Este protocolo descreve a dissecção e a cultura de pilhas neurais cranianas da crista dos modelos do rato, primeiramente para o estudo da migração da pilha. Nós descrevemos as técnicas ao vivo da imagem latente usadas e a análise da velocidade e da forma da pilha muda.
Ao longo das últimas décadas tem havido um aumento da disponibilidade de modelos de rato geneticamente modificados utilizados para imitar as patologias humanas. No entanto, a capacidade de estudar os movimentos celulares e a diferenciação in vivo ainda é muito difícil. As neurocristopatias, ou distúrbios da linhagem da crista neural, são particularmente desafiadoras para estudar devido à falta de acessibilidade dos principais estágios embrionários e as dificuldades em separar a crista neural mesênquima do mesênquima mesodérmico adjacente. Aqui, nós estabelecemos para estabelecer um protocolo bem definido, rotineiro para a cultura de pilhas neural cranianas preliminares da crista. Em nossa aproximação nós dissecamos para fora a beira neural da placa do rato durante a fase neural inicial da indução da crista. A região da borda da placa neural é explantados e cultivada. O formulário neural das pilhas da crista em uma folha epithelial que circunda a beira neural da placa, e por 24 h após o explant, começa a delaminate, submetendo-se a uma transição epithelial-mesenchymal (EMT) para transformar-se pilhas neurais inteiramente motile da crista. Devido a nossa aproximação bidimensional da cultura, as populações distintas do tecido (placa neural contra a crista neural premigratory e migratória) podem facilmente ser distinguidas. Usando abordagens de imagem ao vivo, podemos então identificar alterações na indução da crista neural, EMT e comportamentos migratórios. A combinação desta técnica com mutantes genéticos será uma abordagem muito poderosa para a compreensão da biologia neural normal e patológica da célula da crista.
A linhagem da crista neural (NC) é uma população transitória, multipotente e migratória de células que aparece exclusivamente em vertebrados durante o desenvolvimento embrionário precoce1,2. Os derivados da crista neural são extremamente diversificados, e incluem glia, músculo liso, melanócitos, neurônios e osso craniofacial e cartilagem3,4. Como a crista neural contribui para a função de muitos sistemas de órgãos, essa linhagem é essencial para a embriogênese humana. O desenvolvimento aberrante do NC é implicado em uma escala larga dos defeitos de nascimento humanos os mais comuns (isto é, fissura labial e palato)5, e igualmente desordens tais como Hirschsprung ‘ doença de s (HSCR), síndrome de Wardensburg (WS), síndrome da carga e síndrome de Williams6 ,7,8,9.
O desenvolvimento do NC foi explorado em um número de sistemas modelo não-mamíferos que incluem modelos de Xenopus, de pintainho e de zebrafish. Em mamíferos, o trabalho em modelos de mouse identificou alguns dos principais eventos genéticos subjacentes ao desenvolvimento da crista neural; no entanto, tem sido mais difícil seguir a biologia celular da migração da crista neural, devido à inacessibilidade do embrião do camundongo (revisado em outros10,11). Além disso, enquanto os estudos em pintainho, Xenopus e zebrafish estabeleceram uma rede reguladora do gene para NC, a perda de estudos da função nestes modelos animais às vezes não exibem um phenotype comparável no rato. Por exemplo, em xenopus, zebrafish e Chick, a sinalização não canônica de WNT é um dos mecanismos celulares que permite que a NC Adquira sua capacidade migratória12,13,14,15 . No entanto, no mouse, a perda de sinalização WNT não-canônica não parece afetar a migração16. Como in vivo NC migração tem sido difícil de rastrear por longos períodos de mouse, não está claro se estas espécies-diferenças refletem diferentes modos de migração, ou diferenças na regulação molecular.
Como observado, estudos NC no mouse têm sido muito desafiador, porque a cultura ex utero de embriões é trabalhoso. Além disso, o NC é constantemente no contato íntimo com os tecidos adjacentes tais como o mesoderma e o neurectoderm. O uso recente de motoristas de CRE específicos da crista neural ou corantes exógenos nos permitiu rotular de forma fluorescentamente a NC migratória; no entanto, essas abordagens ainda são limitadas. Apesar dos relatórios múltiplos que descrevem técnicas diferentes para visualizar a migração NC17,18, temsido difícil resolver estas técnicas em um procedimento simples e rotineiro.
É evidente que há necessidade de técnicas que permitam o manuseio e caracterização da NC de mamíferos. Nós focamos nossos esforços no NC craniano do rato porque é o modelo preliminar para estudar o desenvolvimento craniofacial humano e os neurocristopathies. Refinamos nossa abordagem com base em vários relatórios interessantes descrevendo a cultura primária das células NC19,20,21. Aqui, nós descrevemos completamente as técnicas ideais da cultura para de pilhas preliminares do NC. Nós demonstramos o método vivo da imagem latente da pilha e o uso óptimo de matrizes diferentes para revestir as placas da cultura. Nosso protocolo descreve como capturar a migração de células NC ao vivo usando um microscópio invertido, que se destina como uma diretriz para uso com outros microscópios, bem como um resumo detalhado de nossas análises celulares.
O resultado esperado do explante deve ser uma distribuição lindamente estabelecida de células que são claramente distinguidas o microscópio, onde se pode ver três diferentes populações de células que representam (i) placa neural, (II) premigratory, e, (III) células da crista neural migratória. Nós demonstramos como analisar os comportamentos da pilha na beira da população premigratory das pilhas durante a transição epithelial-mesenchymal. Também concentramos nosso esforço em estudar células totalmente migratórias para velocidade celular, distância e morfologia celular.
Estudar células de crista neural de mamíferos tem sido um desafio para os cientistas por causa da natureza in utero do desenvolvimento de mamíferos. Estudos in vivo são difíceis de configurar, pois o embrião deve ser manipulado em condições que imitam a vida no útero. Na prática, é quase impossível a cultura rereproduvelmente estes (E8 +) embriões por mais de 24 h, especialmente para imagens ao vivo. Além disso, a indução e a migração da crista neural ocorrem concomitantemente com o fechamento do tubo neural e o torneamento embrionário no camundongo; Este é um evento morfogenético crucial e estressante, que freqüentemente falha quando os embriões são cultivados ex utero. Assim, a taxa de sucesso de abordagens ex utero é geralmente baixa. O uso de células NC imortalizadas21 é uma ferramenta útil para reduzir o uso de animais e pode fornecer uma melhor fonte de células de crista neural para análise a longo prazo, transfecção e estudos de enriquecimento. No entanto, há claramente uma necessidade de cultura confiável células da crista neural primária. Nosso método é aplicável a knock-out do mouse ou modelos genéticos condicionais. Um método comparável ao nosso foi descrito para outras populações de crista neural20; Entretanto, nosso método descreve completamente o isolamento passo a passo de células NC cranianas murinas. Também descrevemos o uso de diferentes matrizes, bem como o procedimento de análise de migração em detalhes.
Para alcançar resultados consistentes, verificou-se que a atenção especial paga para o estadiamento durante a seleção de embriões. Não surpreendentemente, o número de mesodérmicos se correlaciona com diferentes estágios no desenvolvimento do NC craniano. Portanto, o conhecimento da anatomia do embrião é muito importante antes de adquirir quaisquer dados experimentais. Esta aproximação pode então ser adaptada para isolar populações discretas de pilhas neurais da crista, dependendo da pergunta biológica e das pilhas do alvo.
Uma vez que os embriões são selecionados e dissecados, as células mesodérmicas podem ser prontamente distinguidas e devem ser removidas para permitir melhor visualização e reduzir a contaminação. Para culturas de longo prazo, o tecido da placa neural pode ser removido a 24 h de chapeamento, a fim de evitar a contaminação por tecidos neurais. Um refinamento mais adicional poderia ser o uso da rotulagem fluorescente da linhagem (por exemplo, usando um Wnt1:: CRE ou Sox10:: os excitadores de creert combinaram com os repórteres fluorescentes24,25) para distinguir pilhas neurais da crista de outros tecidos, como mostrado na Figura 2C.
Os relatórios precedentes destacaram o potencial de culturas do explante do rato do chapeamento NC em matrizes diferentes, o mais geralmente em hydrogels comerciais do ECM, no fibronectina e no colagénio mim20,21,26. Em nossas mãos, as culturas do explante do NC do rato craniano são crescidas com sucesso em todas as três matrizes, nas concentrações especificadas em relatórios originais (dados não mostrados). A aproximação refinada inicial que nós adaptamos para nossas culturas do explante do NC usou um hidrogel comercial como a matriz da escolha, que consistiu primeiramente no laminina e nos colágenos21(A Figura 3A – B). No entanto, a composição deste hidrogel não está claramente definida, com fator de crescimento desconhecido e teor de proteínas. Como tal, temos desde então mudou a nossa abordagem para chapeamento do mouse NC culturas explantes em fibronectina (A Figura 3C – D). Fibronectin é bem definido e altamente expresso nas membranas de ECM e cave ao longo do qual as células NC migramin vivo28,29,30. Para otimizar uma matriz de fibronectina que melhor Replica a migração de células de crista neural e a morfologia como visto usando o hidrogel, comparamos os comportamentos de células NC expostos no hidrogel contra uma titulação de 0,25 – 30 μg/mL de fibronectina, e definimos 1 μg/mL de fibronectina como fornecendo Propriedades ideais (dados não mostrados). Acreditamos que este trabalho preliminar pode ajudar a estabelecer um quadro para a comparação sistemática de matrizes, como a fibronectina, contra as descritas anteriormente, ou seja, colágeno e laminina32,33,34. Seria especial interessante comparar a capacidade migratória da pilha do rato NC no fibronectina contra o colagénio mim, dado que o colagénio-IA1 é secretado endogenamente pelo rato, pelas pilhas aviárias e humanas do NC28,30,31,32. O colágeno I é, portanto, tão relevante quanto a fibronectina na consideração da escolha da matriz. Também vale a pena reconhecer que a biodisponibilidade dos fatores de crescimento nos meios de comunicação pode ser alterada por diferentes componentes da matriz, especialmente tendo em conta o elevado teor sérico dos nossos meios de comunicação. Para superar isso, estamos trabalhando atualmente para produzir condições de cultura definida sem soro. Estes meios definidos são usados com sucesso em protocolos neurais da indução da crista no campo pluripotente da pilha de haste, mas exigem uma optimização mais adicional para nosso sistema da cultura do explante do NC33,34. Nosso trabalho também pode servir como ponto de partida para condições de refino para outros tipos de células NC, como o cardíaco e tronco NC, e para estudos subsequentes de diferenciação de NC. Mais importante ainda, este protocolo permite o isolamento de células NC cranianas para uma variedade de aplicações. Nós imaginamos estudos sobre migração direcionada, migração 3-D e invasão. As células isoladas desta forma podem ser tratadasin vitropara uma série de análises. Por exemplo, as células podem ser prontamente tratadas usando diferentes moléculas pequenas para direcionar proteínas específicas, elas podem ser tratadas em pontos de tempo definidos e experimentos de washout podem ser projetados para determinar a recuperação de comportamentos de células (A Figura 4). A cultura a longo prazo para o transfection e os ensaios da diferenciação é possível, assim como a passagem das pilhas (dados não mostrados). Entretanto, a viabilidade, a capacidade de renovação celular e a multipotência devem ser validadas após o passaging. As pilhas chapeadas em COVERSLIP de vidro podem igualmente ser usadas em protocolos de coloração Immunofluorescent, seguindo a imagem latente viva. Finalmente, esta abordagem representa um sistema tremendamente poderoso para estudar a migração de NC de modelos genéticos de mouse22,23,24,25.
The authors have nothing to disclose.
Estamos gratos à unidade de serviços biológicos do King ‘ s College London, especialmente Tiffany Jarvis e Lynsey Cashnella por seu apoio continuado. Agradecemos a Derek Stemple, Mamoru Ishii e Robert Maxson por aconselhamento e ajuda com reagentes durante o estabelecimento inicial deste protocolo. Agradecemos a Dheraj Taheem por ajuda com irradiação gama de células STO. Agradecemos aos laboratórios Liu e Krause, especialmente ao Tommy Pallett, por um grande apoio. Este trabalho foi financiado por subsídios do BBSRC (BB/R015953/1 para KJL/MK), um Studentship do programa de treinamento de doutorado (LD) do MRC, Newland Pedley Fund (ALM) e KRIPIS II, Secretaria-geral de pesquisa e tecnologia (GSRT), Ministério da educação e religiosos Da Grécia e da Fondation Santé (à SGGM).
bFGF | R&D systems | 233-FB | |
b-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
Tissue culture flasks | Corning | 430639 | 25cm2 culture flasks |
DMEM (4500 mg/L glucose) | Sigma | D5671 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (dPBS) | Sigma | D8537 | |
Ethanol | Fisher Chemicals | E/0650DF/C17 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | TFS AA 10-155 | |
Fetal Bovine Serum (ES Cell FBS) | Gibco | 26140079/16141-079 | |
Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
Gelatin from bovine skin | Sigma | G9382 | |
L-glutamine | Sigma | G7513 | |
Glass-bottomed, multi-well 24-well tissue culture plate | Ibidi | 82406 | Glass-bottomed, No 1.5, 24-well tissue culture dish with black sides |
Cell migration analysis tool | Ibidi | v2.0 | Manuals for this software can be found at: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html. |
Circularity Plug-in | ImageJ | v1.29 or later | The circularity plug-in is an extended version of ImageJ/Fiji’s Measure command, designed by Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov). |
LIF | ESGRO by Millipore | ESG1106 | |
Manual Cell Tracking Plug-in | ImageJ | v1.34k or later | ref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (France) 2005 |
Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
MEM non-essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-050 | |
Matrigel (ECM-based Hydrogel) | Corning | 356234 | |
Microscope | Olympus | 1X81 | Olympus 1X81 inverted microscope |
Microscope camera | Photometrics | 512B | Photometrics Cascadell 512B camera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objectives) |
Microscope controller | Olympus | 1X2-UCB | Olympus 1X2-UCB microscope controller |
Microscope temperature controller | Solent Scientific | RS232 | Maintained at 37°C |
Penicillin/streptomycin | Sigma | A5955 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
Statistics software | Graphpad Prism | v7.0 | |
STO feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ | |
XY microscope stage controller | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MS-4400 |