Detta protokoll beskriver dissektion och kultur av kranial neurala krön celler från musmodeller, främst för studier av cell migration. Vi beskriver de levande avbildningstekniker som används och analysen av hastighet och cell formförändringar.
Under de senaste decennierna har det skett en ökad tillgång till genetiskt modifierade musmodeller som används för att efterlikna människans patologier. Emellertid, förmågan att studera cell rörelser och differentiering in vivo är fortfarande mycket svårt. Neurocristopathies, eller sjukdomar i neurala Crest härstamning, är särskilt utmanande att studera på grund av bristande tillgänglighet av viktiga embryonala stadier och svårigheterna att separera ut neurala Crest Mesenchyme från angränsande mesodermala Mesenchyme. Här, vi ut för att etablera en väldefinierad, rutinmässiga protokoll för kulturen i primära kraniala neurala krön celler. I vårt förhållningssätt vi dissekera mus neurala plattan gränsen under den första neurala Crest induktion skede. Den neurala plattan gränsregionen är explanterad och odlade. Den neurala Crest celler form i en epitelial blad kring neurala plattan gränsen, och med 24 h efter explant, börja delaminate, genomgår en epitelial-mesenkymala övergång (EMT) att bli helt rörliga neurala krön celler. På grund av vår tvådimensionella odlingsmetod, den distinkta vävnad populationer (neurala plattan kontra premigratory och flyttande neurala Crest) kan lätt särskiljas. Med hjälp av Live Imaging metoder kan vi sedan identifiera förändringar i neurala Crest induktion, EMT och migrations beteenden. Kombinationen av denna teknik med genetiska mutanter kommer att vara en mycket kraftfull metod för att förstå normal och patologisk neurala krönet cellbiologi.
Den neurala Crest (NC) härstamning är en övergående, multipotenta och flyttande population av celler som visas uteslutande på ryggradsdjur under tidig embryonal utveckling1,2. Neural crest derivat är mycket varierande, och inkluderar glia, glatt mus kula, melanocyter, nervceller och kraniofacial ben och brosk3,4. Eftersom neural crest bidrar till funktionen av många organsystem, är denna härstamning avgörande för mänsklig embryogenes. Aberrant NC utveckling är inblandad i ett brett spektrum av de vanligaste mänskliga missbildningar (dvs., läpp och gom)5, och även störningar såsom Hirschsprungs sjukdom (hscr), Wardensburg syndrom (WS), Charge syndrom och Williams syndrom6 ,7,8,9.
NC utveckling har undersökts i ett antal icke-däggdjurs modellsystem inklusive Xenopus, chick och zebrafiskar modeller. Hos däggdjur, arbete i musmodeller har identifierat några av de viktigaste genetiska händelserna underliggande neurala Crest utveckling; Det har dock varit svårare att följa cellbiologi neurala Crest migration, på grund av otillgänglighet av mus embryot (granskas på annat håll10,11). Dessutom, medan studier på chick, Xenopus och zebrafisk har etablerat ett nätverk gen reglerande för NC, förlust av funktionen studier i dessa djurmodeller ibland inte uppvisar en jämförbar fenotyp i mus. Till exempel, i xenopus, zebrafiskar och chick, icke-Canonical WNT signalering är en av de cellulära mekanismer som gör det möjligt för NC att förvärva sin migrations kapacitet12,13,14,15 . Men i musen, förlust av icke-kanoniska WNT signalering verkar inte påverka migration16. Som in vivo NC migration har varit svårt att spåra under långa perioder i mus, det är oklart om dessa Art-skillnader återspeglar olika former av migration, eller skillnader i molekylär reglering.
Som nämnts, NC studier i mus har varit mycket utmanande eftersom ex Utero kulturen av embryon är mödosam. Dessutom är NC ständigt i intim kontakt med angränsande vävnader såsom mesoderm och neurectoderm. Den senaste användningen av neurala Crest-specifika CRE förare eller exogena färgämnen har tillåtit oss att Fluorescent etikett flyttande NC; dessa metoder är dock fortfarande begränsade. Trots flera rapporter som beskriver olika tekniker för att visualisera NC migration17,18, har det varit svårt att lösa dessa tekniker i en enkel och rutinmässig procedur.
Det är tydligt att det finns ett behov av tekniker som gör det möjligt att hantera och karakterisera däggdjurs NC. Vi fokuserade våra ansträngningar på musen kranial NC eftersom det är den primära modellen för att studera mänskliga kraniofacial utveckling och neurocristopathies. Vi förfinade vår strategi baserat på flera intressanta rapporter som beskriver primärkulturen i NC-celler19,20,21. Här beskriver vi grundligt den optimala kulturen tekniker för explanting primära NC-celler. Vi demonstrerar den levande cell avbildnings metoden och den optimala användningen av olika matriser för att belägga kultur plattorna. Vårt protokoll beskriver hur man fångar migrationen av levande NC-celler med hjälp av ett inverterat Mikroskop, som är avsett som en riktlinje för användning med andra Mikroskop, samt en detaljerad sammanfattning av våra cellulära analyser.
Det förväntade resultatet från explanten bör vara en vackert lagd distribution av celler som är klart särskiljas under mikroskopet, där man kan se tre olika populationer av celler som representerar (i) neurala plattan, (II) premigratorisk, och, (III) flyttande neural crest celler. Vi visar hur man analyserar cell beteenden vid gränsen till den premigratoriska populationen av celler under epitelial-mesenkymala övergången. Vi fokuserade också vår satsning på att studera helt flytt celler för cellhastighet, avstånd och cellmorfologi.
Studera däggdjurs neurala krön celler har varit en utmaning för forskarna på grund av den in utero karaktär däggdjurs utveckling. In vivo studier är svåra att inrätta, eftersom embryot måste manipuleras under förhållanden som efterliknar livet i livmodern. I praktiken är det nästan omöjligt att reproducerbart odla dessa (E8 +) embryon för längre än 24 h, särskilt för levande avbildning. Dessutom, neurala Crest induktion och migration sker samtidigt med neuralrörsstängning och embryonala vrida i musen; Detta är en avgörande och stressande morfogenetiska händelse, som ofta misslyckas när embryon odlas ex Utero. Således är andelen framgångsrika ex Utero -strategier generellt låg. Användningen av förevigade NC-celler21 är ett användbart verktyg för att minska användningen av djur och det kan ge en bättre källa till neurala Crest celler för långsiktig analys, transfektion, och berikande studier. Det finns dock uppenbarligen ett behov av att på ett tillförlitligt sätt odla primära neurala krön celler. Vår metod är tillämplig på mus knock-out eller villkorlig genetiska modeller. En jämförbar metod för vår har beskrivits för andra neurala Crest populationer20; men vår metod beskriver grundligt steg-för-steg isolering av murina kraniala NC-celler. Vi beskriver också användningen av olika matriser samt migrations analysförfarandet i detalj.
För att uppnå konsekventa resultat fann vi att särskild uppmärksamhet ägnas åt iscensättning under valet av embryon. Inte överraskande, korrelerar antalet thoraxsegmenten med olika stadier i kraniala NC utveckling. Därför är kunskapen om embryoanatomin mycket viktig innan man förvärvar några experimentella data. Detta tillvägagångssätt kan sedan anpassas till att isolera diskreta populationer av neurala krön celler, beroende på den biologiska frågan och målcellerna.
När embryona väljs och dissekeras, mesodermala celler kan lätt särskiljas och bör avlägsnas för att möjliggöra bättre visualisering och minska kontaminering. För längre sikt kulturer, kan den neurala plattan vävnad avlägsnas vid 24 h av plätering för att förhindra kontaminering av neurala vävnader. En ytterligare förfining kan vara användningen av fluorescerande härstamning märkning (till exempel med hjälp av en Wnt1:: CRE eller Sox10:: creert förare i kombination med fluorescerande reportrar24,25) att skilja neurala Crest celler från vävnader som visas i figur 2C.
Tidigare rapporter har belyst potentialen av plätering mus NC explantat kulturer på olika matriser, oftast på kommersiella ECM hydrogels, Fibronektin och kollagen I20,21,26. I våra händer, mus kraniala NC explantat kulturer framgångsrikt odlas på alla tre matriser, vid koncentrationer som anges i original rapporter (data visas inte). Den ursprungliga förfinade metoden vi anpassade för våra NC explantat kulturer använde en kommersiell hydrogel som matrisen val, som främst bestod av laminin och kollagener21(Figur 3A – B). Sammansättningen av denna hydrogel är dock inte tydligt definierad, med okänd tillväxtfaktor och proteinhalt. Som sådan har vi sedan skiftat vårt förhållningssätt till plätering mus NC explantat kulturer på Fibronektin (Figur 3C – D). Fibronectin är väl definierad och mycket uttrycks i ECM och basalmembran längs vilka NC-celler migrerarin vivo28,29,30. För att optimera en Fibronektin matris som bäst replikerar neurala Crest cell migration och morfologi som ses med hjälp av hydrogel, jämförde vi NC cell beteenden uppvisade på hydrogel mot en titrering av 0,25-30 μg/ml Fibronektin, och definierade 1 μg/ml Fibronektin som ger idealiska egenskaper (data visas inte). Vi anser att detta preliminära arbete kan bidra till att skapa en ram för systematisk jämförelse av matriser, såsom fibronectin, mot de som tidigare beskrivits, nämligen kollagen och laminin32,33,34. Det skulle vara särskilt intressant att jämföra mus NC cell migrations kapacitet på Fibronektin kontra kollagen I, med tanke på att kollagen-IA1 är endogent utsöndras av mus, aviär och mänskliga NC-celler28,30,31,32. Kollagen i är därför lika relevant som Fibronektin vid övervägande av matrisens val. Det är också värt att erkänna att biotillgängligheten av tillväxtfaktorer i medierna kan ändras av olika matriskomponenter, särskilt med tanke på den höga serum halt i våra medier. För att övervinna detta arbetar vi för närvarande med att producera serum fria definierade odlingsförhållanden. Dessa definierade medier är framgångsrikt används i neurala Crest induktion protokoll i pluripotenta stamcells fältet, men kräver ytterligare optimering för vårt NC explantat kultur system33,34. Vårt arbete kan också fungera som en utgångspunkt för raffinering villkor för andra typer av NC-celler såsom hjärt-och bål NC, och för efterföljande studier av NC differentiering. Viktigast av allt, detta protokoll tillåter isolering av kranial NC-celler för en mängd olika tillämpningar. Vi Envision studier om riktad migration, 3-D migration och invasion. Celler som isolerats på detta sätt kan behandlasin vitroför ett antal analyser. Till exempel, celler kan lätt behandlas med olika små molekyler för att rikta specifika proteiner, de kan behandlas vid definierade tidpunkter, och Wash-out experiment kan utformas för att avgöra återhämtning av cell beteenden (Figur 4). Mer långsiktig kultur för transfektion och differentiering analyser är möjligheten, as well as passage av celler (data som inte visas). Emellertid, lönsamheten, kapaciteten för cellförnyelse och multipotens bör valideras efter passaging. Celler pläterade på glas täckband kan också användas i Immunofluorescerande färgning protokoll, efter levande avbildning. Slutligen, detta tillvägagångssätt är ett oerhört kraftfullt system för att studera migration av NC från genetiska musmodeller22,23,24,25.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för King ‘ s College London Biological Services enhet, särskilt Tiffany Jarvis och Lynsey Cashnella för deras fortsatta stöd. Vi tackar Derek Stemple, Mamoru Ishii och Robert Maxson för råd och hjälp med reagenser under den första etableringen av detta protokoll. Vi tackar Dheraj Taheem för hjälp med gamma-bestrålning av STO celler. Vi tackar LiU och Krause Labs, särskilt Tommy Pallett, för stort stöd. Detta arbete finansierades genom bidrag från BBSRC (BB/R015953/1 till KJL/MK), ett student skepp från MRC doktorand utbildningsprogram (LD), newland Pedley Fund (ALM) och KRIPIS II, generalsekretariatet för forskning och teknik (GSRT), Undervisningsministeriet och religiösa Frågor, Grekland och Fondation santé (till SGGM).
bFGF | R&D systems | 233-FB | |
b-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
Tissue culture flasks | Corning | 430639 | 25cm2 culture flasks |
DMEM (4500 mg/L glucose) | Sigma | D5671 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (dPBS) | Sigma | D8537 | |
Ethanol | Fisher Chemicals | E/0650DF/C17 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | TFS AA 10-155 | |
Fetal Bovine Serum (ES Cell FBS) | Gibco | 26140079/16141-079 | |
Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
Gelatin from bovine skin | Sigma | G9382 | |
L-glutamine | Sigma | G7513 | |
Glass-bottomed, multi-well 24-well tissue culture plate | Ibidi | 82406 | Glass-bottomed, No 1.5, 24-well tissue culture dish with black sides |
Cell migration analysis tool | Ibidi | v2.0 | Manuals for this software can be found at: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html. |
Circularity Plug-in | ImageJ | v1.29 or later | The circularity plug-in is an extended version of ImageJ/Fiji’s Measure command, designed by Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov). |
LIF | ESGRO by Millipore | ESG1106 | |
Manual Cell Tracking Plug-in | ImageJ | v1.34k or later | ref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (France) 2005 |
Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
MEM non-essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-050 | |
Matrigel (ECM-based Hydrogel) | Corning | 356234 | |
Microscope | Olympus | 1X81 | Olympus 1X81 inverted microscope |
Microscope camera | Photometrics | 512B | Photometrics Cascadell 512B camera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objectives) |
Microscope controller | Olympus | 1X2-UCB | Olympus 1X2-UCB microscope controller |
Microscope temperature controller | Solent Scientific | RS232 | Maintained at 37°C |
Penicillin/streptomycin | Sigma | A5955 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
Statistics software | Graphpad Prism | v7.0 | |
STO feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ | |
XY microscope stage controller | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MS-4400 |