이 프로토콜은 주로 세포 이동 연구를 위해 마우스 모델에서 두개골 신경 문장 세포의 해부 및 배양을 설명합니다. 우리는 사용된 살아있는 화상 진찰 기술 및 속도 및 세포 모양 변경의 분석을 기술합니다.
지난 수십 년 동안 인간의 병리학을 모방하는 데 사용되는 유전자 변형 마우스 모델의 가용성이 증가했습니다. 그러나, 생체 내에서 세포 운동 및 분화를 연구하는 능력은 여전히 매우 어렵다. 신경 조직 병증, 또는 신경 문장 계보의 무질서는, 중요한 배아 단계의 접근성의 부족 및 인접한 중피 중간엽에서 신경 문장 중간엽을 분리하는 어려움 때문에 공부하기 위하여 특히 도전적입니다. 여기에서, 우리는 1 차적인 두개골 신경 문장 세포의 문화를 위한 잘 정의된, 일상적인 프로토콜을 설치하기 위하여 착수했습니다. 우리의 접근에서 우리는 초기 신경 문장 유도 단계 도중 마우스 신경 판 경계를 해부합니다. 신경판 경계 영역은 이식되고 배양된다. 신경 문장 세포는 신경 판 테두리를 둘러싼 상피 시트에서 형성하고, 24 h에 의해 이식 후, 박리하기 시작, 상피 – 중간엽 전환을 겪고 (EMT) 완전히 운동성 신경 문장 세포가 될. 우리의 2 차원 배양 접근 때문에, 명백한 조직 인구 (신경 판 대 premigratory 및 철새 신경 문장)는 쉽게 구별될 수 있습니다. 라이브 이미징 접근법을 사용하여 신경 문장 유도, EMT 및 철새 동작의 변화를 식별할 수 있습니다. 유전 돌연변이와 이 기술의 조합은 정상 및 병리학 신경 문장 세포 생물학을 이해하기위한 매우 강력한 접근 방식이 될 것입니다.
신경 문장 (NC) 혈통은 초기 배아 발달1,2동안 척추동물에서 독점적으로 나타나는 세포의 일시적, 다능성 및 철새 집단이다. 신경 문장 유도체는 매우 다양하며, 신경교신경, 평활근, 멜라닌세포, 뉴런 및 두개안면 뼈 및 연골을포함하며 3,4. 신경 문장은 많은 기관 시스템의 기능에 기여하기 때문에,이 혈통은 인간의 배아 발생에 필수적입니다. 비정상적인 NC 발달은 가장 일반적인 인간 출생 결함 (즉, 갈라진 입술과 구개)의 넓은 범위에서 연루된다5,또한 히르츠프룽병과 같은 장애 (HSCR), 소장 버그 증후군 (WS), CHARGE 증후군 및 윌리엄스 증후군6 ,7,8,9.
NC 개발은 제노푸스,병아리 및 제브라피시 모델을 포함한 다수의 비 포유류 모델 시스템에서 탐구되었습니다. 포유류에서, 마우스 모형에 있는 일은 신경 문장 발달의 밑에 있는 중요한 유전 사건의 몇몇을 확인했습니다; 그러나, 마우스 배아의 접근성 때문에 신경 문장 이동의 세포 생물학을 따르는 것이 더 어려웠다 (다른 곳에서 검토10,11). 더욱이, 병아리, 제노푸스 및 제브라피시에 대한 연구가 NC에 대한 유전자 조절 네트워크를 확립하는 동안, 이러한 동물 모델에서 기능 연구의 손실은 때때로 마우스에서 유사한 표현형을 나타내지 않는다. 예를 들어, 제노푸,제브라피쉬 및 병아리에서 비정식 Wnt 시그널링은 NC가 철새 용량12,13,14,15를 획득할 수 있는 셀룰러 메커니즘 중 하나입니다. . 그러나 마우스에서 비표준 Wnt 신호의 손실은 마이그레이션16에영향을 미치지 않는 것으로 보입니다. 생체 내 NC 마이그레이션은 마우스에서 장기간 추적하기 어려웠기 때문에 이러한 종 차이가 다른 이동 모드를 반영하는지 또는 분자 조절의 차이를 반영하는지 여부는 불분명합니다.
언급했듯이, 마우스에 있는 NC 연구 결과는 태아의 전 자궁 배양이 힘들기 때문에 아주 도전적이었습니다. 또한, NC는 중두절제 및 신경절과 같은 인접 한 조직과 지속적으로 밀접한 접촉을 하고 있습니다. 신경 문장 특이적 Cre 드라이버 또는 외인성 염료의 최근 사용은 우리가 형광성으로 철새 NC를 표시 할 수 있게; 그러나 이러한 접근 방식은 여전히 제한적입니다. NC 마이그레이션17,18을시각화하기 위해 다양한 기술을 설명하는 여러 보고서에도 불구하고 이러한 기술을 간단하고 일상적인 절차로 해결하는 것은 어려웠습니다.
포유류 NC의 취급 및 특성화를 허용하는 기술이 필요하다는 것은 분명합니다. 우리는 인간의 두개안면 발달과 신경 병증을 연구하기위한 기본 모델이기 때문에 마우스 두개골 NC에 우리의 노력을 집중했습니다. 우리는 NC 세포19,20,21의1 차적인 배양을 기술하는 몇몇 흥미로운 보고에 근거를 둔 우리의 접근을 정제했습니다. 여기서, 우리는 1 차적인 NC 세포를 배식하기 위한 최적 배양 기술을 철저히 기술한다. 우리는 살아있는 세포 화상 진찰 방법 및 배양 판을 코팅하기 위하여 다른 행렬의 최적 사용을 설명합니다. 우리의 프로토콜은 다른 현미경과 함께 사용하기위한 지침으로 의도 된 반전 된 현미경을 사용하여 살아있는 NC 세포의 이동을 캡처하는 방법뿐만 아니라 세포 분석의 자세한 요약을 설명합니다.
이식에서 예상되는 결과는 현미경의 밑에 명확하게 구별되는 세포의 분포를 아름답게 배치해야 합니다, 여기서 하나는 (i) 신경 판, (ii) premigratory, 및 , (iii) 나타내는 세포의 3개의 다른 인구를 볼 수 있습니다 철새 신경 문장 세포. 우리는 상피 -중간엽 전이 동안 세포의 사전 이민 집단의 경계에서 세포 행동을 분석하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 세포 속도, 거리 및 세포 형태에 대한 완전한 철새 세포를 연구하는 데 집중했습니다.
포유류 신경 문장 세포를 공부하는 것은 포유류 발달의 자궁 특성 때문에 과학자들에게 도전이었습니다. 생체 내 연구는 태아가 자궁에서 의 생활을 모방하는 조건하에서 조작되어야 하기 때문에, 설치하기 어렵습니다. 실제로, 특히 살아있는 화상 진찰을 위해 24 시간 이상 동안 이 (E8+) 배아를 재현하는 것은 거의 불가능합니다. 더욱이, 신경 문장 유도 및 이동은 마우스에 있는 신경관 폐쇄 및 배아 선회와 동시에 생깁니다; 이것은 배아가 전 자궁을배양할 때 자주 실패하는 결정적이고 스트레스가 많은 형태 유전학 사건입니다. 따라서, 전 자궁 접근법의 성공률은 일반적으로 낮다. 불멸화된 NC세포(21)의 사용은 동물 사용을 감소시키는 유용한 도구이며 장기 분석, 형질전환 및 농축 연구를 위한 신경 문장 세포의 더 나은 공급원을 제공할 수 있다. 그러나, 1차 신경 문장 세포를 안정적으로 배양할 필요성이 명백히 존재한다. 우리의 방법은 마우스 녹아웃 또는 조건부 유전 모델에 적용 할 수 있습니다. 우리의 비교 가능한 방법은 다른 신경 문장 인구에 대해 설명되었다20; 그러나, 우리의 방법은 철저하게 뮤린 두개골 NC 세포의 단계별 격리를 설명합니다. 또한 다른 행렬의 사용과 마이그레이션 분석 절차에 대해서도 자세히 설명합니다.
일관된 결과를 달성하기 위해, 우리는 배아의 선택 중에 준비쪽으로 특별한주의를 기울였다는 것을 발견했습니다. 당연히, somites의 수는 두개골 NC 발달에 있는 다른 단계와 상관관계가 있습니다. 따라서, 배아 해부학의 지식은 어떤 실험적인 데이터를 취득하기 전에 아주 중요합니다. 이 접근은 그 때 생물학 질문 및 표적 세포에 따라서 신경 문장 세포의 분리인구를 격리하는 쪽으로 적응될 수 있습니다.
일단 배아가 선택되고 해부되면, 중피 세포는 쉽게 구별될 수 있고 더 나은 시각화를 허용하고 오염을 감소시키기 위하여 제거되어야 합니다. 장기 배양을 위해, 신경 판 조직은 신경 조직에 의한 오염을 방지하기 위하여 도금의 24 시간에서 제거될 수 있습니다. 또 다른 개선은 형광 계보 라벨링의 사용일 수 있습니다 (예를 들어, Wnt1::cre 또는 Sox10::creERT 드라이버를 형광 기자와결합하여 24,25)신경 문장 세포와 구별할 수 있습니다. 그림 2C에표시된 다른 조직.
이전 보고서는 상용 ECM 하이드로겔, 피브로넥틴 및 콜라겐 I에서 가장 일반적으로 다른 매트릭스에 마우스 NC 배양 배양의 잠재력을 강조했다20,21,26. 우리의 손에, 마우스 두개골 NC 배원 배양성공적으로 원래 보고서에 지정된 농도에서, 세 개의 행렬에 성장 (데이터는 표시되지 않음). 우리가 우리의 NC 배양 문화에 적응 초기 정제 된 접근 방식은 주로 라미닌과 콜라겐으로 구성된 선택의 매트릭스로 상용 하이드로 겔을 사용21(그림 3A-B). 그러나, 이 하이드로겔의 조성물은 알 수 없는 성장 인자 및 단백질 함량을 명확하게 정의하지 않는다. 이와 같이, 우리는 이후 섬유넥틴에 마우스 NC 배양 배양에 우리의 접근 방식을 이동 (그림 3C-D). Fibronectin잘 정의 하 고 높은 ECM 및 NC 세포 마이그레이션을 따라 지하실 막에서 발현in vivo28,29,30. 하이드로겔을 사용하여 볼 수 있듯이 신경 문장 세포 이동 및 형태를 가장 잘 복제하는 섬유넥틴 매트릭스를 최적화하기 위해 하이드로겔에 나타난 NC 세포 거동을 0.25-30 μg/mL 섬유넥틴의 적정에 대해 비교하고 1 μg/mL fibronectin을 정의했습니다. 이상적인 속성 제공(표시되지 않은 데이터). 우리는 이 예비 작업이 이전에 설명한 것과, 즉 콜라겐과 라미닌에 대하여, fibronectin와 같은 매트릭스의 체계적인 비교를 위한 틀을 설치하는 것을 도울 수 있다고 믿습니다32,33,34. 콜라겐-IA1이 마우스, 조류 및 인간 NC 세포에 의해 내인성으로 분비된다는 점을 감안할 때, 섬유넥틴과 콜라겐 I에 대한 마우스 NC 세포 철새 용량을 비교하는 것은 특히 흥미로웠을 것입니다.28,30,31,32. 따라서 콜라겐 I은 매트릭스 선택을 고려하여 피브로넥틴과 관련이 있다. 또한 미디어의 성장 인자의 생체 이용률은 특히 우리 미디어의 높은 혈청 함량을 감안할 때 다른 매트릭스 성분에 의해 변경 될 수 있음을 인정 할 가치가 있습니다. 이를 극복하기 위해, 우리는 현재 무혈청 정의 배양 조건을 생산하기 위해 노력하고 있습니다. 이러한 정의된 배지는 다능성 줄기 세포 분야에서 신경 문장 유도 프로토콜에 성공적으로 사용되지만 NC 이식 배양 시스템에 대한 추가 최적화가 필요합니다.33,34. 우리의 일은 또한 심장과 트렁크 NC와 같은 NC 세포의 그밖 모형을 위한 조건을 정제하고, NC 분화의 후속 연구 결과를 위한 출발점으로 봉사할 수 있습니다. 가장 중요한 것은, 이 프로토콜은 다양한 응용에 대한 두개골 NC 세포의 분리를 허용한다. 우리는 지시 된 마이그레이션, 3-D 마이그레이션 및 침략에 대한 연구를 구상합니다. 이러한 방식으로 단리된 세포는 치료할 수 있습니다.in vitro여러 분석에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 세포는 특정 단백질을 표적으로 하기 위하여 다른 작은 분자를 사용하여 쉽게 취급될 수 있고, 정의된 시점에서 취급될 수 있고, 세척 실험은 세포 행동의 복구를 결정하기 위하여 디자인될 수 있습니다 (그림 4). 형질감염 및 분화 분석에 대한 장기 배양은 세포의 통과뿐만 아니라 가능하다(데이터는 도시되지 않음). 그러나, 생존 가능성, 세포 재생 및 다중 능력의 능력은 통과 후 검증되어야한다. 유리 커버립에 도금 된 세포는 또한 살아있는 화상 진찰에 따라 면역 형광 염색 프로토콜에서 사용될 수 있습니다. 마지막으로, 이 접근법은 유전 마우스 모델에서 NC의 이주를 연구하기 위한 대단히 강력한 시스템을 나타냅니다.22,23,24,25.
The authors have nothing to disclose.
우리는 킹스 칼리지 런던 생물학 서비스 단위, 특히 티파니 자비스와 린지 캐쉬넬라의 지속적인 지원에 감사드립니다. 우리는 데릭 사원, 이시이 마모루와 로버트 맥슨이 프로토콜의 초기 설립 하는 동안 조언과 시약에 도움이 감사 합니다. 우리는 STO 세포의 감마 조사에 도움을 Dheraj Taheem 감사합니다. 우리는 리우와 크라우스 연구소, 특히 토미 팔레트에게 큰 도움을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 BBSRC (BB / R015953 /1 KJL / MK), MRC 박사 교육 프로그램 (LD), 뉴 랜드 페들리 기금 (ALM) 및 KRIPIS II, 연구 및 종교 교육부의 사무 총장의 학생에 의해 지원되었다 업무, 그리스 와 산테 (SGGM에).
bFGF | R&D systems | 233-FB | |
b-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
Tissue culture flasks | Corning | 430639 | 25cm2 culture flasks |
DMEM (4500 mg/L glucose) | Sigma | D5671 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (dPBS) | Sigma | D8537 | |
Ethanol | Fisher Chemicals | E/0650DF/C17 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | TFS AA 10-155 | |
Fetal Bovine Serum (ES Cell FBS) | Gibco | 26140079/16141-079 | |
Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
Gelatin from bovine skin | Sigma | G9382 | |
L-glutamine | Sigma | G7513 | |
Glass-bottomed, multi-well 24-well tissue culture plate | Ibidi | 82406 | Glass-bottomed, No 1.5, 24-well tissue culture dish with black sides |
Cell migration analysis tool | Ibidi | v2.0 | Manuals for this software can be found at: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html. |
Circularity Plug-in | ImageJ | v1.29 or later | The circularity plug-in is an extended version of ImageJ/Fiji’s Measure command, designed by Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov). |
LIF | ESGRO by Millipore | ESG1106 | |
Manual Cell Tracking Plug-in | ImageJ | v1.34k or later | ref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (France) 2005 |
Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
MEM non-essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-050 | |
Matrigel (ECM-based Hydrogel) | Corning | 356234 | |
Microscope | Olympus | 1X81 | Olympus 1X81 inverted microscope |
Microscope camera | Photometrics | 512B | Photometrics Cascadell 512B camera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objectives) |
Microscope controller | Olympus | 1X2-UCB | Olympus 1X2-UCB microscope controller |
Microscope temperature controller | Solent Scientific | RS232 | Maintained at 37°C |
Penicillin/streptomycin | Sigma | A5955 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
Statistics software | Graphpad Prism | v7.0 | |
STO feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ | |
XY microscope stage controller | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MS-4400 |