imaging applikationer. I synnerhet kan levande cell avbildning ge värdefull information om hur förlust eller knockdown av en gen kan påverka kinetik och dynamik av viktiga händelser under celldelningen, inklusive mitotisk spindel församling, kromosom kongression och segregering, samt övergripande cellcykelns timing. Här använder vi S2 celler stabilt transfekterade med fluorescerande märkta mcherry: α-tubulin för att markera den mitotiska spindeln och GFP: cenp-a (kallad CID-genen i Drosophila) för att markera Centromeren för att analysera effekterna av viktiga mitotiska gener på tidpunkten för cell divisioner, från profas (särskilt vid uppdelning av kärnkrafts kuvert; NEBD) till uppkomsten av Anaphase. Detta Imaging-protokollet möjliggör också visualisering av spindeln mikrotubule och kromosom dynamik i hela Mitos. Häri strävar vi efter att tillhandahålla ett enkelt men omfattande protokoll som gör det möjligt för läsarna att enkelt anpassa S2-celler för levande bild experiment. Resultat som erhålls från sådana experiment bör utvidga vår förståelse av gener som är involverade i celldelningen genom att definiera deras roll i flera samtidiga och dynamiska händelser. Observationer som gjorts i detta cellkultursystem kan valideras och undersökas ytterligare in vivo med hjälp av den imponerande verktygslåda av genetiska metoder i flugor.
Introduction
Cell Division är en process som är kritisk till alla multicellulära organismer, både i deras utveckling och homeostas1. Drosophila har länge använts som modell för studiet av celldelning, med experiment i olika vävnadstyper och genetiska förhållanden som ger viktiga insikter i processen. Även om många av dessa insikter kommer från fasta cell förhållanden, är cell Division en dynamisk procedur med många rörliga delar, vilket gör visualisering av levande celler integrerad för att bedöma RNAi eller genetiska knockout effekter på många delar av celldelning, inklusive och segregering samt cytokinesi.
Många protokoll har utvecklats och utnyttjats under årens lopp för att visualisera Drosophila cell divisioner in vivo. Olika grupper har odlat tekniker till avbildar uppdelningar i båda larv imaginal disketter och larv hjärna2,3,4,5,6,7,8 . Dessa tekniker, medan användbara för avbildning i specifika vävnader, är begränsade i genomströmningen och kräver ofta generering och underhåll av genetiska bestånd för att generera fluorescerande komponenter och förändra uttrycket av gener av intresse. Odlade S2-celler från Drosophila ger ett högre genomströmnings alternativ för att snabbt testa effekterna av olika gener i celldelningen. Dessutom, med förmågan att transfect olika fluorescerande proteiner, S2-celler kan snabbt modifieras för att bestämma effekterna av RNAi knockdown på många komponenter i celldelning. Fluorescent taggade gener av intresse kan också observeras i celldelning, vilket möjliggör dynamisk karakterisering av deras funktion9.
Här ger vi ett detaljerat protokoll för levande avbildning av mitotiska S2-celler med metoder som vi nyligen beskrev10. Vår metod utnyttjar stabilt transfekterade celler med fluorescerande markörer för mikrotubuli och centromerer vars uttryck är under kontroll av en kopparinducerbar promotor (metallothionein; PMT). Denna metod kan användas för att bild spindel och kromosom dynamik i alla faser av Mitos utnyttjar en relativt enkel fluorescerande Mikroskop med grundläggande bildprogram. Det kan anpassas ytterligare för att passa enskilda forskningsbehov, med övergående transfektion och RNAi erbjuder utökade möjligheter för att bestämma rollen av kandidatgener i Mitos. På grund av protokollets relativa enkelhet kan den användas för småskaliga skärm bilds skärmar för att identifiera gener för vilka ytterligare studier in vivo skulle vara fördelaktiga, vilket möjliggör mer fokuserade insatser och effektivitet med efterföljande genetiska manipulation i flugor.
Protocol
1. beredning av S2-celler för behandling med RNAi
-
Från en stock kultur av konfluenta PMT: GFP: CID och PMT: mcherry: α-tubulin stabilt transfekterade S2-celler (~ 80% livskraftigt; odlas vid 24-28 ° c), frö celler i en 6 väl steril odlings platta med en densitet av 1 x 106 celler/ml i färskt, värmt, 10% foster bovint serum (FBS) kompletterade Schneider ' s insekt media (SIM).
Notera: stabilt överförda S2-celler kan genereras genom att följa ett protokoll från Drosophila RNAi screening Center (drsc) (https://dgrc.bio.Indiana.edu/Protocols?Tab=cells). Även om den specifika stabila S2-linjen som används häri utnyttjar GFP och mCherry finns det många alternativ både inom dessa fluorescerande spektra och andra. En detaljerad diskussion om dessa fluorescerande proteiner är bortom tillämpningsområdet för detta protokoll, men deras egenskaper och potentiella fördelar/nackdelar har sakkunnigt granskats på annat håll 11.- Med hjälp av en cell räknare eller hemocytometer, bestämma tätheten av konfluenta cell lager.
- Bestäm volymen av konflytande cellsuspension som krävs för att uppnå 1 x 106 celler/ml i en total volym på 4 ml (t. ex. ~ 4 x 106 totala celler). Lägg till denna volym av cell lager till en volym av färskt SIM för att göra 4 mL/väl total volym. Bestäm cell beståndets densitet (celler/mL) genom att späda 100 μL celler direkt från kolven med 100 μL media och räkna denna 1:2 spädning antingen manuellt med en hemocytometern eller med en automatisk cell räknare om sådan finns.
Anmärkning: Om användning av S2-celler inte är stabilt transfected, kan en övergående transfektionstest med Fluorescent taggade (GFP, mCherry, etc.) α-eller β-tubulin, och en DNA-markör (CENP-A, Histone H2B, etc.) utföras. Ytterligare, stabilt transfekterade cellinjer med olika mitotisk spindel och DNA-markörer finns tillgängliga från Drosophila Genetics resurs Center som bättre kan passa de exakta experimentella behoven hos användaren (https://dgrc.bio.Indiana.edu/cells/Catalog). - Placera nyseedade celler i 24-28 ° c inkubator för 36-48 h.
2. behandling av seedade celler med dsRNA mot gen (er) av intresse
Anmärkning: Följande exempel och resultat avsnitt kommer att använda shortstop (Shot), en Actin-Microtubule crosslinking agent som genen av intresse. Använd en mock-behandling utan dsRNA eller med dsRNA riktad mot en irrelevant gen (t. ex. beta-galaktosidas, lacz) som en negativ kontroll.
- Warm Schneider ' s insekt media inte kompletteras med FBS (serum fria medier; SFM) i 24-28 ° c inkubator.
-
Överför celler från den tidigare seedade brunnen (från steg 1.1.2) till ett 15 mL sterilt rör och notera den totala mängden överförda celler.
- Behåll en liten mängd celler (~ 100 μL) för att räkna i en cell räknare eller hemocytometer.
- Försiktigt pellets celler genom centrifugering vid 1 000 x g i 3 min vid rumstemperatur.
- Medan centrifugering celler, bestämma koncentrationen av celler per mL med hjälp av en cell räknare eller hemocytometer. Multiplicera detta tal med den totala volymen som centrifugeras (anges i 1.2.2.) för att få det totala antalet celler.
- Aspirera supernatanten från pelleterade celler.
-
Återsuspendera cellerna i värmas SFM för att få en koncentration av 3 x 106 celler/ml.
- Överför 1 mL av de återsuspenderade cellerna till en ny brunn i en 6-brunn tallrik.
- Tillsätt 10-50 μg dsRNA (utspädd i 100 μL av RNAase-fritt vatten) mot skott (eller målgenen av intresse) direkt till cellerna och snurra plattan för att blanda. Inkubera plattan i 1 h i inkubatorn 24-28 ° c för att möjliggöra direkt dsRNA-upptag i celler.
- Under 1 h inkubering, värm 10% FBS kompletteras SIM i 24-28 ° c inkubator.
- Efter inkuberande celler med dsRNA för 1 h, tillsätt 2 mL 10% FBS kompletteras SIM direkt till brunnen utan att ta bort 1 mL av media.
- Placera celler i 24-28 ° c inkubator för 3-7 dagar.
Anmärkning: Som med dsRNA koncentration, kan den totala behandlingstiden behöva optimeras för önskad målgen. För att utvärdera RNAi effekt, utföra en västerländsk blot på hela cellen celllysat med en antikropp mot målgenen. Om den initiala dsRNA-målsekvensen visar sig vara ineffektiv, utformar alternativa dsRNAs riktade mot unika sekvenser inom målgenen.
3. induktion av fluorescerande protein uttryck och beredning av celler för avbildning
- Om stabilt transfekterade celler genererades med hjälp av PMT plasmid (innehållande en inducerbar metallothionein promotor) som beskrivs här, inducera uttryck av fluorescerande proteiner genom att behandla celler med kopparsulfat (CuSO4) vid en slutlig koncentration av 500 μM för 24-36 h före avbildning och 4 dagar efter RNAi-behandling. Användning av konstitutiva uttryck plasmider såsom pAct kräver inte koppar induktion.
-
Förbered celler för avbildning
- Värm 10% FBS kompletteras SIM i 24-28 ° c inkubator för 1 h.
- Överför celler till ett 15 mL sterilt rör och notera den totala mängden överförda celler.
- Behåll en liten mängd celler (~ 100 μL) för att räkna i en cell räknare eller hemocytometer.
- Försiktigt pellets celler genom centrifugering vid 1 000 x g i 3 min vid rumstemperatur.
- Medan centrifugering celler, bestämma koncentrationen (celler/mL) med hjälp av en cell räknare eller hemocytometer. Multiplicera detta tal med den totala volymen som centrifugeras (anges i 2.2.2.) för att få det totala antalet celler.
- Aspirera supernatanten från pelleterade celler.
- Omsuspendera cellerna i färskt, värmde 10% FBS kompletteras SIM för att få en koncentration av 2 x 106 celler/ml. Tillsätt en lämplig mängd CuSO4 för att bibehålla 500 μm koncentration.
- Överför 200-500 μL av återsuspenderade celler till en brunn av en multi-well levande cell kammare och placera på inverterade fluorescerande Mikroskop. Låt cellerna bosätta sig i kammaren för 15-30 min före Imaging experiment.
Anmärkning: Levande cell kammare brunnar kan förbelagda med poly-L-lysin för ytterligare följsamhet.
4. Konfigurera ett Live-Cellbildningsprogram
Anmärkning: Live cell Imaging i detta experiment utfördes med hjälp av en inverterad avbildning system och dess tillhörande programvara (t. ex., Olympus IX83 med cellSens dimensions mjukvarupaket). Detaljerna kommer att skilja sig från Mikroskop tillverkare och mjukvarupaket; Därför listas allmänna riktlinjer och åtgärder nedan.
-
Med hjälp av programvara som kör inverterade fluorescerande Mikroskop, förbereda ett program för att avbilda en cell (eller celler) över tid.
- Öppna programvaran genom att dubbelklicka på programvarans skrivbordsikon.
- Skapa en ny experimentell fil genom att klicka på Arkivoch sedan på ny experimentell fil.
- Först infogar du en tids fördröjnings slinga som bilderna ska tas över. Gör detta genom att klicka på stoppuret ikonen (time-lapse loop ikon) från ikonfältet. Ange intervallet i s på fliken experiment hanterare och ange sedan antalet cykler på samma flik genom att dividera den önskade övergripande experiment längden (i s) med intervallet. Låt slingan upprepas under den önskade totala tidsperioden.
Anmärkning: Normalt tas bilder varje 30-60 s under en period av 3-4 h. - I tids fördröjnings slingskiktet infogar du en infraröd fokus kontroll för att bibehålla fokus för målet (om tillgängligt). För att göra detta, Lägg till en Z-drift kompensation (ZDC) steg inom tidsfördröjning loop lagret genom att klicka på torget med två pilar ikonen (flytta XY-ikonen) och välja Z-drift kompensation från rullgardinsmenyn.
Anmärkning: Termen infraröd fokus kontroll hänvisar till ett system genom vilket en infraröd puls används för att bibehålla ett konstant avstånd mellan målet och bild/bildbehandlings kammaren. Många Mikroskop har ett sådant system, var och en med sin egen egenutvecklade nomenklatur. Läsarna bör konsultera sin bruksanvisning eller representant för specifika namngivnings Detaljer. - Efter den infraröda fokuserings kontrollen, Lägg till ett steg i programmet för att ta en Multichannel-bild (t. ex. FITC för GFP och TRITC för mCherry) över en 3-5 z-stackar genom att först sätta in ett z-stack steg och sedan ange kanalen. Gör detta genom att lägga till ett flerkanaligt grupp skikt inom tids fördröjnings slingan genom att klicka på färg hjuls ikonen (flerkanalsgruppsikonen ). Lägg sedan till ett Z-stack loop-skikt i Flerkanalslagret genom att klicka på ikonen med tre lager (Z-stack-loop- ikonen). Ställ in önskad steg storlek och antal segment på fliken experiment hanterare och Ställ in exponeringen för varje kanal så lågt som möjligt för att minimera foto blekning.
Anmärkning: Z-stacken intervall, exponeringstid, och procent transmissionen för lysdioder kan variera. Typiskt i dessa experiment, använda tre z-stackar tas över en räckvidd på 3 μm, vilket ger ett intervall på 1 μm mellan varje stapel. Att definiera cellens mitt snarare än toppen och botten tenderar att leda till bästa resultat. Bilder samlas sedan in för varje kanal (s) vid en exponering av 50 ms och procent genomsläpplighet på 50% utan neutral densitet (ND) filter inkopplad.
5. bild dividera celler med levande cell Imaging program
Anmärkning: S2-celler kräver inte CO2 och växer optimalt vid 23-27 ° c. All avbildning utfördes vid omgivningstemperatur i ett välkontrollerat rum.
- Med hjälp av oculars, hitta den övre (eller nedre) hörnet av brunnen och fokusera målet (40-60x Oil Immersion) på cellerna med hjälp av mCherry (α-tubulin) kanal.
- Skanna längs toppen (eller botten) av brunnen för att flytta bort från den vertikala brunnen avdelare.
Anmärkning: Imaging för nära brunnen avdelare kan störa IR fokus kontroller. - Hitta en cell (eller celler) som är i sena G2 eller tidig M-fas (ProPhase).
Anmärkning: Dessa celler kan bäst identifieras genom förekomsten av exakt två "Star-liknande" mikrotubule strukturer (centrosomes) och en intakt kärna (indikeras av en cirkulär region av brytnings ljus i cellen), båda lätt särskiljas med hjälp av α-tubulin (röd) excitation filter. Val av celler i tidigare Interphase, anmärkningsvärt av en eller noll lätt synlig centrosomes, kan resultera i bortkastad tid på grund av en fördröjning i G2/M progression. Omvänt, val av celler efter NEBD kommer att förhindra korrekt beräkning av mitotisk timing och avbildning av tidig spindel församling och kromosom dynamik. Dessutom innehåller S2-celler ofta > 2 centrosomes. Även om dessa typiskt kluster till en bipolär spindel12, det rekommenderas att användare att undvika dessa celler om inte annat önskas för experimentell design. Bilder och diskussion av lämpliga celler att välja kan hittas i representativa resultat sektion. - Klicka på Live View-knappen för att börja visa celler i programvaru skärmen. Med hjälp av fin fokus ratten i mikroskopet, fokusera cellen (eller celler) av intresse. Ställ in den infraröda fokus kontrollen genom att klicka på knappen Ställ in fokus .
- Starta bildprogrammet för tidsfördröjning genom att klicka på Start -knappen. Justera histogrammen efter behov genom att välja önskad kanal och justera de genomsnittliga pixel intensiteterna för att se cellen (eller cellerna) av intresse tydligt.
- Låt programmet att köra, kontrollera cellen efter 15-20 min för att säkerställa nukleära kuvert uppdelning (NEBD) har inträffat, vilket bestäms av försvinnandet av rundan mörkt, en bryts plats nära cell Center.
- Fortsätt låta programmet att köra, kontrollera intermittent (varje 15-20 min) för att avgöra när Anaphasen debut har inträffat. Stoppa programmet vid det här tillfället om det finns mer tid kvar i den totala tidsperioden och spara filen. Alternativt, om händelser under Telophasen och cytokinesi är av intresse, låt programmet att köra en tillräcklig tid för att avbilda dessa processer också.
-
Utföra en analys av NEBD till Anaphasen tidpunkten genom att notera tiden för NEBD (tnebd) i min och tiden för initial kromosom separation (tAnaphasen debut) i min och subtrahera tnebd från tAnaphasen debut för att få NEBD till Anaphasen debut tid för en given cell.
- Gör detta genom att klicka på knappen ram upp och notera ramarna där nebd och Anaphasen debut inträffar, subtrahera dessa för att bestämma det totala antalet förflyta ramar, och multiplicera detta med tidsintervallet mellan bildrutor.
- Fortsätt att skanna efter förskiljande celler för att få flera n ' s för ett givet villkor. Celler kan avbildas i levande cell kammaren väl för upp till 12 h efter deras första sedimentering.
Representative Results
Metoder som vi beskriver ovan kommer att resultera i identifiering och avbildning av Drosophila S2-celler som genomgår celldelning. Celler som är på väg att dela sig (dvs. strax före inmatning av M-fas) kan riktas mot närvaron av två centrosomer och en intakt kärna som indikeras av ett avbrutna ljus och en mörkare fläck i cellen när den visas i α-tubulinkanalen (figur 1, vänster-de flesta paneler, röd kanal; pilspetsen i figur 1a). Vi uppskattar att cirka 2-5% av cellerna hamnar i denna kategori, och mellan bild experiment spenderar vi vanligtvis högst 2-3 minuter med att skanna efter en annan kvalificerad cell. NEBD kan visualiseras genom försvinnandet av denna mörka fläck, vilket resulterar i en enhetlig färgning av cytoplasman (figur 1, paneler märkta "00:00", röd). Efter NEBD, den tid varje cell tar att bilda spindeln, kongressen kromosomer, och segregera kromosomer kan mätas helt enkelt genom att notera de tidpunkter då dessa händelser i förhållande till NEBD.
Vi använder dessa divisioner för att bedöma mitotisk timing, särskilt av NEBD till Anaphasen debut, notera den punkt där kromosomer börjar separera. En majoritet (~ 90%) av kopparinducerade celler, uttryckt både mCherry: α-tubulin och GFP: CID. En liten andel av cellerna (~ 10%) uttryckt endast en markör eller neither. Dessa celler undantogs under cell val. Typiskt, S2 celler visar NEBD till Anaphasen debut timing av mellan 20-30 minuter (figur 1a, kontroll). Vi nästa behandlade celler med dsRNA riktade mot shortstop (Shot), en Actin-Microtubule crosslinking protein vi misstänkte kan påverka cellcykelns dynamik. I själva verket, efter skott knockdown celler uppvisade en betydande mitotisk fördröjning (figur 1b, shotrnai fördröjning), med många celler arrestera på metafas och aldrig övergår till Anaphasen under hela 2-3-timmars Imaging experiment (figur 1d, ShotRNAi arrest). Vi resonerade detta dröjsmål/gripande fenotyp kan sannolikt bero på aktivering av spindel församling Checkpoint (dvs M-faskontroll punkt). För att direkt testa denna hypotes, vi Co-behandlade celler med dsRNA mot skott och grov affär (Rod), en viktig del av denna Checkpoint13. Detta ledde till ett förtryck av gripandet fenotyp, vilket resulterar i NEBD till Anaphasen gånger liknande kontroll (figur 1c, shotrnai + RodRNAi). Sålunda, denna levande Imaging protokollet tillät oss att dra slutsatsen att skottet krävs för snabb M-fas progression och att dess förlust leder till Checkpoint aktivering som förseningar eller arresteringar mitotiska celler.
Bild 1: Live Imaging avslöjar cell Cycle defekter på grund av mitotisk kontrollpunkt aktivering i S2-celler.
I alla förhållanden, Live-cell Imaging utfördes på S2 celler stabilt Co-transfected med inducerbara GFP: CID och mCherry: αTubulin som beskrivs häri. (A) karikatyrerna illustrerar viktiga landmärken under Mitos, och motsvarande bilder visas från representativa filmer av indikerade genotyper med tidspunkter i förhållande till nebd (t = 00:00) indicerat. Kontrollceller typiskt framsteg till Anaphasen inom 20-30 min. ShotRNAi-behandlade celler visar NEBD-Anaphasen Delay (B) och ofta genomgår metafasgripandet, aldrig in Anaphasen inom imaging experiment (D). Samtidig behandling av celler med ShotRNAi och RodRNAi, en komponent i kontrollpunkten för spindel monteringen, dämpar skott fenotyp som leder till kinetik av Anaphasen som liknar kontrollceller (C). Pilarna i (a) indikerar "stjärnliknande" centrosom strukturer, och den stora pilspetsen indikerar kärnan. Varje skalstapel representerar 5 mikrometer. Denna siffra är anpassad och publiceras med tillstånd från10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-Authors). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Time-lapse film av "kontroll" S2 cell division. Video visar en representativ film av S2 cell Division i "kontroll" genotyp. Den här filmen motsvarar figur 1a. Denna video är anpassad och publiceras med tillstånd från10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-Authors). Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Video 2: Time-lapse film av fördröjd "ShotRNAi" S2 cell division. Video visar en representativ film av S2 cell Division i "ShotRNAi" genotyp som leder till en fenotypisk mitotisk fördröjning. Denna film motsvarar figur 1b. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Video 3: Time-lapse film av "ShotRNAi + RodRNAi" S2 cell division. Video visar en representativ film av S2 cell Division i "ShotRNAi + RodRNAi" genotyp. Den här filmen motsvarar siffran 1c. Denna video är anpassad och publiceras med tillstånd från10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-Authors). Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Video 4: Time-lapse film av arresterad "ShotRNAi" S2 cell division. Video visar en representativ film av S2 cell Division i "ShotRNAi" genotyp som leder till en fenotypisk mitotisk arrest. Den här filmen motsvarar figur 1d. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Discussion
Identifiera en lämplig cell
Nyckeln till avbildning dividera S2 celler är först lokalisera rätt cell. Tid kan slösas bort Imaging celler som felaktigt tros vara redo att dela men misslyckas med att göra det inom en rimlig tidsram. Celler måste identifieras som har två distinkta och synliga centrosomes och en intakt kärna. Centrosomes måste ha mikrotubule fibrer som utgår från dem, vilket ger dem en "stjärna-liknande" utseende. En intakt Nucleus bryts ljus när du justerar fokus, och gör också den ungefärliga mitten av cellen mörkare utseende. Kärnan kommer också att innehålla GFP: CID "dots", ett annat utmärkande drag för att hjälpa till i identifieringen. Celler med > 2 centrosomes, tubulin Auktor utan tubulin fibrer som utgår från dem, eller celler med bara en centrosom bör undvikas. Dessutom, om två centrosomes är synliga, men en kärna är inte, NEBD har redan inträffat och cellen är för långt framskriden i sin division att avbildas om en komplett M-fas analys önskas. När en lämplig cell hittas, är hastigheten i startavbildning avgörande eftersom NEBD sker snabbt (vanligtvis inom 3-5 min) och fördröja starten av Imaging kan leda till missade möjligheter. Fokusera cellen i bildprogrammet snabbt så att båda centrosomes är synliga, eller om centrosomes är ur plan med varandra, Ställ in brännpunkten mellan de två, så att varje kan fångas när Z stackar samlas över och under den definierade Center Punkt. När fokuserade, omedelbart ställa in förskjutningen mellan scenen och levande cell kammaren yta med hjälp av infraröd fokus kontroll (om tillgängligt) och börja Imaging programmet. Även om det protokoll som presenteras här är speciellt anpassad för experiment som bedömer NEBD-till-Anaphase dynamik, kan enkla modifieringar passa läsarna att studera alternativa mitotiska händelser. För NEBD-till-metafase och Anaphase-till-Telophase Imaging, föreslår vi 10 s bildfångst intervall eftersom dessa processer är mycket dynamiska och sker snabbt i S2-celler (5-10 min). Metafase-till-Anaphase Transition (vår typiska experimentella fokus) är en längre process (20-30 min) i S2-celler, och vi samlar in bilder med 30 s intervall. Slutligen, Telophase-through-cytokinesi sker ganska långsamt i S2-celler, och vi föreslår 60 s intervall ger tillräckligt med upplösning för denna ungefärliga timme långa processen.
Bibehålla fokus i hela avbildningsprogrammet
Om en enhet för IR-fokuserings kontroll inte är tillgänglig, se till att undvika att stöta på mikroskopet eller bordet den sitter på, eftersom detta kan resultera i att cellen rör sig ur fokus under avbildningsprogrammet, vilket leder till tvetydiga, un-interpretable resultat. Pre-beläggning levande cell kammaren brunnar med poly-L-lysin kan hjälpa i cell följsamhet, vilket kan bidra till att undvika cellförflyttning och är särskilt användbart för inställningar utan IR fokus kontroller. Dessutom kan inställningar inklusive stötdämpande plattformar eller luft bord ytterligare hjälpa till att undvika att celler flyttas ur fokus. Slutligen, vissa program har paus funktioner gör det möjligt för användaren att fokusera om och återuppta programmet.
Imaging flera celler
Användbart för ackumulering av data är att ofta flera celler redo att dela kan placeras inom samma synfält för avbildning. Detta kan vara särskilt användbart för experiment där celler har långa M-fas varaktigheter eller långvarig gripande (t. ex. tillstånd som inducerar aktivering av SAC). För dessa celler, vi normalt bild tills cellerna är fotoblekt (ca 2-3 h), men den fullständiga tidpunkten för arresterade celler bör vara efter bedömning av forskaren. Ibland kan flera förskiljande celler vara i olika fokalplan, i vilket fall det kan vara bra att lägga till z-stackar för att rymma alla celler. Lägga till fler z-stackar kan också bidra till att förbättra upplösningen. Försiktighet bör iakttas genom att göra detta, men eftersom det kommer att utsätta celler för mer strålning och leda till snabbare photoblekning, samt leda till stora filstorlekar på hårddisk lagringsenheter.
Undvika foto blekning och fototoxicitet
Vår metod beskriver specifika inställningar för exponeringstider, bildintervall, z-stackar och procentuell genomsläpplighet för vår LED-ljuskälla som i allmänhet fungerar för vår experimentella installation och önskade resultat. Eftersom Mikroskop och experimentella mål kan variera, vad kan fungera bra för vårt system kan leda till för tidig foto blekning eller fototoxicitet i andra. Photodamage kan utgöra en brist på spindel rörelse, mikrotubuli fragmentering, defekt mikrotubuli dynamik, och förlängd spindel kontrollpunkt aktivering. En potentiell metod för att undvika sådana fallgropar är att begränsa exponeringstiden. De flesta moderna kameror har nu breda dynamiska intervall, och histogram kan justeras för att visualisera strukturer även vid mycket låga exponeringar. En annan teknik är att öka bild intervallet (t. ex. till flera minuter mellan bilderna) så att antalet gånger en cell utsätts för ljus över ett totalt insamlingsintervall reduceras. Detta är fördelaktigt särskilt i Imaging för längre tidsperioder (många timmar), och kan dessutom bidra till att minska filstorleken på sådana experiment. Begränsa antalet z stackar kan också bidra till att minska ljus exponering, med 2 eller till och med bara 1 istället för 3. Ytterligare, justera procent transmissionen av ljus (för LED-ljuskällor), eller använda neutral densitet (ND) filter (för både halogenlampa och LED-ljuskällor) kommer att minska ljusintensiteten och i kombination med längre exponeringstider kan bevara sikten . Genom att välja celler med centrosomes redan separerade, kan den totala exponeringen begränsas i att dessa celler vanligtvis in Mitos snabbt (inom en minut eller två) efter början Imaging. Man kan också begränsa den tid som celler får avbildas före NEBD. Vårt labb ställer vanligtvis denna tid på 10 min, men en mer konservativ gräns kan lätt åläggas av användaren. Dessutom, en mer "invasiv" åtgärd vi rekommenderar är behandling med dsRNA riktade mot en del av SAC (såsom Rod eller Mad2). Om en gripandet fenotyp beror på icke-specifika cellskador (t. ex. defekt mikrotubule dynamik), är en sådan behandling mindre benägna att undertrycka gripandet jämfört med en bona fide effekt av genen av intresse i det ursprungliga experimentet.
Framtida riktningar
Den metod som beskrivs här kan utnyttjas på ett relativt enkelt epifluorescerande Mikroskop för att snabbt avbilda levande cell divisioner och kan enkelt anpassas för att passa en forskares speciella experimentella design och mål. Flera utmärkta metoder för odling, RNAi knockdown metoder, övergående transfektion och fluorescens mikroskopi har publicerats för S2 och andra Drosophila celler9,14,15, 16 , 17. vårt protokoll erbjuder ett par fördelar. (1) användningen av en dubbel stabil cellinjer (GFP: CID, mCherry: α-tubulin) markerar samtidigt två viktiga mitotiska strukturer, undviker krångel och potentiella komplikationer av övergående transfektion, och ser till att nästan alla celler kommer att uttrycka fluorescerande markörer som potentiella kandidater för avbildning. (2) anpassningen till Mitos bidrar till publicerade protokoll som undersöker cytoskeletala dynamik i motila, icke-skiljande celler och sträcker sig till att undersöka mitotiska händelser i realtid. Även om vi tror att vår är en kraftfull teknik som bidrar till repertoaren av andra, kan det alltid finnas förbättringar som gjorts. Ett särskilt område av celldelning som vi har funnit svårt att bilden är centrosom division. Detta inträffar före nebd och det är svårt att avgöra när en enda centrosom är redo att separera i två. Använda fluorescerande cell cykel markörer (Cyclin A och Cyclin B) kan hjälpa till att lösa detta problem, men kommer på bekostnad av kanaler som kan användas för att visualisera komponenter cell division. Vår bästa strategi för att försöka visualisera centrosom Division är att lägga till Multipoint förvärv till Imaging programmet (definiera olika punkter i XY planet till bild), men detta kan resultera i stora filer, och kan också kräva (beroende på antalet poäng) öka intervallet mellan Bildinsamling, minskande tidsupplösning för den resulterande filmen. En annan lösning kan vara synkronisering av celler vid en önskad cell cykel stadiet med hjälp av läkemedel som riktar cell cykel regulatorer följt av efterföljande blekt före avbildning, även om dessa metoder inte kan vara tillförlitlig i S2-celler specifikt.
Det protokoll som presenteras här ger en grund för framtida tillämpningar i levande cell avbildning samt. Med förbättrad avbildning och programvara teknik, verkligen hög genomströmning anpassningar av detta protokoll med högre kapacitet, multi-chambered plattor kan vara möjligt. Sådana innovationer skulle göra storskaliga RNAi skärmar, såsom de som redan uppnåtts i fasta preparat12,18, mer tractable i en levande cellformat. Små molekyler drog skärmar kan också vara tänkt som ett sätt att identifiera nya föreningar som riktar cell Division processer. Förbättring av fluoroforer och optiska filter kan också leda till avbildning av flera mitotiska komponenter (inte bara de två som vi beskriver), vilket möjliggör avbildning av specifika mitotiska regulatorer och deras interaktioner med DNA och/eller spindeln. Till exempel, generera celler med fluorescerande reportrar som uttrycker efter DNA-skador eller under apoptos skulle vara användbara verktyg för att identifiera nya gener inblandade i dessa processer. Liknande metoder kan användas för att undersöka cellcykelns dynamik med uttrycket av Fluorescent taggade cyclins19.
Disclosures
Författarna har inget att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Institutes of Health (R01 GM108756). Vi är tacksamma mot Gary karpen (University of California, Berkeley) för generöst förse oss med en GFP: CID S2 cellinjer lager som vår GFP: CID/mCherry: αTubulin linje genererades10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | for cell counting |
| cellSens imaging software | Olympus | ||
| CELLSTAR Cell Culture Flask, 50 mL, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10 PCS/BAG | Greiner Bio-One | 690175 | |
| CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Centrifuge 5804 R | eppendorf | Cat. 022623508 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% | Sigma-Aldrich | C3036-250G | |
| Corning Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35015CV | |
| Effectene Transfection Reagent 1 mL | Qiagen | 301425 | for transient transfection |
| IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope | Olympus | ||
| LabTek Chambered Slide Insert | Applied Scientific Instruments | I-3016 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | For dsRNA production |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit | ORFLO | MXZ001 | for cell counting |
| MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller | Applied Scientific Instruments | ||
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
| Orca-Flash 4.0 LT Camera | Hammamatsu Photonics K.K. | C11440-42U | |
| pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets | Labconco | 302310000 | |
| Schneider's insect medium | Sigma-Aldrich | S0146-100ML | |
| Spectra Tub Centrifuge Tubes | VWR | 470224-998 | |
| Uner Counter BOD Incubator | Sheldon manufacturing (VWR) | 89409-346 | |
| X-CITE 120 LED | ExcelitasTechnologies | Led light source | |
| Z -Drift Compensator (ZDC) | Olympus | infrared focus check |
References
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Cell division and the maintenance of epithelial order. Journal of Cell Biology. 207 (2), 181-188 (2014).
- Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (32), 14217-14222 (2010).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Imaginal Discs. Methods in Molecular Biology. 1478, 203-213 (2016).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).
- Dewey, E. B., Johnston, C. A. Diverse mitotic functions of the cytoskeletal cross-linking protein Shortstop suggest a role in Dynein/Dynactin activity. Molecular Biology of the Cell. 28 (19), 2555-2568 (2017).
- Rodriguez, E. A., et al. The Growing and Glowing Toolbox of Fluorescent and Photoactive Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes and Development. 22 (16), 2189-2203 (2008).
- Basto, R., Gomes, R., Karess, R. E. Rough deal and Zw10 are required for the metaphase checkpoint in Drosophila. Nature Cell Biology. 2 (12), 939-943 (2000).
- Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).
- Lu, W., Del Castillo, U., Gelfand, I. V. Organelle transport in cultured Drosophila cells: S2 cell line and primary neurons. Journal of Visualized Experiments. (81), e50838 (2013).
- Yang, J., Reth, M. Drosophila S2 Schneider cells: a useful tool for rebuilding and redesigning approaches in synthetic biology. Methods in Molecular Biology. 813, 331-341 (2012).
- Zhou, R., Mohr, S., Hannon, G. J., Perrimon, N. Inducing RNAi in Drosophila cells by soaking with dsRNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (5), (2014).
- Goshima, G., et al. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316 (5823), 417-421 (2007).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
