Summary
אנו מציגים פרוטוקול RNA קטן מפורט של הספרייה רנ א עם פחות הטיה מאשר שיטות סטנדרטיות רגישות מוגברת עבור 2 '-O-מתיל RNAs. פרוטוקול זה יכול להיות בעקבות שימוש ריאגנטים תוצרת בית כדי לחסוך עלות או באמצעות ערכות לנוחות.
Abstract
המחקר של RNAs קטן (sRNAs) לפי רצף הדור הבא (NGS) הוא מאותגר על ידי בעיות הטיה במהלך הכנת הספרייה. מספר סוגים של sRNA כגון צמח microRNAs (miRNAs) לשאת 2 '-O-מתיל (2 '-OMe) שינוי ב 3 ' מסופים שלהם שלהם. שינוי זה מוסיף קושי נוסף כאשר הוא מעכב את החיבור של 3 מתאמים. בעבר הדגמנו שלגירסאות ששונו של פרוטוקול TruSeq (TS) יש פחות הטיה וזיהוי משופר של 2 ' מוכן '. כאן אנו מתארים בפרוטוקול פירוט ' TS5 ', אשר הראה את הביצועים הכוללים הטוב ביותר. TS5 ניתן לעקוב גם באמצעות ריאגנטים תוצרת בית או ריאגנטים מערכת TS, עם ביצועים שווים.
Introduction
RNAs קטנים (sRNAs) מעורבים בשליטה של מגוון תהליכים ביולוגיים1. התקנות הרגולטוריות של eukaryotic הן בדרך כלל בין 20 ל-30 nt; שלושת הסוגים העיקריים הם microRNAs (miRNA), piwi-אינטראקציה RNAs (piRNA) ו-RNAs מתערב קטן (siRNA). רמות הביטוי המוטעות היו מעורבים במגוון מחלות2. זה מדגיש את החשיבות של miRNAs בריאות ומחלות והדרישה לכלי מחקר מדויקים, כמותיים כדי לזהות sRNAs בכלל.
רצף הדור הבא (NGS) הוא שיטה נפוצה ללימוד sRNAs. היתרונות העיקריים של ngs לעומת גישות אחרות, כגון ה-PCR כמותי או טכניקות microarray (qpcr), הם שהוא אינו זקוק לידע פריורי של רצפי srna ולכן ניתן להשתמש בהם כדי לגלות rnas הרומן, ובנוסף הוא סובל פחות מ אותות רקע ואפקטי רוויה. עוד, הוא יכול לזהות הבדלים נוקלאוטיד יחיד ויש לו תפוקה גבוהה יותר מאשר מיקרו מערכים. עם זאת, NGS יש גם כמה החסרונות; העלות של הפעלה ברצף נותרת גבוהה יחסית ותהליך רב הנדרש כדי להמיר מדגם לספריה לרצף עשוי להציג הטיות. בתהליך ההכנה האופייני של ספריית srna, מתאם 3 מגיע לראשונה ל-srna (לעתים קרובות ג'ל מזוקק מ-rna הכולל) בגרסה קטומה של rna ליגאז 2 (RNL2) ומתאם 3 מקדים (איור 1) בהיעדר ATP. הדבר מגביר את היעילות של הקשר המתאם של sRNA ומפחית את היווצרות התגובות הצדדיות כדוגמת sRNA circularization או קונקטאריזציה. לאחר מכן, 5 ' מתאם הוא ליגיום על ידי RNA ליגאז 1 (RNL1), ואחריו תמלול הפוכה (RT) ו-PCR הגברה. כל השלבים הללו עשויים להציג הטיה3,4. כתוצאה מכך, קריאת מספרים עשויה שלא לשקף רמות ביטוי בפועל של sRNA המובילות לתבניות ביטוי מלאכותיות התלויות בשיטה. SRNAs ספציפיים עשוי להיות מוגדר או לא מיוצג בספריה, ומאוד מיוצגת על-ידי sRNAs שעשוי להימלט מזיהוי. המצב מורכב במיוחד עם mirnas צמחים, sirnas בחרקים וצמחים, ו pirnas בחרקים, נמטודות ויונקים, שבו 3 ' מסוף נוקלאוטיד יש 2 '-O-מתיל (2 '-OMe) שינוי1. שינוי זה מעכב בחוזקה 3 ' מתאם התאמה5, ביצוע הכנה ספריה עבור סוגים אלה של RNA משימה קשה.
העבודה הקודמת הוכיחה שלקשר מתאם מציג הטיה רצינית, עקב השפעות רצף/מבנה RNA6,7,8,9,10,11. מדרגות במורד הזרם של המתאם כגון תעתיק הפוך ו-PCR לא תורמים באופן משמעותי להטיה6,11,12. הטיה ליפטיים היא כנראה בשל העובדה כי מולקולות מתאם עם רצף נתון יהיה אינטראקציה עם מולקולות sRNA בתערובת התגובה לטופס מקפלים שכונתיות, כי יכול להוביל תצורות חיוביות או שלילי לצורך הארכה (איור 2). נתונים מsorefan ואח '7 מראים כי RNL1 מעדיף הקשר נטוש יחיד, בעוד RNL2 מעדיף סטרנד כפול לצורך הארכה. העובדה שמבני הקיפול המשותף של המתאם/sRNA נקבעים על-ידי המתאם הספציפי ורצפי sRNA מסביר מדוע sRNA ספציפי מיוצג באמצעות ערכת מתאם נתונה. חשוב גם לציין שבתוך סדרה של ספריות sRNA שיש להשוותו, יש להשתמש באותם רצפי מתאמים. אכן, זה בעבר נצפתה כי שינוי מתאמים על ידי המבוא של רצפי ברקוד שונים משנה את פרופילי mirna ב רצף ספריות9,13.
אקראיות של רצפי מתאמים ליד צומת החיבור עלולה להקטין את הביסים האלה. Sorefan ועמיתיו7 מתאמים משומשים עם 4 נוקלאוטידים אקראיים בגפיים שלהם, המיועדים "high Definition" (HD) מתאמים, והראו כי השימוש במתאמים אלה מוביל לספריות שמשקפות טוב יותר את רמות הביטוי srna אמיתי. עבודה עדכנית יותר אישרה תצפיות אלה וחשף כי האזור האקראי אינו צריך להיות סמוך לצומת החיבור11. סוג זה של המתאמים נקרא "MidRand" מתאמים. יחד, תוצאות אלה מדגימות כי עיצוב מתאם משופר יכול להפחית את ההטיה.
במקום לשנות את המתאמים, הטיה ניתן לדכא דרך האופטימיזציה של תנאי התגובה. פוליאתילן גליקול (יתד), סוכן macromolecular צפיפות הידוע כדי להגדיל את יעילות לקצץ14, הוכח להפחית באופן משמעותי הטיה15,16. מבוסס על תוצאות אלה, כמה "נמוך הטיה" ערכות הופיעו בשוק. אלה כוללים ערכות המשתמשות ב-יתד בתגובות הקשר, או בשילוב עם מתאמים קלאסיים או מתאמי HD. ערכות אחרות להימנע לחלוטין, ולהשתמש 3 ' פוליאדלציה ומיתוג תבנית עבור 3 ' ו 5 ' מתאם התוספת, בהתאמה12. בעוד אסטרטגיה אחרת, הארכה של 3 מתאמים מלווה בצעד מעגלי, ובכך משמיט את החוגה של 5 מתאמים17.
במחקר קודם חיפשנו פרוטוקול הכנה של ספריית sRNA עם הרמות הנמוכות ביותר של הטיה ואת הזיהוי הטוב ביותר של 2 '-OMe RNAs12. בדקנו כמה מהעירייה ' הטיה נמוכה ' ערכות, אשר היה זיהוי טוב יותר של 2 '-OMe RNAs מאשר פרוטוקול רגיל (TS). באופן מפתיע עם זאת, עם השינוי (השימוש של מתאמים אקראיים, פג בתגובות לתיקון והסרה של עודף 3 ' מתאם על ידי טיהור) האחרון ביצע את הפרוטוקולים האחרים לאיתור של 2 '-OMe RNAs. כאן, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול מבוסס על פרוטוקול TS, ' TS5 ', אשר היה הזיהוי הכללי הטוב ביותר של 2 '-כולל RNAs. הפרוטוקול יכול להיות בעקבות באמצעות ריאגנטים מערכת ה-TS ומגיב אחד מן הקיט ' Nf ' או, כדי לחסוך כסף, באמצעות ריאגנטים תוצרת בית, עם ביצועים שווים. אנו מספקים גם פרוטוקול מפורט לטיהור של sRNA מ-RNA הכולל והכנת מתאם 3 מראש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בידוד של RNAs קטנים
- לחלץ כולל RNA בעזרת ריאגנטים מבוססי פנול או כל שיטה אחרת. ודא אם ה-RNA הוא באיכות טובה.
- הפעלה מראש של 15% TBE-אוריאה ג'ל (ראה טבלת חומרים) עבור 15 דקות ב 200 V.
- בעוד הג הוא מראש ריצה, לערבב 5-20 μg של RNA סה כ 5-15 בנפח μl עם נפח שווה של שוויון הטעינה צבע ( לראות את טבלת חומרים; 95% לאחר העדכון, 0.025% ברומאופנול כחול, 0.025% קסילן, 5 מ"מ מתחת pH 8) בתוך 200 μl PCR הצינור. כמו כן, לערבב 10 μL (200 ng) של סולם קטן-RNA (ראה טבלת חומרים) עם נפח שווה של שוויון הטעינה צבע. מודטה עבור 5 דקות ב 65 ° c ב מכסה התרמי עם המכסה מחומם, ואז למקם את הצינורות מיד על הקרח.
- טען את הסולם ואת המדגם על אותו ג'ל עם נתיב אחד לפחות ביניהם לרוץ ב 200 V עד ברומאופנול כחול (כחול כהה) היגרו כשני שליש של אורך ג'ל (כ 40 דקות).
- להכין מערכת כדי elute RNA מ ג'ל כדלקמן: ניקוב התחתון של nuclease-חינם 0.5 mL מיקרו צנטריפוגה שפופרת עם מחט 21 מד. מניחים את הצינור 0.5 mL מנוקב ב nuclease ללא שפופרת מיקרו-התחתון 2 mL.
- להסיר את הג, ו דגירה בטמפרטורת החדר עם 3 μL חומצה גרעין כתם ג'ל (10,000 x להתרכז; ראה טבלה של חומרים) ב 30 מ"ל מים עבור 10-15 דקות.
- הצגת ג'ל על ממאיר טרנס הקורא כהה (מומלץ מאוד להימנע UV כמו זה עלול לגרום נזק RNA) ולגזור את המדגם RNA בין 17 nt ו 29 nt הסולם להקות. העבר את פיסת ג'ל לצינור 0.5 mL משלב 1.5.
- צנטריפוגה את שפופרת 0.5 mL בצינור 2 mL ב צנטריפוגה מיקרו במהירות מקסימלית עבור 2 דקות. הסר 0.5 את צינור ה-mL, אשר אמור להיות ריק כעת.
- הוסף 300 μL של nuclease-חינם 0.3 M המשך לצינור 2 מ"ל המכיל את ג'ל מעוך ולסובב לפחות 2 h בטמפרטורת החדר או ב 4 ° צלזיוס לילה (16 h).
- להעביר את ההשעיה של חתיכות ג'ל כתוש לטור ספין (ראה טבלת חומרים) ו צנטריפוגה עבור 2 דקות במהירות מקסימלית בצנטריפוגה מיקרו.
- הוסף 1 μL (20 μg/μL) של גליקוגן (ראה טבלת חומרים) ו-950 μl של טמפרטורת החדר 100% אתנול. מודטה לפחות 30 דקות ב-80 ° c.
- צנטריפוגה עבור 20 דקות במהירות מקסימלית בצנטריפוגה מיקרו ב 4 ° c. הסר את supernatant, לשטוף את הגלולה עם 800 μL של קר 80% אתנול. צנטריפוגה שוב עבור 5 דקות ב-4 ° c, ובזהירות להסיר את כל supernatant. השהה מחדש את גלולה RNA ב 15 μl של מים חופשיים נוקלאז. בדרך כלל, ~ 5-20 ng של RNA קטן צריך להיות התאושש, בהתאם כמות של קלט RNA הכולל (~ 1 ng של RNA קטן לכל 1 μg של קלט RNA סה כ).
- צעד נוסף מומלץ: בדוק את הכמות והאיכות של sRNA התאושש (למשל, על ידי האלקטרופורזה ג'ל קפילר באמצעות ערכת RNA קטנה; ראה לוח חומרים).
2. הכנת מתאם HD 3 מקדים
הערה: באופן דומה לפרוטוקול המתואר על ידי חן ואח ', בוצע מתאם מסוג3-HD מראש. שים לב כי ניתן להזמין מתאם מראש ישירות (/5d/שינוי), אך זה יקר למדי.
- "הזמנה של 5" שלושה מתאמים. " ראה טבלה 1 עבור רצף ושינויים. שים לב כי ' 3AmMO ' הוא 3 ' קבוצה משנה אמינית, רוב הספקים יכולים לייצר olig, הגאות עם שינוי זה. לדלל ב נוקלאז מים ללא תשלום כדי 100 μm.
- הגדר תגובה 100 μl המכילה את הריאגנטים הבאים: 10 μl של oligo (100 μm), 10 μl של T4 מאגר ליגאז של RNA (10x), 10 μl של ATP (10 מ"מ), 40 μl של 50% PEG8000, 5 μl של T4 לליגאז 1 (50 יחידות), 25 μl של nuclease-מים ללא תשלום. המלון משלב בין לילה ב -20 ° c.
- בצע הפקת כלורופורם-פנול קלאסית של מחלת החמצן המוקדמת ואחריו משקעים של אתנול. הוסף 100 μL של חומצה (pH 4.5) פנול: כלורופורם ומערבולת. מסתובב 5 דקות בטמפרטורת החדר, מהירות מקסימלית. העבר בזהירות 90 μL של השלב העליון לשפופרת חדשה; להוסיף 10 μL של 3 M סודיום אצטט pH 5.2, 1 μL של הגליקוגן אולטרה טהורה ו 250 μL של הצטננות 100% אתנול.
- המשיכו במהירות של 20 ° c במשך 30 דקות לפחות. צנטריפוגה עבור 30 דקות ב -4 ° c מהירות מקסימלית. הסר את supernatant, לשטוף את הגלולה פעם אחת עם 500 μL קר 80% אתנול. כחלופה לחילוץ פנול-כלורופורם ומשקעים אתנול, ניתן להשתמש בערכת הסרת נוקלאוטיד (ראה טבלת חומרים). . השעיה מחדש ב -25 מיים Μi
- למדוד את הריכוז של המתאם באמצעות ערכה עבור זיהוי ספציפי של DNA אחד תקוע (ראה טבלת חומרים). דלל ל 80 ng/μL (10 μM).
- צעד נוסף מומלץ: לאמת את היעילות של פראדלציה על-ידי העברת 1 μL של 10 מתאם μM על 15% TBE-אוריאה ג'ל (טבלת חומרים) יחד עם מחלת היתר מטופל. המתאם הטרום-מעבר אמור להעביר מעט לאט יותר מאשר מחלת החמצן לא מטופלת. במידת הצורך, ניתן לטהר את המתאם הקדם-מקדים; להמשיך כמתואר לעיל (שלבים 1.2-1.12).
3. הכנת הספרייה-פרוטוקול TS5
הערה: אנו מציגים כאן את פרוטוקול TS שונה ' TS5 ' שתיארנו בעבר12 , כי ניתן לבצע גם עם ריאגנטים מן הערכה או עם ריאגנטים שסופקו עצמית. יצוין כי הצלחנו להשיג תוצאות דומות או אפילו מעט יותר טוב עם פרוטוקול שונה, ' TS7 '. עם זאת, עם TS7 קשה יותר לחסל את המתאם. לפיכך העדפת לתאר TS5 בפרוטרוט, אך ניתן לאחר מכן להחליף את המתאמים רק בTS7. עבור TS7 השתמש ברצפי המתאם ' MidRand כמו (MRI) ' (טבלה 1). שים לב שהאזורים האקראיים נמצאים באמצע המתאמים. התחל עבור תמלול הפוכה ו-PCR יהיה hybridize לרצפים במורד האזור אקראי במתאם 3 ' ובמעלה הזרם של האזור אקראי במתאם 5 '. רצף יתחיל מהנוקלאוטיד האקראי הראשון במתאם 5.
- . הארכה של 3 מתאמים
- שילוב 1 μL של מתאם HD מסוג 3 אינץ ' (10 μM) עם 1 μL של רנ א קטן מטוהרים (~ 0.1-1 μM) בשפופרת מיקרו של 0.2 mL. מודטה עבור 2 דקות ב 72 ° c ב הציקלונט תרמו, ואז לשים ישירות על הקרח.
- הוסף 4 μl של 50% יתד 8000 (פתרון צמיגי; pipet לאט), 1 μl של מאגר ליגאז rna (10x), 1 μl של H2O, 1 μl של T4 rna ligase2 נחתך, ו-1 μl של מעכב rnase. המשך הלילה ב -16 ° c.
- חיסול מתאם בלתי מנוכה 3
- הוסף 10 μL של nuclease-מים חינם ומערבבים היטב. הוסף 6 μL של 3 M NaOAc pH 5.2 או מתאם פתרון מחסור מערכת Nf (טבלת חומרים) ומערבבים היטב. הוסף 40 μL של חרוזי טיהור מגנטיים (טבלת חומרים) ו 60 μl של איזופנול ו מערבבים היטב. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הניחו את הדגימה בארון תקשורת מגנטי עד שהפתרון מופיע ברור. הסר והשמט את הסופרנטאנט.
- הוסף 180 μL של המוכן טרי 80% אתנול. . ולאחר מכן להסיר לשמור על השימוש טרי מוכן 80% אתנול ולא מווסת עם 80% אתנול לתקופות ממושכות.
- בקצרה לסובב את הצינור ולהסיר נוזל שיורית כי ייתכן שנאספו בתחתית הבאר. תן את החרוזים יבשים עבור 2 דקות, ואז להשעות מחדש ב 22 μL של 10 מ"מ מילימטר טריס pH 8 או מאגר resuspend מן הערכה Nf. דגירה עבור 2 דקות, ולאחר מכן מגנט המדגם עד הפתרון מופיע ברור.
- הוסף 6 μL של 3 M NaOAc pH 5.2 או מתאם פתרון מחסור מערכת Nf (טבלת חומרים) לצינור חדש. העבר 20 μL של supernatant מהשלב הקודם לצינור החדש הזה ולערבב על ידי ליטוף. הוסף 40 μL של חרוזים מגנטיים ו 60 μL של 100% איזופנול ו מערבבים היטב על ידי ליטוף. דגירה של 5 דקות.
- מגנזיום את המדגם עד הפתרון מופיע ברור, ואז להסיר ולמחוק את הסופרנטאנט.
- הוסף 180 μL של המוכן טרי 80% אתנול. . ולאחר מכן להסיר טיטאק להשתמש טרי 80% אתנול מוכן לא לווסת עבור עם 80% אתנול לתקופות ממושכות.
- בקצרה לסובב את הצינור ולהסיר נוזל שיורית כי ייתכן שנאספו בתחתית הבאר. תן את החרוזים יבשים עבור 2 דקות, ולהשעות מחדש ב 10 μL של מים ללא החכירה. דגירה עבור 2 דקות, ולאחר מכן מגנט המדגם עד הפתרון מופיע ברור.
- העבר 9 μL של סופרנט לשפופרת חדשה. הוסף 1 μl של T4 לליגאז מאגר (10x) ו 1 μl של מים. לחלופין, הוסף 2 μl של מאגר ליגאז מערכת ה-TS.
- הארכה של מתאם 5.
- הוסף 1 μL של מתאם 5 ' HD (10 μM; שולחן 1) לצינור מ200 μL של שפופרת עם מכסה מחומם. דגירה עבור 2 דקות ב 70 ° c, ואז לשים את הצינור ישירות על הקרח.
- הוסף 1 μl של 10 מ"מ מ-ATP ו-1 μl של T4 לליגאז 1. מערבבים היטב על ידי ליטוף בעדינות. הוסף 3 μL של תערובת זו ל-RNA שלושה ליגבטים משלב 3.2.9 ומערבבים באמצעות ליטוף. המשך 1 h ב -28 ° c.
- תעתיק הפוך (RT)
- העברה 6 μL של 3 ' ו-5 ' מתאם RNA לצינור חדש 200 μL PCR (לשמור את הנותרים ~ 8 μL ב-80 ° צ' לשימוש מאוחר יותר במידת הצורך). הוסף 1 μL של התחל (10 μM; שולחן 1) ומערבבים באמצעות ליטוף. דגירה עבור 2 דקות ב 70 ° c, ואז לשים את הצינור ישירות על הקרח.
- הוסף את הריאגנטים הבאים עבור RT: 2 μL של מאגר הגדיל הראשון 5x, 0.5 μL של 12.5 מ"מ מיקס dNTP, 1 μL של 100 מ"מ DNTP, 1 μL של מעכבי RNase, ו-1 μL של היפוך הטרנסקריפטאז (טבלת חומרים). מיכל הדגירה 1 h ב 50 ° c.
- הגברה הPCR
- הוסף את הריאגנטים הבאים כדי 12.5 μL של תערובת התגובה RT: 10 μL של מאגר PCR פולימראז, 2 μL של אוניברסלי P5 פריימר (10 μM; טבלה 1), 2 μl של P7-מדד פריימר (10 μm; טבלה 1), 1 μl של 12.5 MM dNTPs, 0.5 ΜL של DNA פולימראז (טבלת חומרים), ו 22 μl של מים. . שמור על התגובה על הקרח עד השימוש
- הפעל את התוכנית הבאה של ה-PCR: 98 ° צ' למשך 30 ס מ, 11 מחזורים (98 ° c עבור 10, 60 ° צ' לשלושים 72 וחמישה ° c) ו-72 ° c במשך 10 דקות. שמרו על התגובה ב -4 ° c כשתסיים.
הערה: בנוגע למספר מחזורי ה-PCR: אנחנו בדרך כלל מבצעים 11 מחזורים, אבל זה צריך להיות ממוטב על ידי המשתמש. נסה לבצע את המספר הקטן ביותר האפשרי של מחזורי PCR.
- ג'ל לטיהור
- הפעל 5, 10 ו 20 μL של מוצר PCR על יליד 6% TBE ג'ל (ראה טבלת חומרים) יחד עם סולם מתאים (ראה לוח חומרים). הפעל את ג'ל עבור כ 1 h ב 145 V (עד כחול ברומנול מגיע לתחתית; הצבע הזה נודד בתנוחת 65 bp).
- להסיר את הג, ו דגירה עם כתם חומצה הגרעין ג'ל (ראה טבלת חומרים) במים עבור 10-15 דקות.
- הצגת ג'ל על "קורא כהה" ממאיר טרנס (מומלץ מאוד להימנע UV כמו זה עלול לגרום נזק RNA) ולגזור את להקת הספרייה ב 150 bp. הכינו מערכת כדי להכין את ה-RNA מ-ג'ל כמתואר בשלב 1.5 והעבר את החלק ג'ל לצינור ה-mL של 0.5.
- צנטריפוגה בצנטריפוגה מיקרו במהירות מקסימלית עבור 2 דקות. הסר את צינור 0.5 mL, אשר אמור להיות ריק עכשיו.
- הוסף 300 μL של nuclease-מים ללא שפופרת 2 mL המכילה את ג'ל מעוך ולסובב עבור לפחות 2 h בטמפרטורת החדר או ב 4 ° c בלילה.
- להעביר את ההשעיה של חתיכות ג'ל כתוש במים לטור ספין צנטריפוגה עבור 2 דקות במהירות מקסימלית.
- להוסיף 1 μL של (20 μg/μL) גליקוגן, 30 μL של 3 M NaOAc ו 975 μL של קרח קר 100% אתנול. צנטריפוגה עבור 20 דקות במהירות מקסימלית ב -4 ° c.
- השהה מחדש את הגלולה ב 20 μL של 10 מ"מ Tris pH8. השתמש 1 μL עבור מדידת ריכוז 1 μL עבור בקרת איכות.
4. ניתוח נתונים
הערה: הליך ניתוח נתונים המתואר להלן מבוסס על מערכת ההפעלה Linux אובונטו 16.04 הארה.
- טיפול בקבצי רצף גולמי
- הורד את קובץ הרצף של FASTQ שנוצר במהלך הפעלת רצף. אם נדרש, לבצע deריבוב עם bcl2fastq2 (גירסה V 2.2.18.12; ניתן להוריד ידנית מהקישור הבא: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
השתמש בפקודה הבאה:
nohup Pathway_of_bcl2fastq/b cl2fastq--runfolder-dir Pathway_of_Run --התעלם-חסר-bcl-פלט-dir Pathway_of_Output_Directory -ברקוד-אי-התאמות 1--צבור-אריחים אוטומטי-r 16-d 16-p 16-w 16 - הסר רצפי מתאם באמצעות התאמת הקיצוץ19 גירסה 1.15. מדריך ניתן להוריד כאן: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
השתמש בפקודה הבאה:
Pathway_to_cutadapt/ הסתגלות-כמוסות-משחק 4-m 10-j 0--לקצץ 10-o Output_File_Read1_cutadapt. Fastq. gz Input_File_Read1. fastq. gz (...)
שים לב כי הרצף בפקודה מתאים למתאם 3 ' HD ללא 4 נוקלאוטידים אקראיים; לפיכך לא יוסרו במהלך שלב זה. - השתמש seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) להסרת מסופים אקראיים נוקלאוטידים בקריאות הרצף. השתמש בפקודה הבאה (שמות משתנים בהדגשה):
seqtk trimfq-b 4-e 4 Output_File_Read1_cutadapt . fastq > Output_File_Read1 מיכל כהן . fastq - השתמש בפקודה awk הבאה כדי למחוק את הרצפים הקצרים מ-10 nt:
awk ' בגין {FS = "\t"; פרסות = "\n"} {כותרת = $0; המשך השורה העליונה; קבל קו כותרת qheader; getline qheader; אם (אורך (seq) > = 10) {כותרת הדפסה, seq, כותרת עליונה, qheader}} ' Output_File_Read1_ גזוז. fastq > Length_Filtered. fastq
- הורד את קובץ הרצף של FASTQ שנוצר במהלך הפעלת רצף. אם נדרש, לבצע deריבוב עם bcl2fastq2 (גירסה V 2.2.18.12; ניתן להוריד ידנית מהקישור הבא: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
- מיפוי הרצפים הגזומים
- הורד את מסד הנתונים המתאים לאורגניזם של המחקר מ miRBase כדלקמן. עבור לhttp://www.mirbase.org/ftp.shtml והורד את הקובץ ' בוגר. fa '. שים לב שהרצפים מצוינים בסימון RNA. החליפו את השקעים ב-T באמצעות הפקודה הבאה:
! > s/U/T/g ' בוגרת. פא
הערה: זה יהיה להניב רשימה מלאה של כל miRNAs ב Mirnas, שמקורם מגוון של אורגניזמים. - בחר את רצפי miRNA של האורגניזם המעניין בפקודה הבאה:
awk 'name_of_the_organism{הדפסה; הבאה (nr + 1]; הבא}; ע"נ בוגרת. פא > mature_name_of_the_organism_מירס. - מפה את הקריאות לקובץ שנוצר לעיל באמצעות Bowtie220 (גירסה 2.3.0) ואינה מאפשרת אי התאמות. תחילה, בניית אינדקס עבור הקובץ באמצעות הפקודה הבאה:
bowtie2-בניית mature_name_of_the_organism_מירס. פא mature_name_of_the_organism_מירס - יישר את שינויים ברצף הקריאות למסד הנתונים, תוך הדרישה שמפות קריאה לחלוטין ל-miRNA של מסד הנתונים, ללא כל התאמות. לשם כך, השתמש בכלי הבא:
bowtie2-N 0-L 10--ציון-min C, 0, 0--קצה לקצה-זמן-x-mature_name_of_the_organism_מירס-U Length_Filtered. Fastq-S Length_Filtered_ALIGNMENT. sam
הערה: האפשרות:--ציון-מינימום C, 0, 0 מבטיחה שהיישור יהיה ללא כל התאמות. להסבר על הפרמטרים השונים בכלי, בקר באתר האינטרנט הבא: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml - כדי למחוק את הקריאות שלא התיייישרו, השתמש בפקודה הבאה:
samtools תצוגה-F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT. Sam > Reads_aligned_to_Mirsסם
הערה: כתוצאה משלבים אלה, עליך לקבל כעת את הקריאות המיושרות, המתאימות ל-miRNAs.
- הורד את מסד הנתונים המתאים לאורגניזם של המחקר מ miRBase כדלקמן. עבור לhttp://www.mirbase.org/ftp.shtml והורד את הקובץ ' בוגר. fa '. שים לב שהרצפים מצוינים בסימון RNA. החליפו את השקעים ב-T באמצעות הפקודה הבאה:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שלבים קריטיים הם הבידוד של חלק RNA קטן של החומר ההתחלתי RNA הכולל (איור 3) ואת המוצר המבוקש הסופי ספרייה (איור 4). שני השלבים כרוכים בטיהור פוליאקרילאמיד ג'ל; רנ א קטן מבודד מ 15% שתנן TBE ג'ל, בעוד הספריות הסופיות מבודדות מ 6% הילידים TBE ג ' לים. רנ א קטן מבודד ג'ל ניתן לנתח על שבב האלקטרופורזה קטן RNA נימי (טבלת חומרים; איור 3 ב). זה יאפשר למשתמשים להעריך את כמות ה-RNA הקטן התאושש ואת החלק של mirna בהכנה.
ג'ל טיהור של מוצר הספרייה הסופית הוא צעד עדין כמספר מוצרים נוספים העוברים קרוב לספרייה הרצויה. חשוב לא להעמיס על הג את הג כך שיגדיל את הסיכון לזהם את הספרייה עם מינים אחרים, כגון מתאמים. כדוגמה (איור 4), כמויות הולכות וגדלות של ספריית ה-PCR-מוגבר (מ -napus RNA) נטענו על הג'ל והמוצר המתאים לגודל הצפוי (150 Bp) נחתך (איור 4א). לאחר הימנעות, הספרייה הטהורה נבדקה על שבב אלקטרופורזה של ג'ל קפילר; בנוסף למוצר הצפוי 150 bp, שיעור הולך וגובר של מינים 130 bp, המתאים דימרים מתאם שנצפו כמויות הגוברת של מוצר ה-PCR נטענו (איור 4ב, ג).
בדקנו אם פרוטוקול TS5 מבצע באופן דומה עם ריאגנטים תוצרת בית כמו עם מגיב מתוך ערכות. לשם כך, הכנו ספריות מתוך תערובת של RNAs מלאכותי קטן 1-6, כל מתנה ללא או עם 2 '-OMe שינוי, כפי שנעשה במחקר הקודם שלנו12. איור 5 מראה את הפרופורציה של קריאות המתאימות לכל אלה rnas שהתקבלו בעבר עם הספריות החדשות שנעשו באמצעות ריאגנטים מן TS ו-Nf ערכות או מספקים אחרים. כפי שניתן לראות, תוצאות דומות מאוד התקבלו.
איור 6 מציג השוואה בין הביצועים של פרוטוקול TS5 עם פרוטוקול TS סטנדרטי לאיתור הצמח (a. thaliana ו-napus) מירנאס, שהם 2 ' שונה, ו של מירנאס אנושיים שלא השתנו. בדקנו גם את הזיהוי של piRNAs, 2 '-OMe שונה בדגימות אדם. כפי שניתן לראות, TS5 מבצעת באופן משמעותי יותר מאשר TS עבור זיהוי של 2 '-OMe מוכן אך לא עבור RNAs שלא שונו. עם זאת, גם עבור sRNAs שלא התבצעה בעבר, למרות שאין מספר גדול יותר של RNAs, מספרי הקריאה המתקבלים כנראה משקפים בצורה טובה יותר את רמות הביטוי האמיתיות עם TS5 מאשר עם TS עקב רמות נמוכות יותר של הטיה.
איור 1 . ייצוג סכימטי של זרימת העבודה של הכנת הספריה sRNA לקביעת רצף ממאיר. ראשית, sRNAs מבודדים באמצעות צעד טיהור ג'ל. כאן, טווח הגודל של miRNAs מצוין אך ניתן לבחור בכל טווח גודל אחר, בהתאם ל-RNAs של הריבית. שלב בקרת איכות (QC) מבוצע לבדיקת האיכות והכמות של sRNA מבודד. במהלך הכנת הספריה, מתאם מקדים (App) 3 הוא החיבור הראשון ל-sRNA. לאחר מכן, מתאם של 5 הינו ליגנטי. לאחר מכן מבוצעת שעתוק הפוך באמצעות פריימר משלימה את 3 ' מתאם, ואחריו הגברה PCR, במהלכה הP5 המאיר, P7, ו-index (' In ') הרצפים נוספים. הספריה שנוצרת מטוהרת ג'ל ולאחריה שלב בקרת איכות. לאחר מכן הספריה מקורה ברצף והנתונים מנתחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 . הטיה עקב מתאמים תלויי-רצף-sRNA לקיפול שותף. בתערובת הקשר של המתאם, המתאמים יקופלו ב-sRNAs באופן שתלוי ברצף המתאם ו-Srnas. כך, sRNAs שונים (מומחש לפי דוגמאות a, b, ו-c; המצוין על ידי גוונים שונים של ירוק) יהיה מקופל באופן שונה עם מתאם נתון (3 ' מתאם מצוין באדום, מתאם 5 מצוין בכחול). החיצים השחורים מציינים צמתים לחיבור. הדבר עלול להוביל להקשר חיובי או שלילי לצורך הארכה. כפי RNL2 נראה להעדיף סביבה כפולה תקוע, 3 ' הארכה צפויה להיות יעילה יותר עבור RNAs a ו-b מ-RNA c. עם RNL1 יש העדפה לאזור תקוע אחד סביב צומת החיבור, 5 ' הקשר מתאם יכול להיות היעיל ביותר עבור RNA a, ואחריו b ופחות יעיל עבור c. ביחד זה עשוי לגרום לייצוג מופרז של sRNA a, ביניים ייצוג של RNA b וייצוג בלתי מנוצל של RNA c בספרייה הסופית, גם אם שלוש RNAs קיימים בכמויות שוות במדגם RNA המקורי. שים לב שבצורה דומה, sRNA נתון יוצג באופן שונה בעת שינוי רצף המתאם (לדוגמה, על-ידי הוספת ברקודים שונים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 . בידוד של RNA קטן ובקרת איכות. (א). הפרדה אלקטרופיניטית של כרוב בעלי RNA (10 μg) על 15% שתנן בשילוב ג'ל פוליאקרילמיד. סולם RNA קטן (ראה טבלת חומרים) הועבר לאורך כסמן גודל מולקולרי. לאחר הגירה הג היה מוכתם ו-RNA היה מדמיינו על מאייר טרנס. האזור מ -17 עד 29 נוקלאוטידים היה נחתך (המצוין על ידי מלבן אדום) ו-RNA היה השתמט. (ב). האיכות של RNA מטוהר נבדק על ידי אלקטרופורזה ג'ל נימי. שים לב שניתוח זה מספק מידע על החלק של miRNA במדגם (93% במקרה זה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 . ג'ל לטיהור של ספריית ה - RNA הקטנה שהוכנה בעקבות פרוטוקול TS5 ובקרת איכות. (א). הגדלת כמויות של הספרייה המוגברת של ה-PCR מ -B. napus קטן RNA היה טעון על 6% מקורי tbe ג'ל; 2.5 μL (a), 5 μL (b), 10 μL (c) או 20 μL (d) מוצר PCR. . סולם של 50 bp הועבר לצד מוצרי ה-PCR הנודדים בעמדת 150 pb הצפויה היו מבודדים (מלבן אדום), הדנ א היה מטוהר. (ב). בקרת איכות של הספרייה הטהורה; . ייצוג ג'ל (ג). ייצוג אלקטרופראגרמה של אותו ניתוח. כפי שניתן לראות, מוצר 150 pb הוא מזוהם יותר ויותר עם דימרס מתאם (~ 130 bp) כמו כמויות גדולות יותר של מוצר ה-PCR מועברים על ג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 . פרוטוקול TS5 מבצע באופן דומה עם ריאגנטים מ-TS ו-Nf ערכות או עם ריאגנטים מספקים אחרים. היסטגרמות המייצגים את אחוז המספרים הכולל של קריאות raw (לפני זמירה) המתאימים RNA (OMe) 1-6 עם פרוטוקול TS5 ואחריו ריאגנטים מ-TS ו-Nf ערכות (ברים כחולים), או ריאגנטים מספקים אחרים (ברים כתומים). לצורך השוואה, תוצאות המחקר הקודם שלנו מוצגות על ידי סורגים אפורים. המספר הכולל של קריאות המתאימות ל-RNA1-6 (rna כולל) או Rna-OMe1-6 (סה כ rna-OMe) מוצגים גם הם. מוצגים הם הערכים הרעים של לפחות שני ניסויים עצמאיים. קווי שגיאה מייצגים סטיות סטנדרטיות. חלק מדמות זו השתנה מ-Dard-Dascot ואח ', 201812נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6 . השוואת הזיהוי של מירנה של פרוטוקול TS5 עם שיטת TS קלאסית. (א). החלק הקורא מיפוי ל -thaliana, B. Napus, או H. מירנס מירונס בmirnas נקבעו. כמו כן, מיפינו את קריאות הספריות האנושיות ל-piRBase לאיתור הגילוי של Pirbase. שים לב לכך . thaliana ו ב. napus mirnas, כמו גם הפירנאס האדם הם 2 '-בסדר שונה, בניגוד מירנאס האדם. מוצגים הם הערכים המורעים של לפחות שני ניסויים עצמאיים וקווי השגיאה מייצגים סטיות סטנדרטיות. (ב). זוהו מספרי מירנאס (או פירנאס). קבענו את מספר miRNAs ידוע ממינים שונים שזוהו עם פרוטוקולים TS או TS5. שים לב לכך שעבור A. thaliana , B. napus, או H. ספיינס, 427, 92, ו 2588 Mirnas נרשמו ב mirnas, בהתאמה. 500,000 קריאות מספריות TS או TS5 ממופות ל -B. napus mirnas ב-mirnas, 1,000,000 קריאות מופו למסדי הנתונים של א. thaliana או של האדם. מוצגים הם הערכים המורעים של לפחות שני ניסויים עצמאיים עם סטיות סטנדרטיות המיוצגות על-ידי קווי שגיאה. דמות זו השתנתה מ-Dard-Dascot ואח ', 201812. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שמות השמות | 5 ' שינוי | 3 ' שינוי | רצף 5 ' עד 3 ' | טיהור | |||||
| מתאם HD (TS5) 5 ' | מיכל שלמה | (רמת הסדר) שימו לב, אוליגו זה oligo הוא DNA-RNA כימאריק; שלושת 3 ' מסוף nts הם רנ א (rna) | HPLC | ||||||
| מתאם HD (TS5) 3 | פוספט | שלושה תחמושת | [Phos] הערה [3Aamn] (שימו לב כי אוליגו זה הוא DNA-RNA כימאריק; ארבעת 5 ' מסוף nts הם RNA) (משחק) | HPLC | |||||
| מתאם MRI 5 (TS7) | מיכל שלמה | (רמת הסדר) שימו לב כי אוליגו זה הוא DNA-RNA כימאריק; שבעת ה-3 מסוף nts הם RNA) (הטרמינל השלישי של המסוף) | HPLC | ||||||
| מתאם MRI (TS7) 3 | ליצירת פוספאט | שלושה תחמושת | פוספטים GTATCGTNNNNNNTGGAATTCTCGG | HPLC | |||||
| פריימר | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | HPLC | |||||||
| P5 פריימר אוניברסלי | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | HPLC | |||||||
| P7-מדד פריימר | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA (NNNNNN = אינדקס) | HPLC | |||||||
| מפתח 1: CGTGAT | |||||||||
| אינדקס שתיים: | |||||||||
| אינדקס 3: GCCTAA | |||||||||
| מפתח 4: TGGTCA | |||||||||
| מפתח 5: כרטיסייה | |||||||||
| מפתח הדו 6: הובלה | |||||||||
| מפתח הקובץ 7: גקיא | |||||||||
| מפתח 8: TCAAGT | |||||||||
| מפתח 9: CTGATC | |||||||||
| אינדקס 10: AAGCTA | |||||||||
| אינדקס: | |||||||||
| אינדקס 12: TACAAG | |||||||||
. שולחן 1 מחלת השמש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הכנה קטנה של ספריית RNA נותרת מאתגרת עקב הטיה, שהוצגה בעיקר במהלך שלבים להטיות במתאם. Rnas עם 2 '-OMe שינוי ב 3 ' סוף שלהם כגון צמח mirnas, pirna חרקים, נמטודות ויונקים, ו rnas מתערב קטן (sirna) חרקים וצמחים הם קשים במיוחד ללמוד כי 2 '-OMe שינוי מעכב 3 ' מתאם הקשר. מספר פתרונות הוצעו בספרות כדי לשפר את פרוטוקולי ההכנה של הספרייה sRNA, אך רוב הקיטים הזמינים מסחרית עדיין מבוססים על פרוטוקול ה-TS הקלאסי, הכולל הטיה חמורה. כמה ' הטיה נמוכה ' ערכות קיימות, עם זאת, כולל את הקיט Nf עם מתאמים אקראיים ו-פג בתגובות הקשר, וערכות כמה הופיעו לאחרונה להימנע הקשר מתאם לחלוטין12. אנו דיווחו בעבר כי Nf מזהה miRNAs שונים יותר מאשר פרוטוקול TS סטנדרטי, אבל הפרוטוקול של ' (ללא המתאם מתאם) התבצע גרוע יחסית בשל היווצרות משמעותי של מוצרי צד12. למרבה ההפתעה, עם השינוי לפרוטוקולי ה-TS היה זיהוי רגיש יותר של שתיים מתוך הפרוטוקולים האחרים, אך לא של sRNAs רגיל. בחרנו כאן כדי לתאר בפרוטרוט את הפרוטוקול TS5, שבו המתאמים הם אקראיים על הגפיים שלהם, פג משמש בתגובות הקשור ו-3 מתאם עודף מסולק על ידי טיהור על חרוזים. יצוין כאן שפרוטוקול שונה (TS7), שימוש במתאמי MRI עשוי לבצע בקלות רבה יותר מהפרוטוקול TS5. עם זאת, כפי שיש רק הבדלים משניים בין השניים ומכיוון עם TS7, קשה יותר להפריד את המוצר הרצוי הספרייה מתוך מתאם המתאם, העדפת כאן כדי לתאר בפרוטרוט את פרוטוקול TS5. עם זאת, משתמשים יכולים, אם תרצה, להחליף את מתאמי TS5 על-ידי TS7 מתאמים. שים לב כי אלה הם קצת יותר מובילות למוצר הספרייה הסופית של ~ 170 bp במקום ~ 150 bp.
האפשרות לבצע פרוטוקול TS5 או TS7 עם ' חומרים תוצרת בית ' מאפשר להפחית באופן משמעותי את העלות. עם זאת, ייתכנו שינויים גדולים יותר במונחים של איכות עם חומרים תוצרת בית; מתאם תלת-ממדי מתוצרת בית במיוחד עשוי להיות כפוף לאיכות משתנה בשל הefficacies שונות של טרום האדלציה. לכן מומלץ להכין מלאי גדול ואם מניה חדשה מוכנה, השוו את הביצועים שלו עם הקודם. ניתן להשתמש בדגימת RNA של שליטה למטרה זו.
חיסרון של הפרוטוקולים המתוארים להלן הוא היווצרות חזק יחסית של מוצרי צד והקושי להפריד את הספרייה הרצויה ממוצרים אלה. יש לקחת את הטיפול כדי לא להעמיס על ג'ל אקרילי לטיהור. לאחרונה פותחו מתאמים שהשתנו בעלי נטיה מופחתת ליצירת ממסיה21. שינוי 2 '-OMe בסוף 3 ' של מתאם 5 בשילוב עם שינויים מתילפוספונט ב 5 ' הגפיים של המתאם 3 ' מודחק ביעילות מתאם באופן יעיל. זה יהיה מעניין לבחון מתאמים שהשתנו כאלה בפרוטוקול המתואר במסמך זה.
שלבי הטיהור ג'ל בפרוטוקול TS5 הם יחסית עתירי עבודה. אם השימוש במתאמים ששונו מקטין ביעילות את היווצרות מתאמי המתאם, ייתכן שטיהור ג'ל של הספרייה הסופית לא יהיה נחוץ יותר. בנוסף, כחלופה לשלב הטיהור ג'ל כדי לבודד RNA קטן (צעד 1), אסטרטגיה באמצעות חרוזים מגנטיים להעשיר עבור RNAs קטן קיים (https://ls.beckmancoulter.co.jp/files/appli_note/Supplemental_Protocol_for_miRNA_.pdf). לא השתמשנו בשיטה זו בעצמנו, אבל זה שווה בדיקה ואם זה עובד טוב זה יכול לפשט באופן משמעותי את הפרוטוקול.
לסיכום, בעוד פרוטוקול TS5 יכול להיות שיפור נוסף, הוא מבצע טוב יותר מאשר ערכות זמין מסחרית, לפחות אלה שנבדקו בניתוח השוואתי הקודם שלנו, לאיתור של 2 ' בדום sRNA. זה יכול להיות בעקבות באמצעות חומרים תוצרת בית, המאפשר הפחתת עלות משמעותית. לנוחות, ואולי ביצועים מתמדת יותר, ריאגנטים מן TS ו-Nf ערכות ניתן להשתמש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי המרכז הלאומי למחקר מדעי (CNRS), האנרגיות החלופיות הצרפתיות והנציבות לאנרגיה אטומית ואוניברסיטת פריס-Sud. כל הכנות הספריה, המאייר רצף וביואינפורמטיקה ניתוחים עבור מחקר זה בוצעו במתקן I2BC הדור הבא (NGS). חברי המתקן I2BC NGS מודעים לקריאה קריטית של כתב היד והצעות מועילות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes | |||
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
- Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
- Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
- Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
- Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
- Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
- Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).
