Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Dissektion, kultur og analyse af primær kranie neurale crest celler fra mus til studiet af Neural Crest celle delaminering og migration

Published: October 3, 2019 doi: 10.3791/60051
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 1, 1,3, 2,4, 3, 1
1Centre for Craniofacial and Regenerative Biology, King's College London, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, FORTH, Department of Biomedical Research, University of Ioannina, 3Randall Centre of Cell & Molecular Biophysics, King's College London, 4Department of Biological Applications and Technology, University of Ioannina
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver dissektion og kultur af kranielle neurale crest celler fra musemodeller, primært til studiet af celle migration. Vi beskriver de anvendte Live imaging teknikker og analyse af hastighed og celle formændringer.

Abstract

I løbet af de sidste mange årtier har der været en øget tilgængelighed af genetisk modificerede musemodeller, der anvendes til at efterligne humane patologier. Men evnen til at studere celle bevægelser og differentiering in vivo er stadig meget vanskeligt. Neurocristopathies, eller lidelser i neurale crest afstamning, er særligt udfordrende at studere på grund af manglende adgang til centrale embryonale stadier og vanskeligheder med at adskille den neurale crest mesenchyme fra tilstødende af mesenchyme. Her har vi sat sig for at etablere en veldefineret, rutinemæssig protokol for kulturen i primære kraniale neurale crest celler. I vores tilgang vi dissekere ud musen neurale plade grænse under den indledende neurale crest induktion fase. Den neurale plade grænseregion er explanted og kultiveret. Den neurale crest celler form i en epitel ark omkring neurale plade grænsen, og ved 24 h efter explant, begynder at delaminate, undergår en epitelial-mesenchymal overgang (EMT) til at blive fuldt motile sædceller neurale crest celler. På grund af vores todimensionelle dyrkning tilgang, de særskilte vævs populationer (neurale plade versus forblandende og vandrende neurale crest) kan let skelnes. Ved hjælp af Live imaging tilgange, kan vi derefter identificere ændringer i neurale crest induktion, EMT og migrerende adfærd. Kombinationen af denne teknik med genetiske mutanter vil være en meget kraftfuld tilgang til at forstå normal og patologisk neurale crest cellebiologi.

Introduction

Neurale crest (NC) afstamning er en forbigående, Multipotente og migrerende population af celler, der udelukkende forekommer i hvirveldyr under tidlig fosterudvikling1,2. Neurale crest derivater er meget forskellige, og omfatter glia, glatte muskler, melanocytter, neuroner og kraniofacial knogle og brusk3,4. Fordi neurale crest bidrager til funktionen af mange organ systemer, denne slægt er afgørende for menneskelig embryogenese. Aberrant NC udvikling er impliceret i en bred vifte af de mest almindelige humane fødselsdefekter (dvs., gane læbe og gane)5, og også lidelser som Hirschsprung sygdom (hscr), Wardensburg syndrom (ws), charge syndrom og Williams syndrom6 ,7,8,9.

NC-udvikling er blevet udforsket i en række ikke-mammalisk modelsystemer, herunder xenopus, chick og Zebra modeller. I pattedyr har arbejde i musemodeller identificeret nogle af de vigtigste genetiske hændelser underliggende neurale crest udvikling; Men, det har været vanskeligere at følge cellebiologi af neurale crest migration, på grund af manglende adgang til mus embryo (revideret andetsteds10,11). Desuden, mens undersøgelser i chick, xenopus og zebra har etableret et gen regulerende netværk for NC, tab af funktionsundersøgelser i disse dyremodeller undertiden ikke udviser en sammenlignelig fænotype i mus. For eksempel, i xenopuSørensen, zebra og chick, ikke-Canonical WNT signalering er en af de cellulære mekanismer, der gør det muligt for NC at erhverve sin migrerende kapacitet12,13,14,15 . Men, i mus, tab af ikke-Canonical WNT signalering synes ikke at påvirke migration16. Som in vivo NC migration har været vanskeligt at spore i lange perioder med mus, er det uklart, om disse arter-forskelle afspejler forskellige former for migration, eller forskelle i molekyl regulering.

Som bemærket, NC undersøgelser i mus har været meget udfordrende, fordi ex utero kultur af embryoner er omstændelig. Desuden er NC konstant i intim kontakt med tilstødende væv såsom mesoderm og neurectoderm. Nylig brug af neurale crest-specifikke CRE -drivere eller udefrakommende farvestoffer har gjort det muligt for os at fluorescently mærke MIGRATIONEN NC; disse tilgange er dog stadig begrænsede. På trods af flere rapporter, der beskriver forskellige teknikker til at visualisere NC migration17,18, har det været vanskeligt at løse disse teknikker i en enkel og rutinemæssig procedure.

Det er klart, at der er behov for teknikker, der tillader håndtering og karakterisering af pattedyrs NC. Vi fokuserede vores indsats på musen kranie NC, da det er den primære model for at studere Human craniofacial udvikling og neurocristopathies. Vi raffinerede vores tilgang baseret på flere interessante rapporter, der beskriver primær kultur af NC-celler19,20,21. Her beskriver vi grundigt de optimale dyrkningsteknikker til forklaring af primære NC-celler. Vi demonstrerer den levende celle billedbehandlings metode og den optimale anvendelse af forskellige matricer til at belægge kultur pladerne. Vores protokol beskriver, hvordan man fanger migrationen af levende NC-celler ved hjælp af et inverteret mikroskop, som er tænkt som en retningslinje for brug med andre mikroskoper, samt et detaljeret resumé af vores cellulære analyser.

Det forventede resultat af forklaringet bør være en smukt udlagt fordeling af celler, der er klart skelnes under mikroskopet, hvor man kan se tre forskellige populationer af celler, der repræsenterer (i) neurale plade, (II) forblandingen, og (III) migrerende neurale crest-celler. Vi demonstrerer, hvordan man analyserer celle adfærd ved grænsen til den forbgrende population af celler under epitelial-mesenchymal overgangen. Vi fokuserede også vores indsats på at studere fuldt migrerende celler for cellehastighed, distance og celle morfologi.

Protocol

Alt dyre arbejde har undergået etisk godkendelse af King's College London etiske revisionsproces og blev udført i overensstemmelse med UK Home Office Project License P8D5E2773 (KJL).

1. klargøring af reagenser

  1. Forbered generelle opløsninger og værktøjer, herunder steril fosfatbuffer saltvand (PBS), 70% ethanol, dissektions værktøj (pincet og dissektions blade eller sterile nåle), plastikplader eller glas skred belagt med en kommercielt tilgængelig ekstracellulær matrix ( ECM)-baseret hydrogel eller fibronektin (Se tabellen over materialer), og neurale crest medier (se nedenfor).
  2. Forbered neurale crest basal medium ved hjælp af Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM, 4500 mg/L glucose), 15% føtal kvægserum (FBS), 0,1 mM minimum essentielle medium ikke-essentielle aminosyrer (MEM NEAA 100X), 1 mM natrium pyruvat, 55 μM β-mercaptoethanol, 100 enheder/mL penicillin, 100 enheder/mL streptomycin og 2 mM L-glutamin.
    1. Tilstand medierne natten ved hjælp af vækst-hæmmet STO feeder celler21.
      1. Forbered STO celler (Se tabellen af materialer) medier til at indeholde DMEM suppleret med 10% FBS og 100 u/ml penicillin, 100 U/ml streptomycin. Vokse og udvide STO celler til sammenløbet i 25 cm2 kolber belagt med 0,1% gelatine. Apply 5000 rad af gammabestråling.
      2. Frø ca. 3 x 106 væksthæmmede celler på en 10 cm2 skål eller 25 cm2 kolbe (fra trin 1.2.1.1). Tilsæt ca. 10 – 12 mL neurale crest basal medium og Inkuber natten over.
        Bemærk: seedede celler kan bruges til at producere betinget medium i op til 10 dage. Kontroller cellernes udseende regelmæssigt
    2. Filtrer mediet (0,22 μm porestørrelse), og supplere med 25 ng/mL grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bFGF) og 1000 U af leukæmi inhibitor faktor (LIF).
      Bemærk: opbevares ved 4 °C og anvendes inden for en måned eller opbevares ved-20 °C og anvendes inden for 3 måneder.
  3. Coat vævet kultur overflader med ekstracellulær matrix.
    Bemærk: afhængigt af det biologiske spørgsmål, der stilles, kan matrixen overføres på glasbundne kultur retter, plastik vævskultur retter eller glas dæksedler. Se nedenfor for forskellige ECM-baserede hydrogel fortyndinger afhængig af matrix substratet. Fibronectin er blevet testet på glasbundne retter og kun følgesedler ved de koncentrationer, der er angivet nedenfor. Her på vil vi henvise til de substrat belagte overflader som "belagte plader".
    1. Coat vævet kultur overflader med ECM baseret hydrogel.
      Bemærk: hold underlaget koldt indtil plating, enten ved at kølemediet eller holde på is.
      1. Tø hydrogel ved 4 °C natten over. Der tilsættes 5 mL 10% FB'ER i DMEM til 5 mL hydrogel til en endelig volumen på 10 mL (Se tabellen over materialer).
      2. Lav 0,5 – 1 mL aliquoter som praktisk og opbevar ved-20 °C.
      3. Tø hydrogel-aliquoterne på is.
      4. Brug en 1:20 fortynding af hydrogel bestanden til at belægge plastik.
      5. Brug en 1:5 fortynding af hydrogel bestanden til at belægge glas skred og glas-bundet vævskultur plader.
        Bemærk: fortynde hydrogel i kold DMEM.
      6. Påfør nok fortyndet hydrogel til at dække det ønskede område på plader/slides og Inkuber i 30 – 45 min ved 37 °C.
      7. Brug straks belagte plader/slides eller Opbevar coatede slides ved 4 °C natten over.
      8. Fjern udskejelser og skyl slides med høj glukose DMEM (valgfrit) før brug.
    2. Coat vævet kultur overflader med fibronectin.
      1. Foretag aliquoter af 1 mg/ml fibronektin stamopløsning og opbevares ved-80 °c. Fibronektin fortyndes med dulbecco's PBS (dpbs) til en slutkoncentration på 1 μg/ml.
      2. Påfør tilstrækkelig fibronektin til at dække det ønskede område og inkubere ved stuetemperatur i 15 min.
      3. Fjern rest fibronektin og lad glasset tørre i 30-45 min.
      4. Skyl brønde eller dæksedler med høj glukose DMEM (valgfrit) før brug.

2. dag 1: dissektion af tidlige chakpost-stadie embryoner

Bemærk: Brug sterile værktøjer og sterile opløsninger. Hvis genotypebestemmelse er nødvendig, opsamles kroppen af embryonet til DNA-ekstraktion.

  1. Dissektion af kranie neurale pladen er begrænset til embryoner på 8,5 dage efter coitum (DPC). Vælg embryoner på 5 – 8 chakpost scenen. Dissekere livmoderen i PBS og skær mesometrium for at adskille hvert embryo (figur 1a). Den muskuløse væg af livmoderen kontrakter og decidua væv vil blive synlige (figur 1b).
    Bemærk: Vedligehold embryoner i livmoderen i iskold PBS, mens dissektioner udføres ét embryo ad gangen. Flyt embryoner med en glas Pasteur-pipette til frisk steril PBS for at forbedre synligheden og reducere kontaminering.
  2. Glide Tang mellem muskellag og decidua væv og fjerne muskellag med et andet par tang (figur 1c).
  3. Ved hjælp af pincet, perforer deciduum ved kanterne af den mesometriale pol og med et andet par tang til at åbne vinkelret på stangen.
  4. Træk det deciduale væv tilbage med pincet for at visualisere Reicherts membran.
  5. Fjern Reicherts membran omhyggeligt. Den visceral blomme sæk bliver synlig og embryonet kan ses indeni (figur 1d).
  6. Fjern det viscerale blomme sæk og amnion (figur 1E), og Placer embryonet for at visualisere hoved folden (figur 1f).
  7. Skær hovedet Fold over hjertet og skrabe den underliggende mesoderm ved hjælp af pincet og/eller øjenvipper værktøjer til at opnå en ren neurale plade (NP) (figur 1H).
    Bemærk: NP kan holdes hele eller opdeles i anteroposterior aksen, således at hver side kan være belagt individuelt. Den neurale plade kant kan yderligere beskæres væk fra den neurale plade for at minimere neuronal bidrag til explants.
  8. Brug en glas Pasteur-pipette til at overføre den dissekerede neurale plade til en hydro gel-belagt skål fyldt med konditioneret neurale crest-medie.
  9. Drej forsigtigt skålen for at placere NP i midten af brønden. Dette er vigtigt for maksimering af fase kvaliteten for Live-Cell Imaging (på dag 2).
  10. Inkubér natten over (eller til det ønskede tidspunkt) ved 37 °C i 5% CO2. Neurale crest celler bør være synligt migrere ud af neurale pladen.
    Bemærk: cellerne binder normalt inden for 6 – 8 timer. Efter forklaringen tillægger, give mere tid til at visualisere migrerende celler. Normalt ved 24 h post explant, kan vi finde tre skelne populationer af celler. Den første population, i centrum af explant, er neurale plade (NP). Den anden population, den premigratory NC (pNC), omgiver NP i en epitelial ark af celler. Den tredje population, i den udvendige ring, er dannet af migrerende NC (mNC), som er større i størrelse, og synes fuldt mesenchymal (figur 2).

3. dag 2: Live Cell Imaging af murine kranielle neurale crest celler

Bemærk: Imaging skal udføres ved 24 h post explanting til optimalt billede og kvantificere neurale crest celle migration. NC induktions medier behøver ikke at blive opdateret før Live Cell Imaging. Adgang til et inverteret mikroskop, med en motoriseret fase og en indbygget miljøkammer er påkrævet. Brug multi-brønd vævskultur retter egnet til billeddannelse (tabel over materialer).

  1. Opsætning af mikroskop
    1. Indstil miljøkammeret ved 37 °C og 5% CO2.
    2. Gennembore et hul i låget på vævskultur pladens låg for at lade CO2 -kanylen, der er forbundet med co2 -fugtning kammeret, sidde i pladen.
    3. Placer vævskultur skålen i prøveholderen og tape ned pladen låg og CO2 nål for at forhindre rystelser under multi-Well erhvervelse.
    4. Tænd for mikroskop controlleren, Stage controlleren og billedbehandlings softwaren.
    5. Fokuser på de kraniale NC-celler ved 10x forstørrelse (med matchende fase ring i den valgte kondensator).
    6. Sæt høj kvalitet fase-kontrast på mikroskopet ved at justere feltet iris membran, blænde iris membran og centrering teleskop, som angivet i mikroskop set-up manual.
  2. Fasekontrast Live-Cell Imaging
    1. Angiv den mappe eller filplacering, hvor timelapse-filerne skal gemmes.
    2. Indstil eksponeringstid, Binning og kamera området.
    3. Angiv antallet af tidspunkter, billedbehandlings varighed og tidsinterval mellem rammer.
      1. At kvantificere NC celle migrerende kapacitet, indstille mikroskopet til 10x forstørrelse, tager 1 frame hver 5 min (217 tidspunkter over 18 h). For at kvantificere cellernes morfologi skal du indstille forstørrelse til 40x og tage 1 ramme/min (61 tidspunkter over 1 time). At kvantificere lamellipodial dynamik, indstille forstørrelse til 40x eller 60x forstørrelse, tager 1 frame hver 10 s (over 10 min).
    4. For multi-Well Imaging, indstille den mekaniske fase til at flytte mellem udvalgte XY positioner af interesse. Bekræft, at kranie NC-cellerne er i fokus, og at scene positionerne er korrekte.
    5. Brug kommandoen Hent til at starte tidsforskudt afbildning.
    6. Når tidsforskudt afbildning er fuldført, bør du gennemgå de flerdimensionelle data og eksportere. stk-filer til analyse.
      Bemærk:. stk er en TIFF stack fil.
    7. Afslut softwaren, Luk computeren ned og sluk for scenen, kameraet og mikroskop regulatorerne.

4. Imaging analyse: kvantificering af neurale crest celle migration

Bemærk: for bedre at definere den cellulære adfærd udstillet ved at migrere murine kranielle neurale crest-celler, har vi analyseret en række kvantificerbare migrations parametre, der specifikt fokuserer på migrations kapacitet og celle formdynamik. (1) migration (Akkumuleret distance) er den samlede længde af stilængden, der tages af cellen (μm); (2) migration (euklidisk afstand) er den lige linjeafstand mellem den oprindelige og den endelige position af cellen (μm); (3) migration (cellehastighed) er tilbagelagt distance efter celle pr. tidsenhed (μm/min); (4) celle form (celleområde) er den samlede overflade, der dækkes af cellen. Indstil pixel til Micron Scale i henhold til billedbehandlings mikroskop. (A = etpx x Npx, hvor etpx = pixelområde og Npx = antal pixels. Enheder: μm2; (5) celle form (celle cirkularitet) er afvigelsen af celle form fra en perfekt cirkel, som er angivet med en cirkularitet værdi på 1,0 (4π (a/P2)), hvor a = område og P = omkreds.

  1. Sporing af enkelt celle
    Bemærk: for at måle NC-celle migrering genereres der XY-koordinater for individuelle celler på tværs af alle tidsforskudt rammer. Dette giver mulighed for efterfølgende analyse af distance, hastighed og vedholdenhed målinger af celle migration.
    1. Åbn ImageJ, og Importer data som TIFF-stak filer.
    2. Klik på analysér | Angiv skalering for at kalibrere. stk-filerne i henhold til mikroskop indstillinger og arbejde i pixel/μm.
    3. Klik på plugins | Sporing | Manuel sporing til at åbne billede J manuel celle tracking plugin. Hvis du vil starte celle sporing, skal du vælge Tilføj spor.
    4. Spor celler gennem alle billeder af time-lapse film, ved hjælp af kernen som et referencepunkt.
      Bemærk: 10 – 20 celler skal spores pr. explant, og i alt 60 celler spores (n = 3). Celler, der gennemgår celle opdeling i løbet af tidsforløbet, bør udelukkes fra analyse.
    5. Gem og Eksporter resultaterne som en. csv-fil. Resultater repræsenterer individuelle celle spornummer, Skive nummer og XY koordinater over alle rammer.
  2. Kvantificering af neurale crest-cellernes migrations kapacitet
    1. Åbn enkelt celle sporingsdata (se ovenfor). Konverter. csv-filer til. txt-filformat.
    2. Åbn overførsels softwaren ( tabellen over materialer). Klik på fanen Importer data for at importere celle sporingsdataene som en. txt-fil.
    3. Under datasæt | Initialisering, skal du vælge antallet af udsnit eller rammer, der skal analyseres, og indstille XY-kalibrering og tidsinterval mellem rammer. Vælg Anvend Indstillinger for at gemme indstillingerne.
    4. Vælg plot data symbolet for at danne forløbs plot. Vælg statistik symbolet for at kvantificere afstands-og hastighedsmålinger.
    5. Gem forløbs afbildet som bitmap-filer (. bmp) og afstands-og hastighedsmålinger som. txt-filer. Vælg Fjern data symbolet. Gentag for andre time-lapse-filer.
      Bemærk: Forløbskurver kan bruges til at visualisere de individuelle celle kursets direkthed for en given celle tilstand eller tilstand i løbet af timelapse-film (figur 4a). Distance-og hastighedsdata, der er lagret i. txt-filerne, kan derefter bruges til yderligere analyse.
  3. Kvantificering af neurale crest-celleområde og cirkularitet
    1. Åbn time-lapse. stk filer i ImageJ og kalibrere i henhold til mikroskop indstillinger, arbejder i pixel/μm.
    2. Under analysér | Angiv mål, klik for at vælge celle figurens parametre: celleområde, omkreds og figur beskrivelse.
    3. Brug værktøjet Frihåndsmarkering til manuelt at tegne rundt om hver celle ved hjælp af celle membran grænser som en vejledning.
    4. Tryk på CTRL + B taster på tastaturet for at bevare celle dispositionen, som er overfyldt på billedet. Gentag for celler over hver tidsforskudt ramme.
    5. Brug billedet | Overlay | Til ROI Manager for at gemme værdierne.
    6. Når alle interesse celler pr. ramme er blevet skitseret, skal du klikke på mål. Gem resultaterne som en. csv-fil.
      Bemærk: 10 – 20 celler pr. film skal skitseres med i alt 30 – 60 celler analyseret pr. tilstand (n = 3). Celle Figurdata (. csv-filer) kan bruges til at kvantificere, hvordan celle figurens dynamik ændrer sig over tid (figur 4c), eller hvordan morfologi kan ændres under forskellige celle behandlinger.

Representative Results

Ved hjælp af den procedure, der demonstreres her, blev muse embryoner dissekeret fra livmoderen, og ekstruderet væv blev fjernet (figur 1A – D). Embryoner var chakpost iscenesat (kun ved hjælp af embryoner på 5 – 8 somites (SS), figur 1E, F). Den kraniale neurale plade blev derefter dissekeret og neuroepitelet blev isoleret. Mesodermal celler, identificeret som løse, cirkulære, mesenchymale celler, blev forsigtigt børstet (figur 1G-L). Den forreste neurale plade kan være forklarende hele, i hvilket tilfælde neurale crest vævet vil dukke sideværts og ekspandere radialt omkring forklaringen, eller hver neurale plade kant (højre og venstre) kan være forklarende separat. Dette er især nyttigt, når explanting fra genetiske mutanter.

Inden for 24 timer kan der tydeligt ses en region med forblandingen (epithelial) kraniel neurale crest omkring den neurale plade forklarer (figur 2b). Desuden har en delpopulation af neurale crest celler gennemgået epitelial til mesenchymal overgang og synes fuldt mesenchymal (figur 2). Således har vi flere koncentriske ringe af særskilte celler, med neurale plade (NP) i midten, den premigratory neurale crest (pNC) i den mellemliggende cirkel, og en population af migrerende neurale crest (mNC) i den udvendige ring (figur 2b). For at spore NC celler, er det muligt at bruge genetisk modificerede musemodeller, som vi viser i figur 2c. I dette tilfælde har vi brugt neurale crest specifikke Wnt1:: CRE; RosaMtmg hvilket resulterer i NC celler bliver mærket i grøn. I disse mus, celler Express membran tomat (mT, i rødt), medmindre de udtrykker CRE rekombinase. Rekombination fører til celler, som udtrykker membran grønt fluorescerende protein (GFP, med grønt). De røde celler vist i midten af forklarer er neurale plade celler. Nogle dorsale neurale plade celler udtrykker også GFP; for langsigtet kultur, ville vi punktafgiftspligtige alle cellerne i midten. Til vores formål er renheden af explanten tilstrækkelig til at spore de forskellige neurale crest cellepopulationer. Hvor højere renhed af neurale crest er nødvendig, denne genetiske mærkning strategi kan kombineres med fluorescerende aktiveret celle sortering (FACS) for at sikre renhed af befolkningen. Alternativt, det er muligt at fastsætte bruskeksplantater og identificere NC befolkning med antistof mærkning.

Det fremgik også af 24 timer, at de karakteristiske koncentriske ringe af forber ende og fuldt migrerende NC-celler i forklaringskulturer ikke var afhængige af eller styret af matrix valg (figur 3). Explant kulturer belagt på både en ECM-baseret hydrogel og fibronektin dannede sammenlignelige explant strukturer, bestående af de tre cellepopulationer, NP, PNC og MNC (figur 3A, C). Neural Crest celle morfologi var også sammenlignelig mellem dem, der er belagt på ECM-baserede hydrogel og fibronektin (figur 3B, D). Men, bruskeksplantater belagt på fibronektin producerede celler med mere fremtrædende lamellipodia på cellen forkant, tilsyneladende mere polariseret i retning af migration (figur 3B, D).

Når en population af migrerende neurale crest celler er indlysende, kan Live Cell Imaging være afsluttet. Time-lapse mikroskopi er indstillet til 10x forstørrelse (18 h, 1 frame/5 min) for efterfølgende analyse af NC celle migration (figur 4a). ImageJ manuel tracking plug-in genererer XY koordinater af individuelle celler over alle billeder af time-lapse film (figur 4b). Disse koordinater kan behandles ved hjælp af migrerings softwaren. Denne software gør det muligt visualisering af individuelle celle spor over tid (figur 4b) og kan bruges til at kvantificere akkumuleret og euklidisk afstand, samt cellehastighed.

Tidsforskudt billeddata giver også et væld af oplysninger om celle morfologi under migrationen af kraniale neurale crest-celler (figur 4c). Ved at skitsere individuelle cellemembraner kan celleområde-og perimeter målinger beregnes ud fra alle film billeder (figur 4c). Disse målinger giver mulighed for efterfølgende kvantificering af celleområdet og cirkularitet (figur 4d). Figur 4c viser en analyse af celle formændringer over 18 h. Bemærk, at når cellerne migrerer væk fra forklaringen, øges celleområdet markant, mens celle cirkularitet forbliver relativt konstant (envejs-ANOVA, tukey's multiple sammenligninger test) ( Figur 4E,F). Dette tyder på, at som celler afviger fra epitelial kant og miste celle-celle kontakter, de viser øget celle spredt område. Foranstaltningerne til celle cirkularitet ændrede sig ikke væsentligt over tid. kortvarige ændringer i cirkularitet kan dog ses, hvis et øget antal tidspunkter kvantificeres. Celle cirkularitet foranstaltninger kan også give interessante data om celle formdynamik i nærværelse af en kemotaktisk cue eller under begrænsede forhold.

Figure 1
Figur 1: isolering af kranie neurale crest bruskeksplantater fra et e 8.5-embryon.
Billeder er Stills fra en video, der dokumenterer mikro-Dissection teknik. (A – C) Af fosteret fra livmoderen. (B – C) Ved hjælp af to skarpe pincet, forsigtigt trække fra hinanden muskellag. Panel (D) viser embryo inde i den viscerale blomme sæk (gul linje). Udpak embryonet fra det viscerale blomme sæk. E) sidesyn af embryonet på stadie 8,5 lateral. F) rygudsigt over embryonet i stadie 8,5. Tæl somites (SS) til at bestemme alder af embryoner; sædvanligvis 5 – 8 SS (gule cirkler i F). (G) close up se på det kranie område af embryonet. Fjerne ekstronale membraner fra kranie området; somitterne er markeret med en gul linje. (H) dissektioner af forreste neurale plade udføres under den første Branchialfodder Arch (gul linje). (I) lateral visning af forreste neurale plade dissektion. Neurale folder, hvor neurale crest celler opstår, er markeret med en gul linje. (J – L) Fjern af væv (fluffy mesenchymal celler) underliggende forreste neurale folder så meget som muligt før plating NP på tilberedte kultur retter. Filmen blev taget ved hjælp af et stereomikroskop med et widefield apochromatic objektiv ved 3,0 X zoom (Se tabellen over materialer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: murine kranie neurale crest explant.
A) skematisk gengivelse af rygudsigten til et e 8.5-muse embryo. Den kraniale region af embryonet skæres på den stiplede linje. Den neurale plade kant (fremhævet med rødt) isoleres fra det omgivende mesoderm-væv og dyrkes i 24 timer for at gøre det muligt for kranie neurale crest at emigrere. Skematisk tilpasset fra22,23. (B) venstre: repræsentative lyse felt billede af en kranie neurale crest explant 24 timer efter plating. Der observeres tre populationer af celler, som også er skematisk til højre. NP = neurale plade, pNC = præ-migrerende neurale crest og mNC = migrerende neurale crest. Scale bar = 250 μm. (C) højere forstørrelses billeder af en explant fra genetisk mærket mus (Wnt1:: CRE; RosaMtmg). Celler uden CRE driver Express membran tomat (mT) i rødt. Ekspression af CRE under kontrol af en neurale crest specifik Wnt1-promotor fører til excision af mT-kassetten og ekspression af membran GFP (mG) i grøn. Kerner er plettet med Hoescht (i blåt). Scale bar = 200 μm. (d – d ' ') højere forstørrelses billeder af migrerende celler, som udtrykker membran gfp (d). (D ') DNA er mærket med Hoescht (blå). (D ' ') Fletning af D og D '. Skala bjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Explanter dyrket på forskellige substrater.
(A – B) Fasekontrast billeder af bruskeksplantater kulturperler på kommerciel ECM-hydrogel. (C – D) Explanter dyrket på 1 μg/mL fibronectin. Neurale plader (NP), premigratory (pNC) og vandrende (mNC) neurale crest celler kan skelnes ved deres forskellige celle morfologier. Scale bar = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: kvantificering af kranie neurale crest celle migration og celle formdynamik.
(A) fase-kontrast rammer fra time-lapse billeddannelse af forklarende kulturer overlagt med enkelt neurale crest celle spor, ved hjælp af ImageJ/Fiji manuel Cell tracking plug-in. ti repræsentative MNC celler blev manuelt sporet over 18 h (217 frames) og XY koordinaterne blev eksporteret. Data repræsenteres som en over lejrings prik og linje plot. Celler blev belagt på 1 μg/mL fibronectin. Scale bar = 200 μm. B) repræsentativt forløbs plot af 10 MNC-celler, der genereres ved hjælp af overførsels software. C) fasekontrast rammer taget fra tidsforskudt analyse af forklarende kulturer. Stiplede linjer kontur 8 repræsentative migrerende neurale crest celler analyseret for celle formdynamik, når belagt på 1 μg/mL fibronectin. Scale bar = 200 μm. D) skematisk gengivelse af de beregninger, der anvendes til at kvantificere celleområdet og cirkularitet. Celle morfologi af skematisk er, at cellen fremhævet i blå (C). Etpx = pixelområde, Npx = pixel nummer, a = område, P = omkreds (1 pixel = 1,60772 μm2). (E – F) Kvantificering af celleområde-og celle cirkularitet måler over tid. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM. Hver prik repræsenterer en celle (n = 60), taget fra 3 uafhængige eksperimenter, og analyseret ved 0 h, 6 h, 12 h og 18 h (NS ikke-signifikant, * p < 0,05, * * * * p < 0,0001 envejs ANOVA, Tukey's multiple sammenligninger test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

At studere pattedyr neurale crest celler har været en udfordring for videnskabsfolk på grund af den in utero karakter af pattedyr udvikling. In vivo undersøgelser er svære at sætte op, da embryonet skal manipuleres under forhold, der efterligner livet i livmoderen. I praksis er det næsten umuligt at reproducerbart kultur disse (E8 +) embryoner i længere end 24 timer, især for levende billeddannelse. Desuden forekommer neurale crest induktion og migration sideløbende med neurale rørlukning og embryonale drejning i musen; Dette er en afgørende og stressende morfogenetisk begivenhed, som ofte mislykkes, når embryoner dyrkes ex utero. Således er succesraten for ex utero tilgange generelt lav. Brugen af udødeliggjort NC celler21 er et nyttigt værktøj til at reducere brugen af dyr, og det kan give en bedre kilde til neurale crest celler til langsigtet analyse, transfection, og berigelse undersøgelser. Men der er tydeligvis et behov for pålideligt kultur primære neurale crest celler. Vores metode er gældende for mus knock-out eller betingede genetiske modeller. En sammenlignelig metode til vores er blevet beskrevet for andre neurale crest populationer20; Men, vores metode grundigt beskriver trin-for-trin isolering af murine kranie NC celler. Vi beskriver også brugen af forskellige matricer samt migrations analyseproceduren i detaljer.

For at opnå konsistente resultater konstaterede vi, at der blev lagt særlig vægt på iscenesættelsen under udvælgelsen af embryoner. Ikke overraskende, antallet af somites korrelerer med forskellige stadier i kranie NC udvikling. Derfor er kendskabet til embryo anatomi meget vigtigt, før du erhverver nogen eksperimentelle data. Denne fremgangsmåde kan derefter tilpasses til isolering af diskrete populationer af neurale crest celler, afhængigt af det biologiske spørgsmål og målcellerne.

Når embryonerne er udvalgt og dissekeret, kan af celler let skelnes og bør fjernes for at muliggøre bedre visualisering og reducere kontaminering. For langsigtede kulturer, den neurale plade væv kan fjernes ved 24 h plating for at forhindre kontaminering af neurale væv. En yderligere raffinement kunne være brugen af fluorescerende Lineage mærkning (for eksempel ved hjælp af en Wnt1:: CRE eller Sox10:: creert drivere kombineret med fluorescerende journalister24,25) at skelne neurale crest celler fra andet væv som vist i figur 2c.

Tidligere rapporter har fremhævet potentialet i plating mus NC explant kulturer på forskellige matricer, mest almindeligt på kommercielle ECM hydrogels, fibronektin og kollagen I20,21,26. I vores hænder, mus kranielle NC explant kulturer er med succes vokset på alle tre matricer, ved koncentrationer, der er angivet i de oprindelige rapporter (data ikke vist). Den oprindelige raffinerede tilgang, vi tilpassede til vores NC explant kulturer, brugte en kommerciel hydrogel som matrix af valg, som primært bestod af Laminin og kollagener21(Figur 3A – B). Sammensætningen af denne hydrogel er dog ikke klart defineret, med ukendt vækstfaktor og proteinindhold. Som sådan har vi siden skiftet vores tilgang til plating mus NC explant kulturer på fibronektin (Figur 3C – D). Fibronectin er veldefineret og stærkt udtrykt i ECM og kælder membraner langs hvilke NC celler migrerein vivo28,29,30. For at optimere en fibronektin matrix, der bedst replikater neurale crest celle migration og morfologi som ses ved hjælp af hydrogel, vi sammenlignede NC celle adfærd udstillet på hydrogel mod en titrering på 0,25 – 30 μg/ml fibronektin, og defineret 1 μg/ml fibronektin som giver ideelle egenskaber (data ikke vist). Vi mener, at dette indledende arbejde kan bidrage til at skabe en ramme for systematisk sammenligning af matricer, såsom fibronectin, mod de tidligere beskrevne, nemlig kollagen og Laminin32,33,34. Det ville være særligt interessant at sammenligne mus NC celle migrerende kapacitet på fibronektin versus kollagen I, da kollagen-IA1 er endogent udskilles af mus, aviær og humane NC celler28,30,31,32. Kollagen i er derfor så relevant som fibronektin i betragtning af matrix valg. Det er også værd at erkende, at biotilgængeligheden af vækstfaktorer i medierne kan ændres af forskellige matrixkomponenter, især i betragtning af det høje serum indhold i vores medier. For at overvinde dette arbejder vi i øjeblikket på at producere serum frie definerede dyrkningsbetingelser. Disse definerede medier anvendes med succes i neurale crest induktions protokoller i pluripotente stamcelle felt, men kræver yderligere optimering for vores NC explant kultur system33,34. Vores arbejde kan også tjene som udgangspunkt for raffinering betingelser for andre typer af NC-celler såsom hjerte og trunk NC, og for efterfølgende undersøgelser af NC differentiering. Vigtigst af alt, denne protokol tillader isolering af kranielle NC celler til en bred vifte af applikationer. Vi forestiller undersøgelser om målrettet migration, 3-D migration og invasion. Celler isoleret på denne måde kan behandlesin vitrofor en række analyser. For eksempel kan celler let behandles ved hjælp af forskellige små molekyler til at målrette specifikke proteiner, de kan behandles på definerede tidspunkter, og udvasknings eksperimenter kan designes til at bestemme genopretning af celle adfærd (Figur 4). Langsigtet kultur for transfektering og differentiering assays er muligt, samt passage af celler (data ikke vist). Men levedygtigheden, kapaciteten af cellefornyelse og multi potens bør valideres efter passaging. Celler belagt på glas dæksedler kan også anvendes i immunfluorescent farvning protokoller, efterlevende billeddannelse. Endelig, denne tilgang repræsenterer en uhyre kraftfuld system til at studere migration af NC fra genetiske musemodeller22,23,24,25.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for kongens College London Biological service Unit, især Tiffany Jarvis og Lynsey Cashnella for deres fortsatte støtte. Vi takker Derek stemple, Mamoru Ishii og Robert Maxson for råd og hjælp med reagenser under den første etablering af denne protokol. Vi takker Dheraj Taheem for hjælp med gamma-bestråling af STO celler. Vi takker Liu og Krause Labs, især Tommy Pallett, for stor støtte. Dette arbejde blev finansieret med tilskud fra BBSRC (BB/R015953/1 til KJL/MK), et Studentship fra MRC ph. d.-uddannelsesprogrammet (LD), newland Pedley Fund (ALM) og KRIPI II, General sekretariatet for forskning og teknologi (GSRT), Ministeriet for uddannelse og religiøs Anliggender, Grækenland og Fondation Santé (til SGGM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bFGF R&D systems 233-FB
b-mercaptoethanol Gibco 31350-010
Tissue culture flasks Corning 430639 25cm2 culture flasks
DMEM (4500 mg/L glucose) Sigma D5671
Dulbecco's phosphate-buffered saline (dPBS) Sigma D8537
Ethanol Fisher Chemicals E/0650DF/C17
Fetal Bovine Serum Sigma TFS AA 10-155
Fetal Bovine Serum (ES Cell FBS) Gibco 26140079/16141-079
Fibronectin bovine plasma Sigma F1141
Gelatin from bovine skin Sigma G9382
L-glutamine Sigma G7513
Glass-bottomed, multi-well 24-well tissue culture plate Ibidi 82406 Glass-bottomed, No 1.5, 24-well tissue culture dish with black sides
Cell migration analysis tool Ibidi v2.0 Manuals for this software can be found at: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html.
Circularity Plug-in ImageJ v1.29 or later The circularity plug-in is an extended version of ImageJ/Fiji’s Measure command, designed by Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov).
LIF ESGRO by Millipore ESG1106
Manual Cell Tracking Plug-in ImageJ v1.34k or later ref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (France) 2005
Microscope Image Analysis Software Universal Imaging Corporation 6.3r7 MetaMorph Software Series 6.3r7
MEM non-essential aminoacids 100X Gibco 11140-050
Matrigel (ECM-based Hydrogel) Corning 356234
Microscope Olympus 1X81 Olympus 1X81 inverted microscope
Microscope camera Photometrics 512B Photometrics Cascadell 512B camera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objectives)
Microscope controller Olympus 1X2-UCB Olympus 1X2-UCB microscope controller
Microscope temperature controller Solent Scientific RS232 Maintained at 37°C
Penicillin/streptomycin Sigma A5955
Sodium Pyruvate Sigma S8636
Statistics software Graphpad Prism v7.0
STO feeder cells ATCC CRL-1503
Stereomicroscope Nikon SMZ
XY microscope stage controller Applied Scientific Instrumentation (ASI) MS-4400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Duband, J. L. Diversity in the molecular and cellular strategies of epithelium-to-mesenchyme transitions: Insights from the neural crest. Cell Adhesion & Migration. 4, 458-482 (2010).
  2. Mayor, R., Carmona-Fontaine, C. Keeping in touch with contact inhibition of locomotion. Trends in Cell Biology. 20, 319-328 (2010).
  3. Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. 2nd edn. , Cambridge University Press. (1999).
  4. Trainor, P. A. Neural Crest Cells : Evolution, Development, and Disease. , Academic Press. (2014).
  5. Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: morphogenetic and molecular mechanisms. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 1152-1166 (2006).
  6. Ahola, J. A., et al. Increased incidence of Hirschsprung's disease in patients with hypoplastic left heart syndrome--a common neural crest-derived etiology? Journal of Pediatric Surgery. 44, 1396-1400 (2009).
  7. Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463, 958-962 (2010).
  8. Inoue, K., et al. Congenital hypomyelinating neuropathy, central dysmyelination, and Waardenburg-Hirschsprung disease: phenotypes linked by SOX10 mutation. Annals of Neurology. 52, 836-842 (2002).
  9. Kim, H., Kang, K., Ekram, M. B., Roh, T. Y., Kim, J. Aebp2 as an epigenetic regulator for neural crest cells. PloS one. 6, e25174 (2011).
  10. Barriga, E. H., Trainor, P. A., Bronner, M., Mayor, R. Animal models for studying neural crest development: is the mouse different? Development. 142, 1555-1560 (2015).
  11. Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: an overview. Developmental Biology. 366, 2-9 (2012).
  12. De Calisto, J., Araya, C., Marchant, L., Riaz, C. F., Mayor, R. Essential role of non-canonical Wnt signalling in neural crest migration. Development. 132, 2587-2597 (2005).
  13. Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456, 957-961 (2008).
  14. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135, 1771-1780 (2008).
  15. Banerjee, S., et al. A novel role for MuSK and non-canonical Wnt signaling during segmental neural crest cell migration. Development. 138, 3287-3296 (2011).
  16. Pryor, S. E., et al. Vangl-dependent planar cell polarity signalling is not required for neural crest migration in mammals. Development. 141, 3153-3158 (2014).
  17. Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Vital dye analysis of cranial neural crest cell migration in the mouse embryo. Development. 116, 297-307 (1992).
  18. Kawakami, M., Umeda, M., Nakagata, N., Takeo, T., Yamamura, K. Novel migrating mouse neural crest cell assay system utilizing P0-Cre/EGFP fluorescent time-lapse imaging. BMC Developmental Biology. 11, 68 (2011).
  19. Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
  20. Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nature protocols. 6, 1568-1577 (2011).
  21. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21, 3069-3080 (2012).
  22. Gonzalez Malagon, S. G., Liu, K. J. ALK and GSK3: Shared Features of Neuroblastoma and Neural Crest Cells. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 1179069518792499 (2018).
  23. Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9, 1126 (2018).
  24. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology : CB. 8, 1323-1326 (1998).
  25. Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. Journal of Clinical Investigation. 121, 3412-3424 (2011).
  26. Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and culture of neural crest cells from embryonic murine neural tube. Journal Of Visualized Experiments : JoVE. , e4134 (2012).
  27. Sternberg, J., Kimber, S. J. The relationship between emerging neural crest cells and basement membranes in the trunk of the mouse embryo: a TEM and immunocytochemical study. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 98, 251-268 (1986).
  28. Sternberg, J., Kimber, S. J. Distribution of fibronectin, laminin and entactin in the environment of migrating neural crest cells in early mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 91, 267-282 (1986).
  29. George, E. L., Georges-Labouesse, E. N., Patel-King, R. S., Rayburn, H., Hynes, R. O. Defects in mesoderm, neural tube and vascular development in mouse embryos lacking fibronectin. Development. 119, 1079-1091 (1993).
  30. Henderson, D. J., Copp, A. J. Role of the extracellular matrix in neural crest cell migration. Journal of Anatomy. 191 (Pt 4), 507-515 (1997).
  31. Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Human Molecular Genetics. 17 (21), 3411-3425 (2008).
  32. Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Hewitt, T. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Developmental Biology. 87 (2), 259-266 (1981).
  33. Leung, A. W., et al. WNT/β-catenin signaling mediates human neural crest induction via a pre-neural border intermediate. Development. 143 (3), 398-410 (2016).
  34. Zhu, Q., Lu, Q., Gao, R., Cao, T. Prospect of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Crest Stem Cells in Clinical Application. Stem Cells International. 2016, 7695836 (2016).

Tags

Udviklingsmæssige biologi cellekultur levende billeddannelse mus kranie neurale crest celle migration epitelial-mesenchymal overgang celle motilitet
Dissektion, kultur og analyse af primær kranie neurale crest celler fra mus til studiet af Neural Crest celle delaminering og migration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonzalez Malagon, S. G., Dobson, L., … More

Gonzalez Malagon, S. G., Dobson, L., Muñoz, A. M. L., Dawson, M., Barrell, W., Marangos, P., Krause, M., Liu, K. J. Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration. J. Vis. Exp. (152), e60051, doi:10.3791/60051 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter