Denne protokollen beskriver disseksjon og kulturen i skallen nevrale kam celler fra musemodeller, primært for studiet av celle migrasjon. Vi beskriver Live Imaging teknikker som brukes og analyse av hastighet og celle formendringer.
I løpet av de siste ti årene har det vært en økt tilgjengelighet av genmodifiserte musemodeller brukes til å etterligne menneskelige patologi. Men evnen til å studere celle bevegelser og differensiering in vivo er fortsatt svært vanskelig. Neurocristopathies, eller lidelser av Neural Crest avstamning, er spesielt utfordrende å studere på grunn av mangel på tilgjengelighet av viktige embryonale stadier og vanskelighetene i å skille ut neural Crest mesenchyme fra tilstøtende mesodermal mesenchyme. Her har vi satt ut for å etablere en veldefinert, rutine protokoll for kulturen av primære skallen neural Crest celler. I vår tilnærming vi analysere ut musen neural plate grensen under den første neural Crest induksjon scenen. Den nevrale plate grensen regionen er eksplanterte og kultivert. Den neural Crest celler danner i et epitel ark rundt nevrale plate grensen, og ved 24 h etter explant, begynner å delaminate, gjennomgår en epitel-mesenchymal overgang (EMT) for å bli fullt aktive neural Crest celler. På grunn av vår to-dimensjonal dyrking tilnærming, kan den distinkte vev populasjoner (nevrale plate versus premigratory og trekk neural Crest) være lett skilles. Ved hjelp av Live Imaging tilnærminger, kan vi deretter identifisere endringer i neural Crest induksjon, EMT og trekk atferd. Kombinasjonen av denne teknikken med genetisk mutanter vil være en svært kraftig tilnærming for å forstå normal og patologisk neural Crest cellebiologi.
The neural Crest (NC) avstamning er en forbigående, Multipotent og trekk befolkning av celler som vises utelukkende i virveldyr under tidlig embryoutvikling1,2. Neural Crest derivater er svært mangfoldig, og inkluderer glia, glatt muskel, melanocytter, neurons og kraniofacial bein og brusk3,4. Fordi neural Crest bidrar til funksjonen til mange organsystemer, er denne avstamning avgjørende for menneskelig embryogenesis. Avvikende NC utvikling er innblandet i et bredt spekter av de vanligste menneskelige fødselsskader (dvs. leppe og ganespalte)5, og også lidelser som Hirschsprung ‘ s sykdom (HSCR), Wardensburg syndrom (WS), charge syndrom og Williams syndrom6 ,7,8,9.
NC utvikling har blitt utforsket i en rekke ikke-pattedyr modellsystemer inkludert Xenopus, chick og sebrafisk modeller. I pattedyr, arbeid i mus modeller har identifisert noen av de viktigste genetiske hendelser underliggende neural Crest utvikling; men det har vært vanskeligere å følge cellen biologi av Neural Crest migrasjon, på grunn av utilgjengelighet av musen embryo (anmeldt andre steder10,11). Videre, mens studier i chick, Xenopus og sebrafisk har etablert et gen regulatoriske nettverk for NC, tap av funksjons studier i disse dyremodeller noen ganger ikke viser en sammenlignbar fenotype i musen. For eksempel, i Xenopus, sebrafisk og Chick, ikke-kanoniske wnt signalering er en av de cellulære mekanismer som gjør at NC å erverve sin trekk kapasitet12,13,14,15 . Men i musen, tap av ikke-kanoniske wnt signalering ser ikke ut til å påvirke migrasjon16. Som in vivo NC Migration har vært vanskelig å spore i lange perioder med musen, er det uklart om disse artene-forskjellene reflekterer ulike moduser av migrasjon, eller forskjeller i molekylær regulering.
Som bemerket, NC studier i musen har vært svært utfordrende fordi ex Utero kulturen av embryo er arbeidskrevende. Videre er NC konstant i intim kontakt med tilstøtende vev som mesoderm og neurectoderm. Nyere bruk av Neural Crest-spesifikke grobunn drivere eller eksogene fargestoffer har tillatt oss å fluorescensmerkete etiketten den vandrende NC; Imidlertid er disse tilnærmingene fortsatt begrenset. Til tross for flere rapporter som beskriver ulike teknikker for å visualisere NC migrasjon17,18, har det vært vanskelig å løse disse teknikkene i en enkel og rutinemessig prosedyre.
Det er klart at det er behov for teknikker som tillater håndtering og karakterisering av pattedyr NC. Vi fokuserte vår innsats på musen skallen NC som det er den primære modellen for å studere menneskelig kraniofacial utvikling og neurocristopathies. Vi har forbedret tilnærmingen vår basert på flere interessante rapporter som beskriver primær kulturen i NC-cellene19,20,21. Her beskriver vi grundig de optimale kultur teknikkene for explanting primære NC-celler. Vi demonstrerer Live Cell imaging metode og optimal bruk av ulike matriser til coat kulturen platene. Vår protokoll beskriver hvordan å fange migrering av levende NC celler ved hjelp av en invertert mikroskop, som er ment som en retningslinje for bruk med andre mikroskop, samt en detaljert oppsummering av våre cellulære analyser.
Det forventede resultatet fra explant bør være et vakkert anlagt fordeling av celler som er klart skilles under mikroskopet, hvor man kan se tre forskjellige populasjoner av celler som representerer (i) nevrale plate, (II) premigratory, og, (III) trekk neural Crest celler. Vi viser hvordan å analysere cellen atferd på grensen av premigratory befolkning av celler under epitel-mesenchymal overgangen. Vi har også fokusert vår innsats på å studere fullt trekk celler for cellehastighet, avstand og celle morfologi.
Studere pattedyr nevrale kam celler har vært en utfordring for forskere på grunn av i Utero natur pattedyr utvikling. In vivo studier er vanskelig å sette opp, som fosteret må manipuleres under forhold som etterligner livet i livmoren. I praksis er det nesten umulig å reproduserbar kulturen disse (E8 +) embryo i lengre enn 24 timer, spesielt for Live Imaging. Videre neural Crest induksjon og migrasjon skjer samtidig med neural tube nedleggelse og embryonale snu i musen; Dette er en viktig og stressende Morfogenetiske hendelse, som ofte svikter når embryo er kultivert ex Utero. Dermed er suksessen rate av ex Utero tilnærminger generelt lav. Bruken av udødeliggjort NC celler21 er et nyttig redskap for å redusere dyr bruk og det kan gi en bedre kilde til neural Crest celler for langsiktig analyse, transfeksjoner, og berikelse studier. Men det er helt klart et behov for å pålitelig kultur primære neural Crest celler. Vår metode gjelder for musen Knock-Out eller betingede genetiske modeller. En sammenlignbar metode til vår har blitt beskrevet for andre neural Crest bestander20; men vår metode beskriver grundig trinn-for-trinn isolering av murine skallen NC celler. Vi beskriver også bruken av ulike matriser samt migrasjon analyse prosedyre i detalj.
For å oppnå konsistente resultater, fant vi at spesiell oppmerksomhet mot staging under valg av embryo. Ikke overraskende antall somites samsvarer med ulike stadier i skallen NC utvikling. Derfor er kunnskapen om embryo anatomi svært viktig før du anskaffer noen eksperimentelle data. Denne tilnærmingen kan deretter tilpasses mot å isolere diskrete populasjoner av nevrale kam celler, avhengig av det biologiske spørsmålet og målcellene.
Når embryo er valgt og dissekert, mesodermal celler kan lett skilles og bør fjernes for å tillate bedre visualisering og for å redusere forurensning. For langsiktige kulturer, kan neural plate vev fjernes ved 24 h av plating for å hindre forurensning av nevrale vev. En ytterligere raffinement kan være bruk av fluorescerende avstamning merking (for eksempel ved hjelp av en Wnt1:: grobunn eller Sox10:: creERT drivere kombinert med fluorescerende journalister24,25) for å skille neural Crest celler fra annet vev som vist i figur 2C.
Tidligere rapporter har fremhevet potensialet i plating mus NC explant kulturer på ulike matriser, oftest på kommersielle ECM hydrogeler, fibronektin og kollagen jeg20,21,26. I våre hender, mus skallen NC explant kulturer er med hell vokst på alle tre matriser, i konsentrasjoner spesifisert i opprinnelige rapporter (data ikke vist). Den første raffinerte tilnærmingen vi tilpasset for våre NC explant kulturer brukte en kommersiell hydrogel som matrise av valget, som hovedsakelig besto av laminin og kollagen21(Figur 3A – B). Sammensetningen av denne hydrogel er imidlertid ikke klart definert, med ukjent vekstfaktor og proteininnhold. Som sådan har vi siden flyttet vår tilnærming til plating mus NC explant kulturer på fibronektin (Figur 3C-D). Fibronektin er godt definert og svært uttrykt i ECM og kjeller membraner langs hvilke NC celler migrerein vivo28,29,30. For å optimalisere en fibronektin matrise som best replikerer nevrale kam celle migrasjon og morfologi sett ved hjelp av hydrogel, sammenlignet vi NC celle atferd utstilt på hydrogel mot en titrering av 0,25-30 μg/mL fibronektin, og definert 1 μg/mL fibronektin som gir ideelle egenskaper (data ikke vist). Vi tror at dette foreløpige arbeidet kan bidra til å etablere et rammeverk for systematisk sammenligning av matriser, slik som fibronektin, mot de som tidligere er beskrevet, nemlig kollagen og laminin32,33,34. Det ville være spesielt interessant å sammenligne musen NC celle trekk kapasitet på fibronektin versus kollagen jeg, gitt at kollagen-IA1 er endogenously utskilles av mus, avian og menneskelige NC celler28,30,31,32. Kollagen jeg er derfor så relevant som fibronektin i hensynet til matrisen valg. Det er også verdt å erkjenne at biotilgjengeligheten av vekstfaktorer i Media kan endres av ulike matrise komponenter, spesielt på grunn av høyt serum innhold av våre medier. For å overkomme dette jobber vi for tiden med å produsere serum frie definerte kultur forhold. Disse definerte medier er med hell brukes i neural Crest induksjon protokoller i pluripotent stilk cellen feltet, men krever ytterligere optimalisering for våre NC explant kultur system33,34. Vårt arbeid kan også fungere som et utgangspunkt for raffinering forhold til andre typer NC celler som CARDIAC og trunk NC, og for senere studier av NC differensiering. Viktigst, tillater denne protokollen isolering av skallen NC celler for en rekke applikasjoner. Vi ser for oss studier på styrt migrasjon, 3-D migrasjon og invasjon. Celler isolert på denne måten kan behandlesin vitrofor en rekke analyser. Celler kan for eksempel lett behandles ved hjelp av forskjellige små molekyler for å målrette mot bestemte proteiner, de kan behandles på definerte tids punkt, og bleke eksperimenter kan utformes for å fastslå gjenoppretting av celle atferd (Figur 4). Lengre sikt kultur for transfeksjoner og differensiering analyser er mulig, samt passasje av celler (data ikke vist). Imidlertid bør levedyktigheten, kapasiteten på cellefornyelse og multipotency valideres etter passaging. Celler belagt på glass coverslips kan også brukes i immunofluorescent farging protokoller, etter Live Imaging. Til slutt, representerer denne tilnærmingen et enormt kraftig system for å studere migrasjon av NC fra genetiske musemodeller22,23,24,25.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til King ‘ s College London Biological Services Unit, spesielt Tiffany Jarvis og Lynsey Cashnella for deres fortsatte støtte. Vi takker Derek stemple, Mamoru Ishii og Robert Riise for råd og hjelp med reagenser under innledende etablering av denne protokollen. Vi takker Dheraj Taheem for hjelp med gamma-bestråling av STO celler. Vi takker Liu og Krause Labs, spesielt Tommy Pallet, for god støtte. Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra BBSRC (BB/R015953/1 til KJL/MK), en studentship fra MRC doktorgrads opplæringsprogram (LD), newland Pedley Fund (ALM) og KRIPIS II, General sekretariatet for forskning og teknologi (GSRT), utdannings-og religions departementet Hellas og Fondation santé (til SGGM).
bFGF | R&D systems | 233-FB | |
b-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
Tissue culture flasks | Corning | 430639 | 25cm2 culture flasks |
DMEM (4500 mg/L glucose) | Sigma | D5671 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (dPBS) | Sigma | D8537 | |
Ethanol | Fisher Chemicals | E/0650DF/C17 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | TFS AA 10-155 | |
Fetal Bovine Serum (ES Cell FBS) | Gibco | 26140079/16141-079 | |
Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
Gelatin from bovine skin | Sigma | G9382 | |
L-glutamine | Sigma | G7513 | |
Glass-bottomed, multi-well 24-well tissue culture plate | Ibidi | 82406 | Glass-bottomed, No 1.5, 24-well tissue culture dish with black sides |
Cell migration analysis tool | Ibidi | v2.0 | Manuals for this software can be found at: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html. |
Circularity Plug-in | ImageJ | v1.29 or later | The circularity plug-in is an extended version of ImageJ/Fiji’s Measure command, designed by Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov). |
LIF | ESGRO by Millipore | ESG1106 | |
Manual Cell Tracking Plug-in | ImageJ | v1.34k or later | ref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (France) 2005 |
Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
MEM non-essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-050 | |
Matrigel (ECM-based Hydrogel) | Corning | 356234 | |
Microscope | Olympus | 1X81 | Olympus 1X81 inverted microscope |
Microscope camera | Photometrics | 512B | Photometrics Cascadell 512B camera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objectives) |
Microscope controller | Olympus | 1X2-UCB | Olympus 1X2-UCB microscope controller |
Microscope temperature controller | Solent Scientific | RS232 | Maintained at 37°C |
Penicillin/streptomycin | Sigma | A5955 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
Statistics software | Graphpad Prism | v7.0 | |
STO feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ | |
XY microscope stage controller | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MS-4400 |