Summary
Wir präsentieren ein detailliertes reparaturbasiertes Analyseprotokoll für kleine RNA-Bibliotheken mit weniger Voreingenommenheit als Standardmethoden und einer erhöhten Empfindlichkeit für 2'-O-Methyl-RNAs. Dieses Protokoll kann mit hausgemachten Reagenzien befolgt werden, um Kosten zu sparen oder Kits für die Bequemlichkeit zu verwenden.
Abstract
Die Untersuchung kleiner RNAs (sRNAs) durch Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) wird durch Voreingenommenheitsprobleme während der Bibliotheksvorbereitung in Frage gestellt. Mehrere Arten von sRNA, wie z. B. pflanzliche microRNAs (miRNAs), tragen eine 2'-O-Methyl(2'-OMe) Modifikation an ihrem 3' Terminalnukleotid. Diese Änderung fügt eine weitere Schwierigkeit hinzu, da sie 3' Adapterligation hemmt. Wir haben zuvor gezeigt, dass modifizierte Versionen des 'TruSeq (TS)'-Protokolls weniger Voreingenommenheit und eine verbesserte Erkennung von 2'-OMe RNAs haben. Hier beschreiben wir im Detail Protokoll 'TS5', das die beste Gesamtleistung zeigte. TS5 kann entweder mit hausgemachten Reagenzien oder Reagenzien aus dem TS-Kit mit gleicher Leistung verfolgt werden.
Introduction
Kleine RNAs (sRNAs) sind an der Kontrolle einer Vielfalt biologischer Prozesse beteiligt1. Eukaryotische regulatorische sRNAs sind in der Regel zwischen 20 und 30 nt groß; Die drei Haupttypen sind microRNAs (miRNA), piwi-interagierende RNAs (piRNA) und kleine störende RNAs (siRNA). Aberrante miRNA-Expressionsniveaus wurden in eine Vielzahl von Krankheiten verwickelt2. Dies unterstreicht die Bedeutung von miRNAs in Gesundheit und Krankheit und die Forderung nach genauen, quantitativen Forschungsinstrumenten zum Nachweis von sRNAs im Allgemeinen.
Die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) ist eine weit verbreitete Methode zum Untersuchen von sRNAs. Die Hauptvorteile von NGS im Vergleich zu anderen Ansätzen, wie quantitativepcR- oder Mikroarray-Techniken (qPCR), bestehen darin, dass es keine a priori-Kenntnisse der sRNA-Sequenzen benötigt und daher verwendet werden kann, um neuartige RNAs zu entdecken, und darüber hinaus leidet es weniger unter Hintergrundsignal- und Sättigungseffekte. Darüber hinaus kann es einzelne Nukleotidunterschiede erkennen und hat einen höheren Durchsatz als Mikroarrays. NGS hat jedoch auch einige Nachteile; Die Kosten für einen Sequenzierungslauf bleiben relativ hoch, und der mehrstufige Prozess, der zum Konvertieren einer Stichprobe in eine Bibliothek für die Sequenzierung erforderlich ist, kann zu Verzerrungen führen. In einem typischen sRNA-Bibliotheksvorbereitungsprozess wird ein 3'-Adapter zunächst mit einer abgeschnittenen Version von RNA Ligase 2 (RNL2) und einem vorgefertigten 3'-Adapter(Abbildung 1) in Abwesenheit von ATP an die sRNA (oft gelgereinigt von der Gesamt-RNA) gebunden. Dies erhöht die Effizienz der sRNA-Adapterligation und reduziert die Bildung von Seitenreaktionen wie sRNA-Zirkularisation oder Konthespirierung. Anschließend wird ein 5'-Adapter durch RNA Ligase 1 (RNL1) ligiert, gefolgt von Reverse Transkription (RT) und PCR-Verstärkung. Alle diese Schritte können Voreingenommenheit3,4einführen. Folglich spiegeln Lesezahlen möglicherweise nicht die tatsächlichen sRNA-Expressionsniveaus wider, die zu künstlichen, methodenabhängigen Expressionsmustern führen. Bestimmte sRNAs können in einer Bibliothek entweder über- oder unterrepräsentiert sein, und stark unterrepräsentierte sRNAs können der Erkennung entgehen. Besonders kompliziert ist die Situation bei pflanzlichen miRNAs, siRNAs in Insekten und Pflanzen und piRNAs bei Insekten, Nematoden und Säugetieren, bei denen das 3' Terminalnukleotid eine 2'-O-Methyl(2'-OMe)-Modifikationhat 1. Diese Modifikation hemmt die 3' Adapterligation5stark, was die Bibliotheksvorbereitung für diese Arten von RNA zu einer schwierigen Aufgabe macht.
Frühere Arbeiten zeigten, dass Adapterligation aufgrund von RNA-Sequenz-/Struktureffekten6,7,8,9,10,11eine schwerwiegende Verzerrung einführt. Schritte nach der Adapterligation wie Reverse Transkription und PCR tragen nicht wesentlich zur Verzerrung6,11,12bei. Ligationsverzerrung ist wahrscheinlich aufgrund der Tatsache, dass Adaptermoleküle mit einer bestimmten Sequenz mit sRNA-Molekülen in der Reaktionsmischung interagieren, um Co-Folds zu bilden, die entweder zu günstigen oder ungünstigen Konfigurationen für Ligation führen können (Abbildung 2). Daten von Sorefan et al7 deuten darauf hin, dass RNL1 einen einzelnen gestrandeten Kontext bevorzugt, während RNL2 einen Doppelstrang für Ligation bevorzugt. Die Tatsache, dass die Adapter/sRNA-Ko-Faltstrukturen durch die spezifischen Adapter- und sRNA-Sequenzen bestimmt werden, erklärt, warum bestimmte sRNA mit einem gegebenen Adaptersatz über- oder unterrepräsentiert sind. Es ist auch wichtig zu beachten, dass innerhalb einer Reihe von sRNA-Bibliotheken verglichen werden sollten, die gleichen Adaptersequenzen verwendet werden sollten. In der Tat wurde bisher beobachtet, dass das Ändern von Adaptern durch die Einführung verschiedener Barcodesequenzen miRNA-Profile in Sequenzierungsbibliotheken9,13verändert.
Die Randomisierung von Adaptersequenzen in der Nähe des Ligationsknotens reduziert diese Verzerrungen wahrscheinlich. Sorefan und Kollegen7 verwendeten Adapter mit 4 zufälligen Nukleotiden an ihren Extremitäten, die als "High Definition" (HD) Adapter bezeichnet wurden, und zeigten, dass die Verwendung dieser Adapter zu Bibliotheken führt, die echte sRNA-Expressionsniveaus besser widerspiegeln. Neuere Arbeiten bestätigten diese Beobachtungen und zeigten, dass die randomisierte Region nicht an die Ligationskreuzung11angrenzen muss. Diese neuartige Art von Adaptern wurde "MidRand" Adapter genannt. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass ein verbessertes Adapterdesign Verzerrungen reduzieren kann.
Anstatt die Adapter zu modifizieren, kann Die Verzerrung durch die Optimierung der Reaktionsbedingungen unterdrückt werden. Polyethylenglykol (PEG), ein makromolekulares Crowding-Mittel, das bekanntermaßen die Ligationseffizienz14erhöht, hat gezeigt, dass es die Verzerrung15,16signifikant reduziert. Basierend auf diesen Ergebnissen erschienen mehrere "Low Bias"-Kits auf dem Markt. Dazu gehören Kits, die PEG in den Ligationsreaktionen verwenden, entweder in Kombination mit klassischen Adaptern oder HD-Adaptern. Andere Kits vermeiden Ligation ganz, und verwenden 3' Polyadenylierung und Template-Switching für 3' und 5' Adapter Addition, bzw.12. In einer weiteren Strategie folgt 3' Adapterligation durch einen Zirkularisierungsschritt, wodurch 5' Adapterligation17weggelassen wird.
In einer früheren Studie haben wir nach einem sRNA-Bibliotheksvorbereitungsprotokoll mit den geringstmöglichen Voreingenommenheitsgraden und der besten Detektion von 2'-OMe RNAs12gesucht. Wir haben einige der oben genannten "Low Bias"-Kits getestet, die eine bessere Erkennung von 2'-OMe RNAs als das Standardprotokoll (Standard Protocol, TS) hatten. Überraschenderweise jedoch bei der Modifikation (die Verwendung von randomisierten Adaptern, PEG in den Ligationsreaktionen und Entfernung von überschüssigen 3' Adapter durch Reinigung) übertraf letztere die anderen Protokolle für die Erkennung von 2'-OMe RNAs. Hier beschreiben wir detailliert ein Protokoll, das auf dem TS-Protokoll 'TS5' basiert und die beste Gesamterkennung von 2'-OMe RNAs hatte. Das Protokoll kann mit Reagenzien aus dem TS-Kit und einem Reagenz aus dem "Nf"-Kit oder, um Geld zu sparen, mit hausgemachten Reagenzien, mit gleicher Leistung befolgt werden. Wir bieten auch ein detailliertes Protokoll für die Reinigung von sRNA aus der gesamten RNA und die Herstellung von präadenylierten 3' Adapter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolierung kleiner RNAs
- Extrahieren Sie die gesamte RNA mit phenolbasierten Reagenzien oder einer anderen Methode. Überprüfen Sie, ob die RNA von guter Qualität ist.
- Führen Sie ein 15% TBE-Harnstoffgel (siehe Materialtabelle) 15 min bei 200 V vor.
- Während das Gel vorlaufend ist, mischen Sie 5-20 g Gesamt-RNA in einem Volumen von 5-15 l mit einem gleichen Volumen von Formamid-Ladefarbstoff (siehe Tabelle der Materialien;95% deionisiertes Formamid, 0,025% Bromphenolblau, 0,025% Xylol cyanol, 5 mM EDTA pH 8) in einem 200-L-PCR-Rohr. Ebenso mischen Sie 10 l (200 ng) kleine RNA-Leiter (siehe Tabelle der Materialien) mit einem gleichen Volumen von Formamid-Ladefarbstoff. 5 min bei 65 °C in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel inkubieren und die Schläuche sofort auf Eis legen.
- Laden Sie die Leiter und die Probe auf das gleiche Gel mit mindestens einer Spur zwischen ihnen und laufen Sie bei 200 V, bis das Bromphenolblau (dunkelblau) etwa zwei Drittel der Gellänge (ca. 40 min) migriert hat.
- Bereiten Sie ein System vor, um die RNA wie folgt aus Gel zu befreien: Punktieren Sie den Boden eines nukleasefreien 0,5 ml Mikrozentrifugenrohrs mit einer 21-Spur-Nadel. Legen Sie das punktierte 0,5 ml-Rohr in ein nukleasefreies Rundboden-Mikrozentrifugenrohr 2 ml.
- Entfernen Sie das Gel, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur mit 3 l Nukleinsäure-Gel-Färbung (10.000 x Konzentrat; siehe Tabelle der Materialien) in 30 ml Wasser für 10-15 min.
- Sehen Sie sich das Gel auf einem 'Dark Reader' Trans-Illuminator an (es wird dringend empfohlen, UV zu vermeiden, da dies die RNA beschädigen könnte) und schneiden Sie die Proben-RNA zwischen dem 17 nt und dem 29 nt Leiterband aus. Das Gelstück ab Schritt 1,5 in das 0,5 ml-Rohr geben.
- Zentrifugieren Sie das 0,5 ml-Rohr im 2 ml-Rohr in einer Mikrozentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 2 min. Entfernen Sie das 0,5 ml-Rohr, das jetzt leer sein sollte.
- Fügen Sie dem 2 ml-Rohr, das das zerkleinerte Gel enthält, 300 l Nacl-freie 0,3 M NaCl hinzu und drehen Sie sie mindestens 2 h bei Raumtemperatur oder bei 4 °C über Nacht (16 h).
- Übertragen Sie die Suspension von zerkleinerten Gelstücken in eine Spinsäule (siehe Materialtabelle)und Zentrifuge für 2 min bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge.
- Fügen Sie 1 l (20 g/l) Glykogen (siehe Materialtabelle)und 950 l Raumtemperatur 100 % Ethanol hinzu. Mindestens 30 min bei -80 °C inkubieren.
- Zentrifuge für 20 min bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei 4 °C. Den Überstand entfernen, das Pellet mit 800 l kaltem 80 % Ethanol waschen. Zentrifugieren Sie wieder für 5 min bei 4 °C, und entfernen Sie sorgfältig alle Überstand. Resuspend RNA Pellet in 15 l Nuklease-freies Wasser. In der Regel sollten 5-20 ng kleiner RNA zurückgewonnen werden, abhängig von der Menge der Eingangs-Gesamt-RNA (1 ng kleiner RNA pro 1 g Input-Gesamt-RNA).
- Empfohlener zusätzlicher Schritt: Überprüfen Sie die Menge und Qualität der zurückgewonnenen sRNA (z.B. durch Kapillargelelektrophorese mit einem kleinen RNA-Kit; siehe Tabelle der Materialien).
2. Vorbereitung des vorgefertigten 3' HD Adapters
HINWEIS: Die Vorpremiere des 3' HD-Adapters erfolgte ähnlich dem von Chen et al18beschriebenen Protokoll. Beachten Sie, dass vorgefertigte Adapter direkt bestellt werden können (/5rApp/ Modifikation), aber dies ist ziemlich teuer.
- Bestellen Sie 5' phosphoryliertes, 3' blockiertes 3' HD Adapter Oligonukleotid. Siehe Tabelle 1 für Sequenz und Änderungen. Beachten Sie, dass '3AmMO' eine 3' Aminomodifikatorgruppe ist, die meisten Lieferanten können Oligonukleotid mit dieser Modifikation produzieren. In nukleasefreiem Wasser auf 100 m verdünnen.
- Richten Sie eine 100-L-Reaktion ein, die folgende Reagenzien enthält: 10 l Oligo (100 m), 10 l T4-RNA-Ligasepuffer (10x), 10 l ATP (10 mM), 40 l 50 % PEG8000, 5 l T4-RNA-Ligase 1 (50 Einheiten), 25 l nukleasefreies Wasser. Über Nacht bei 20 °C inkubieren.
- Führen Sie eine klassische Phenol-Chlor-Extraktion des präadenylierten Oligonukleotids mit anschließender Ethanolfällung durch. Fügen Sie 100 l Säure (pH 4.5) Phenol: Chloroform und Wirbel hinzu. Drehen Sie für 5 min bei Raumtemperatur, maximale Geschwindigkeit. 90 L der oberen Phase vorsichtig in ein neues Rohr übertragen; 10 l von 3 M Natriumacetat pH 5,2, 1 l ultrareines Glykogen und 250 l kaltes 100% Ethanol hinzufügen.
- Mindestens 30 min bei -20 °C halten. Zentrifuge 30 min bei einer Höchstgeschwindigkeit von 4 °C. Entfernen Sie den Überstand, waschen Sie das Pellet einmal mit 500 l kalt 80% Ethanol. Als Alternative zur Phenol-Chlorform-Extraktion und Ethanol-Ausfällung kann ein Nukleotid-Entfernungskit verwendet werden (siehe Materialtabelle). In 25 L Wasser wieder aufsetzen.
- Messen Sie die Konzentration des Adapters mit einem Kit zur spezifischen Detektion von einsträngiger DNA (siehe Tabelle der Materialien). Verdünnung auf 80 ng/l (10 m).
- Empfohlener zusätzlicher Schritt: Überprüfen Sie die Wirksamkeit der Präadenylierung, indem Sie zusammen mit unbehandeltem Oligonukleotid 1 L von 10 M Adapter auf ein 15% TBE-Urea-Gel(Materialtabelle) migrieren. Der vorgefertigte Adapter sollte etwas langsamer als unbehandeltes Oligonukleotid migrieren. Auf Wunsch kann der vorgefertigte Adapter gelgereinigt werden; wie oben beschrieben (Schritte 1.2-1.12).
3. Bibliotheksvorbereitung - Protokoll TS5
HINWEIS: Wir präsentieren hier das modifizierte TS-Protokoll 'TS5', das wir zuvor12 beschrieben haben und das entweder mit Reagenzien aus dem Kit oder mit selbst bereitgestellten Reagenzien durchgeführt werden kann. Es sei darauf hingewiesen, dass wir mit einem anderen Protokoll, "TS7", ähnliche oder sogar etwas bessere Ergebnisse erzielt haben. Mit TS7 ist es jedoch schwieriger, Adapter-Dimer zu eliminieren. Wir haben es daher vorgezogen, TS5 im Detail zu beschreiben, aber TS7 kann einfach die Adapter ersetzt werden. Verwenden Sie für TS7 die Adaptersequenzen 'MidRand-Like (MRL)' (Tabelle 1). Beachten Sie, dass sich hier die randomisierten Bereiche in der Mitte der Adapter befinden. Primer für Reverse Transkription und PCR hybridisieren zu den Sequenzen nach dem randomisierten Bereich im 3'-Adapter und vor dem randomisierten Bereich im 5'-Adapter. Die Sequenzierung beginnt mit dem ersten randomisierten Nukleotid im 5'-Adapter.
- 3' Adapterligation.
- Kombinieren Sie 1 l vorgefertigten 3' HD-Adapter (10 'M) mit 1 'L gereinigter kleiner RNA ('0,1-1'M) in einem 0,2 ml Mikrozentrifugenrohr. 2 min bei 72 °C in einem Thermocycler inkubieren und dann direkt auf Eis stellen.
- Fügen Sie 4 l von 50 % PEG 8000 (viskose Lösung; Pipet langsam), 1 l RNA-Ligasepuffer (10x), 1 l H2O, 1 l T4-RNA-Ligase2 abgeschnitten und 1 l RNase-Hemmer hinzu. Über Nacht bei 16 °C inkubieren.
- Eliminierung von nicht ligaierten 3' Adapter
- Fügen Sie 10 l nukleasefreies Wasser hinzu und mischen Sie es gut. Fügen Sie 6 l von 3 M NaOAc pH 5.2 oder 'Adapter Depletion Solution' aus dem Nf-Kit (Materialtabelle) hinzu und mischen Sie sie gut. Fügen Sie 40 l magnetische Reinigungsperlen (Materialtabelle) und 60 l Isopropanol hinzu und mischen Sie sie gut. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Legen Sie die Probe in ein magnetisches Rack, bis die Lösung klar erscheint. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
- 180 l frisch zubereitetes 80 % Ethanol hinzufügen. Inkubieren Sie für 30 s, dann entfernen. Achten Sie darauf, frisch zubereitetes 80% Ethanol zu verwenden und nicht mit 80% Ethanol über einen längeren Zeitraum zu brüten.
- Drehen Sie das Rohr kurz und entfernen Sie Restflüssigkeit, die sich am Boden des Brunnens gesammelt haben könnte. Lassen Sie die Perlen 2 min trocknen, dann in 22 l von 10 mM Tris pH 8 oder Resuspension Puffer aus dem Nf-Kit wieder aufhängen. 2 min inkubieren, dann die Probe magnetisieren, bis die Lösung klar erscheint.
- Fügen Sie 6 L von 3 M NaOAc pH 5.2 oder 'Adapter Depletion Solution' aus dem Nf-Kit(Materialtabelle) zu einem neuen Rohr hinzu. Übertragen Sie 20 l des Überstandes aus dem vorherigen Schritt auf dieses neue Rohr und mischen Sie durch Pipettieren. Fügen Sie 40 l magnetische Perlen und 60 l von 100% Isopropanol hinzu und mischen Sie gut durch Pipettieren. Inkubieren Sie für 5 min.
- Magnetisieren Sie die Probe, bis die Lösung klar erscheint, entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
- 180 l frisch zubereitetes 80 % Ethanol hinzufügen. Inkubieren Sie für 30 s, dann entfernen. Take pflege frisch zubereitetes 80% Ethanol zu verwenden und nicht mit 80% Ethanol für längere Zeit zu inkubieren.
- Drehen Sie das Rohr kurz und entfernen Sie Restflüssigkeit, die sich am Boden des Brunnens gesammelt haben könnte. Lassen Sie die Perlen 2 min trocknen und in 10 l nukleasefreiem Wasser wieder aufhängen. 2 min inkubieren, dann die Probe magnetisieren, bis die Lösung klar erscheint.
- Übertragen Sie 9 L Überstand in ein neues Rohr. Fügen Sie 1 L T4-RNA-Ligasepuffer (10x) und 1 l Wasser hinzu. Alternativ können Sie aus dem TS-Kit 2 L Ligase-Puffer hinzufügen.
- Ligation von 5' Adapter.
- Fügen Sie 1 L 5' HD-Adapter (10 'M; Tabelle 1) auf ein 200-L-PCR-Rohr in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel. 2 min bei 70 °C inkubieren und dann direkt auf Eis stellen.
- Fügen Sie 1 l von 10 mM ATP und 1 l T4-RNA-Ligase 1 hinzu. Gut durch sanftes Pipetieren gut mischen. Fügen Sie der 3' ligaierten RNA ab Schritt 3.2.9 3 l dieser Mischung hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren. 1 h bei 28 °C inkubieren.
- Reverse Transkription (RT)
- Übertragen Sie die 3'- und 5'-Adapter-ligattierte RNA in ein neues 200-L-PCR-Rohr (halten Sie die restlichen 8 l bei -80 °C für die spätere Verwendung, falls erforderlich). Fügen Sie 1 L RT-Primer (10 M; Tabelle 1) und mischen durch Pipettieren. 2 min bei 70 °C inkubieren und dann direkt auf Eis stellen.
- Fügen Sie die folgenden Reagenzien für RT hinzu: 2 l 5x ersten Strangpuffer, 0,5 l mit 12,5 mM dNTP-Mischung, 1 l von 100 mM DTT, 1 L RNase-Inhibitor und 1 l Reverse-Transkriptase(Materialtabelle). 1 h bei 50 °C inkubieren.
- PCR-Verstärkung
- Fügen Sie dem 12,5 l RT-Reaktionsgemisch folgende Reagenzien hinzu: 10 l PCR-Polymerase-Puffer, 2 l universelle P5-Grundierung (10 m; Tabelle 1), 2 L P7-Index-Primer (10 m; Tabelle 1), 1 l mit 12,5 mM dNTPs, 0,5 l DNA-Polymerase(Materialtabelle)und 22 l Wasser. Halten Sie die Reaktion auf Eis, bis sie verwendet wird.
- Führen Sie das folgende PCR-Programm aus: 98 °C für 30 s, 11 Zyklen (98 °C für 10 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 15 s) und 72 °C für 10 min. Halten Sie die Reaktion bei 4 °C, wenn Sie fertig sind.
HINWEIS: Bezüglich der Anzahl der PCR-Zyklen: Wir führen in der Regel 11 Zyklen durch, aber dies sollte vom Benutzer optimiert werden. Versuchen Sie, die kleinstmögliche Anzahl von PCR-Zyklen durchzuführen.
- Gelreinigung
- Führen Sie 5, 10 und 20 L PCR-Produkt auf einem nativen 6% TBE-Gel (siehe Tabelle der Materialien) zusammen mit einer geeigneten Leiter (siehe Tabelle der Materialien). Führen Sie das Gel für ca. 1 h bei 145 V (bis das Bromphenolblau den Boden erreicht; dieser Farbstoff wandert an der 65 bp Position).
- Entfernen Sie das Gel, und inkubieren Sie mit Nukleinsäure-Gel-Färbung (siehe Tabelle der Materialien) in Wasser für 10-15 min.
- Sehen Sie sich das Gel auf einem "Dark Reader"-Trans-Illuminator an (es wird dringend empfohlen, UV zu vermeiden, da dies die RNA beschädigen könnte) und schneiden Sie das Bibliotheksband bei 150 bp aus. Bereiten Sie ein System vor, um die RNA aus Gel zu lösen, wie in Schritt 1.5 beschrieben, und übertragen Sie das Gelstück in das 0,5 ml-Rohr.
- Zentrifuge in einer Mikrozentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 2 min. Entfernen Sie das 0,5 ml Rohr, das jetzt leer sein sollte.
- Fügen Sie dem 2 ml-Rohr, das das zerkleinerte Gel enthält, 300 l L Nuklease-freies Wasser hinzu und drehen Sie es mindestens 2 h bei Raumtemperatur oder bei 4 °C über Nacht.
- Die Suspension zerkleinerter Gelstücke in Wasser in eine Spinsäule und Zentrifuge für 2 min bei maximaler Geschwindigkeit übertragen.
- Fügen Sie 1 l (20 g/l) Glykogen, 30 l 3 M NaOAc und 975 l eiskaltes 100% Ethanol hinzu. Zentrifuge für 20 min bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C.
- Setzen Sie das Pellet in 20 l von 10 mM Tris pH8 wieder auf. Verwenden Sie 1 l für die Konzentrationsmessung und 1 l für die Qualitätskontrolle.
4. Datenanalyse
HINWEIS: Das unten beschriebene Datenanalyseverfahren basiert auf dem Linux-Betriebssystem Ubuntu 16.04 LTS.
- Behandlung von Rohsequenzdateien
- Laden Sie die FASTQ-Sequenzdatei(n) herunter, die während der Sequenzierungsausführung generiert wurde. Führen Sie bei Bedarf das Demultiplexing mit bcl2fastq2 (Version V2.2.18.12; ein Handbuch kann unter dem folgenden Link heruntergeladen werden: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
Verwenden Sie den folgenden Befehl:
nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway_of_Run --ignore-missing-bcl --output-dir Pathway_of_Output_Directory --barcode-mismatches 1 --aggregated-tiles AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w 16 - Entfernen Sie Adaptersequenzen mit Cutadapt19 Version 1.15. Ein Handbuch kann hier heruntergeladen werden: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
Verwenden Sie den folgenden Befehl:
Pathway_to_cutadapt/ cutadapt -a TGGAATCTCGTGCCAAGG -n 5 -O 4 -m 10 -j 0 --nextseq-trim 10 -o Output_File_Read1_cutadapt.fastq.gz Input_File_Read1.fastq.gz
Beachten Sie, dass die Sequenz im Befehl dem 3' HD-Adapter ohne die 4 zufälligen Nukleotide entspricht; diese werden daher in diesem Schritt nicht entfernt. - Verwenden Sie seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) zum Entfernen der terminalen zufälligen Nukleotide in den Sequenzierungslesevorgängen. Verwenden Sie den folgenden Befehl (Variablennamen in Fettdruck):
seqtk trimfq -b 4 -e 4 Output_File_Read1_cutadapt .fastq > Output_File_Read1 _getrimmt .fastq - Verwenden Sie den folgenden awk-Befehl, um die Sequenzen zu verwerfen, die kürzer als 10 nt sind:
awk 'BEGIN 'FS = ''t' ; OFS = "-n"-Header = 0 ; getline seq ; getline qheader ; getline qseq ; if (length(seq) >= 10) 'print header, seq, qheader, qseq'' Output_File_Read1_trimmed.fastq > Length_Filtered.fastq
- Laden Sie die FASTQ-Sequenzdatei(n) herunter, die während der Sequenzierungsausführung generiert wurde. Führen Sie bei Bedarf das Demultiplexing mit bcl2fastq2 (Version V2.2.18.12; ein Handbuch kann unter dem folgenden Link heruntergeladen werden: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
- Mapping der getrimmten Sequenzen
- Laden Sie die Datenbank, die dem Untersuchungsorganismus entspricht, von miRBase wie folgt herunter. Gehen Sie zu http://www.mirbase.org/ftp.shtml und laden Sie die Datei "mature.fa" herunter. Beachten Sie, dass die Sequenzen in RNA-Notation angegeben sind. Ersetzen Sie die U-Rückstände durch T durch den folgenden Befehl:
sed -i '/>/! s/U/T/g' mature.fa
HINWEIS: Dies ergibt eine vollständige Liste aller miRNAs in miRBase, die aus einer Vielzahl von Organismen stammen. - Wählen Sie die miRNA-Sequenzen Ihres Interessenorganismus mit dem folgenden Befehl aus:
awk 'name_of_the_organism»print; nr[NR+1]; next;; NR in nr' mature.fa > mature_name_of_the_organism_mirs.fa - Ordnen Sie die Lesevorgänge der oben erstellten Datei mit Bowtie220 (Version 2.3.0) zu, sodass keine Nichtübereinstimmungen möglich sind. Erstellen Sie zunächst einen Index für Ihre Datei mit dem folgenden Befehl:
bowtie2-build mature_name_of_the_organism_mirs.fa mature_name_of_the_organism_mirs - Richten Sie die Sequenzierungslesevorgänge an der Datenbank aus, sodass ein Lesefehler vollständig einer miRNA der Datenbank zugeordnet werden muss, ohne dass nicht übereinstimmen. Verwenden Sie zu diesem Zweck das folgende Tool:
bowtie2 -N 0 -L 10 --score-min C,0,0 --end-to-end --time -x mature_name_of_the_organism_mirs -U Length_Filtered.fastq -S Length_Filtered_ALIGNMENT.sam
HINWEIS: Die Option :-score-min C,0,0 stellt sicher, dass die Ausrichtung ohne Übereinstimmungen erfolgt. Eine Erläuterung der verschiedenen Parameter im Tool finden Sie auf folgender Website: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml - Um die Lesevorgänge zu verwerfen, die nicht ausgerichtet wurden, verwenden Sie den folgenden Befehl:
samtools-Ansicht -F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT.sam > Reads_aligned_to_Mirs.sam
HINWEIS: Als Ergebnis dieser Schritte sollten Sie nun die ausgerichteten Lesevorgänge erhalten haben, die miRNAs entsprechen.
- Laden Sie die Datenbank, die dem Untersuchungsorganismus entspricht, von miRBase wie folgt herunter. Gehen Sie zu http://www.mirbase.org/ftp.shtml und laden Sie die Datei "mature.fa" herunter. Beachten Sie, dass die Sequenzen in RNA-Notation angegeben sind. Ersetzen Sie die U-Rückstände durch T durch den folgenden Befehl:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kritische Schritte sind die Isolierung des kleinen RNA-Anteils des Startgesamt-RNA-Materials (Abbildung 3) und des gewünschten Endbibliotheksprodukts (Abbildung 4). Beide Schritte beinhalten Polyacrylamid-Gel-Reinigung; kleine RNA wird aus 15% TBE Harnstoffgelen isoliert, während die endgültigen Bibliotheken aus 6% nativen TBE-Gelen isoliert sind. Kleine rna isoliert aus Gel kann auf einem kleinen RNA Kapillarelektrophorese Chip analysiert werden (Tabelle der Materialien; Abbildung 3 B). Dies wird es dem Anwender ermöglichen, die Menge der zurückgewonnenen kleinen RNA und den Anteil der miRNA in der Zubereitung zu schätzen.
Die Gelreinigung des endgültigen Bibliotheksprodukts ist ein heikler Schritt, da eine Reihe zusätzlicher Produkte gebildet werden, die in die Nähe der gewünschten Bibliothek migrieren. Es ist wichtig, das Gel nicht zu überlasten, da dies das Risiko erhöht, die Bibliothek mit anderen Arten wie Adapterdimerzuteilen zu kontaminieren. Als Beispiel (Abbildung 4) wurden immer mehr PCR-verstärkte Bibliotheken (aus B. napus RNA) auf das Gel geladen und das Produkt, das der erwarteten Größe (150 bp) entspricht, ausgeschnitten (Abbildung 4A). Nach der Elution wurde die gereinigte Bibliothek auf einem Kapillargel-Elektrophorese-Chip überprüft; Zusätzlich zu den erwarteten 150 bp-Produkten wurde ein zunehmender Anteil einer 130 bp-Art beobachtet, die Adapterdimern entspricht, da immer mehr PCR-Produkte geladen wurden (Abbildung 4B,C).
Wir haben getestet, ob das Protokoll TS5 mit hausgemachten Reagenzien ähnlich funktioniert wie mit Reagenz aus den Kits. Zu diesem Zweck haben wir Bibliotheken aus einer Mischung aus synthetischen kleinen RNAs 1-6 vorbereitet, die jeweils ohne oder mit einer 2'-OMe-Modifikation vorhanden sind, wie in unserer vorherigen Studie12. Abbildung 5 zeigt den Anteil der Lesevorgänge, der jeder dieser zuvor erhaltenen RNAs und mit den neuen Bibliotheken entspricht, die mit Reagenzien aus den TS- und Nf-Kits oder von anderen Anbietern hergestellt wurden. Wie man sieht, wurden sehr ähnliche Ergebnisse erzielt.
Abbildung 6 zeigt einen Vergleich der Leistung des Protokolls TS5 mit dem Standard-TS-Protokoll zum Nachweis von Pflanzen (A. thaliana und B. napus) miRNAs, die 2'-OMe modifiziert sind, und von unveränderten menschlichen miRNAs. Wir haben auch den Nachweis von piRNAs getestet, 2'-OMe modifiziert in menschlichen Proben. Wie man sieht, schneidet TS5 deutlich besser ab als TS für die Erkennung von 2'-OMe RNAs, jedoch nicht für unveränderte RNAs. Aber auch für unveränderte sRNAs, auch wenn keine größere Anzahl von RNAs erkannt wird, spiegeln die erhaltenen Lesezahlen wahrscheinlich besser wahre Ausdrucksebenen mit TS5 wider als bei TS aufgrund geringerer Verzerrungsniveaus.
Abbildung 1 . Schematische Darstellung des SRNA-Bibliotheksvorbereitungsworkflows für die Illumina-Sequenzierung. Erstens werden sRNAs durch einen Gelreinigungsschritt isoliert. Hier wird der Größenbereich von miRNAs angegeben, aber je nach RNAs kann jeder andere Größenbereich ausgewählt werden. Anschließend wird ein Schritt zur Qualitätskontrolle (QC) durchgeführt, um die Qualität und Quantität der isolierten sRNA zu überprüfen. Während der Bibliotheksvorbereitung wird zunächst ein vorbewerteter (App) 3' Adapter an die sRNA gebunden. Dann wird ein 5' Adapter ligted. Anschließend wird die umgekehrte Transkription mit einem Primer durchgeführt, der den 3'-Adapter ergänzt, gefolgt von pcR-Verstärkung, bei der die Sequenzen Illumina P5, P7 und Index ('In') hinzugefügt werden. Die resultierende Bibliothek wird gelgereinigt, gefolgt von einem Qualitätskontrollschritt. Anschließend wird die Bibliothek sequenziert und die Daten analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 . Verzerrung durch sequenzabhängiges Adapter-sRNA-Co-Falten. In der Adapterligationsmischung werden Adapter in einer Weise mit sRNAs zusammengefaltet, die von der Reihenfolge des Adapters und der sRNA abhängt. So werden verschiedene sRNAs (dargestellt durch die Beispiele a, b und c; angezeigt durch verschiedene Grüntöne) mit einem bestimmten Adapter unterschiedlich kofold (der 3'-Adapter ist rot, der 5'-Adapter ist blau). Die schwarzen Pfeile zeigen Ligationsknoten an. Dies kann zu einem günstigen oder ungünstigen Kontext für ligation führen. Da RNL2 eine doppelsträngige Umgebung zu bevorzugen scheint, wird erwartet, dass 3' Ligation für RNAs a und b effizienter ist als für RNA c. Da RNL1 eine Vorliebe für eine einsträngige Region um den Ligationsknoten hat, kann die 5'-Adapterligation für RNA a am effizientesten sein, gefolgt von b und am wenigsten effizient für c. Zusammen kann dies zu einer Überdarstellung von sRNA a, einem Zwischen- Darstellung von RNA b und einer Unterrepräsentation von RNA c in der endgültigen Bibliothek, auch wenn die drei RNAs in gleicher Menge in der ursprünglichen RNA-Probe vorhanden sind. Beachten Sie, dass in ähnlicher Weise eine bestimmte sRNA beim Ändern der Adaptersequenz unterschiedlich dargestellt wird (z. B. durch Hinzufügen verschiedener Barcodes). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 . Isolierung kleiner RNA und Qualitätskontrolle. (A). Elektrophoretische Trennung von Brassica napus gesamtRNA (10 g) auf einem 15% TBE Harnstoff denaturierenden Polyacrylamidgel. Eine kleine RNA-Leiter (siehe Tabelle der Materialien) wurde als molekularer Größenmarker migriert. Nach der Migration wurde das Gel gefärbt und die RNA auf einem Trans-Illuminator visualisiert. Der Bereich von 17 bis 29 Nukleotide wurde ausgeschnitten (angezeigt durch ein rotes Rechteck) und rna wurde eluiert. (B). Die Qualität der gereinigten RNA wurde durch Kapillargelelektrophorese überprüft. Beachten Sie, dass diese Analyse Informationen über den Anteil der miRNA in der Stichprobe liefert (in diesem Fall 93 %). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 . Gelreinigung einer b. napus kleinen RNA-Bibliothek, die nach Protokoll TS5 und Qualitätskontrolle erstellt wurde. (A). Immer mehr Mengen einer PCR-verstärkten Bibliothek aus B. napus kleiner RNA wurden auf ein 6% natives TBE-Gel geladen; 2,5 l (a), 5 l (b), 10 l (c) oder 20 l (d) PCR-Produkt. Eine 50 bp Leiter wurde daneben migriert. PCR-Produkte, die an der erwarteten 150-pb-Position migriert wurden, wurden isoliert (rotes Rechteck), DNA wurde eluiert und gereinigt. (B). Qualitätskontrolle der gereinigten Bibliothek; Geldarstellung. (C). Elektropherogramm-Darstellung der gleichen Analyse. Wie man sieht, ist das 150-pb-Produkt zunehmend mit Adapter-Dimeren (130 bp) kontaminiert, da größere Mengen an PCR-Produkten auf Gel migriert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 . Protokoll TS5 funktioniert ähnlich mit Reagenzien aus den TS- und Nf-Kits oder mit Reagenzien anderer Lieferanten. Histogramme, die den Prozentsatz der Gesamtzahl der Rohlesevorgänge (vor dem Trimmen) darstellen, die RNA(OMe)1-6 mit Protokoll TS5 entsprechen, gefolgt von Reagenzien aus den TS- und Nf-Kits (blaue Balken) oder Reagenzien anderer Lieferanten (orange Balken). Zum Vergleich werden die Ergebnisse unserer vorherigen Studie durch graue Balken dargestellt. Die Gesamtzahl der Lesevorgänge entsprechend RNA1-6 (gesamt RNA) oder RNA-OMe1-6 (gesamt RNA-OMe) wird ebenfalls angezeigt. Gezeigt werden die Mittelwerte von mindestens zwei unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. Ein Teil dieser Abbildung wurde von Dard-Dascot et al, 201812geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6 . Vergleich der miRNA-Detektion des Protokolls TS5 mit der klassischen TS-Methode. (A). Der Anteil der Lesezuordnungen zu A. thaliana, B. napus oder H. sapiens miRNAs in miRBase wurde ermittelt. Wir haben auch die Lesevorgänge der menschlichen Bibliotheken piRBase für die piRNA-Erkennung zugeordnet. Beachten Sie, dass A.thaliana und B.napus miRNAs sowie humane piRNAs 2'-OMe modifiziert sind, im Gegensatz zu menschlichen miRNAs. Gezeigt werden die Mittelwerte von mindestens zwei unabhängigen Experimenten, und die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. (B). Anzahl der identifizierten miRNAs (oder piRNAs). Wir ermittelten die Anzahl der bekannten miRNAs von den verschiedenen Arten, die mit den Protokollen TS oder TS5 identifiziert wurden. Beachten Sie, dass für A. thaliana, B. napus oder H. sapiens, 427, 92 und 2588 miRNAs in miRBase bzw. registriert wurden. 0,5 Millionen Lesevorgänge aus den TS- oder TS5-Bibliotheken wurden B. napus miRNAs in miRbase zugeordnet, 1 Million Lesevorgänge wurden den A. thaliana- oder menschlichen Datenbanken zugeordnet. Gezeigt werden die Mittelwerte von mindestens zwei unabhängigen Experimenten mit Standardabweichungen, die durch Fehlerbalken dargestellt werden. Diese Zahl wurde geändert von Dard-Dascot et al, 201812. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Bezeichnung Oligonukleotid | 5' Modifikation | 3' Modifikation | Sequenz 5' bis 3' | reinigung | |||||
| 5' HD (TS5) Adapter | 5AmMC6 | [5AmMC6] GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCNrNrNrN (beachten Sie, dass es sich bei diesem Oligo um einen DNA-RNA-Chimer handelt; die drei 3' Terminal nts sind RNA) | Hplc | ||||||
| 3' HD (TS5) Adapter | phosphat | 3AmMO | [Phos]rNrNrNrNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG[3AaMO] (beachten Sie, dass es sich bei diesem Oligo um einen DNA-RNA-Chimer handelt; die vier 5' Terminal nts sind RNA) | Hplc | |||||
| 5' MRL (TS7) Adapter | 5AmMC6 | [5AmMC6] GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCNNNNrArCrGrArUrArC (beachten Sie, dass dieser Oligo ein DNA-RNA-Chimelist ist; die sieben 3' Terminal nts sind RNA) | Hplc | ||||||
| 3' MRL (TS7) Adapter | phospate | 3AmMO | [Phos] GTATCGTNNNNNNNTGGAATCTCGG[3AmMO] | Hplc | |||||
| RT-Grundierung | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | Hplc | |||||||
| Universal P5 Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | Hplc | |||||||
| P7-Index-Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGCTCTTGGCACCCGAGAATTCCA (NNNNNN = Index) | Hplc | |||||||
| Index 1: CGTGAT | |||||||||
| Index 2: ACATCG | |||||||||
| Index 3: GCCTAA | |||||||||
| Index 4: TGGTCA | |||||||||
| Index 5: CACTGT | |||||||||
| Index 6: ATTGGC | |||||||||
| Index 7: GATCTG | |||||||||
| Index 8: TCAAGT | |||||||||
| Index 9: CTGATC | |||||||||
| Index 10: AAGCTA | |||||||||
| Index 11: GTAGCC | |||||||||
| Index 12: TACAAG | |||||||||
Tabelle 1. Oligonukleotide, die mit diesem Protokoll verwendet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Vorbereitung der kleinen RNA-Bibliothek bleibt aufgrund von Verzerrungen schwierig, die hauptsächlich während der Adapterligationsschritte eingeführt werden. RNAs mit einer 2'-OMe-Modifikation an ihrem 3'-Ende wie pflanzliche miRNAs, piRNA bei Insekten, Nematoden und Säugetieren und kleine störende RNAs (siRNA) in Insekten und Pflanzen sind besonders schwer zu untersuchen, da die 2'-OMe-Modifikation 3' Adapterligation hemmt. Eine Reihe von Lösungen wurden in der Literatur vorgeschlagen, um sRNA-Bibliotheksvorbereitungsprotokolle zu verbessern, aber die meisten kommerziell erhältlichen Kits basieren immer noch auf dem klassischen TS-Protokoll, das eine starke Verzerrung aufweist. Es gibt jedoch ein paar "Low Bias"-Kits, darunter das Nf-Kit mit randomisierten Adaptern und PEG in den Ligationsreaktionen, und vor kurzem erschienen einige Kits, die Adapterligation insgesamt12vermeiden. Wir berichteten bereits, dass Nf mehr verschiedene miRNAs als das Standard-TS-Protokoll erkennt, aber das Protokoll "S" (ohne Adapterligation) hat aufgrund einer signifikanten Formation von Side-Products12relativ schlecht abgeschnitten. Überraschenderweise hatten die TS-Protokolle bei der Änderung eine empfindlichere Erkennung von 2'-OMe-sRNAs als die anderen Protokolle, jedoch nicht von normalen sRNAs. Wir haben uns hier entschieden, das TS5-Protokoll im Detail zu beschreiben, in dem die Adapter an ihren Extremitäten randomisiert werden, PEG in den Ligationsreaktionen verwendet wird und überschüssiger 3'-Adapter durch Reinigung auf Perlen eliminiert wird. Es sollte hier beachtet werden, dass ein anderes Protokoll (TS7) mit MRL-Adaptern etwas besser funktionieren kann als das TS5-Protokoll. Da es jedoch nur geringfügige Unterschiede zwischen den beiden gibt und es bei TS7 schwieriger ist, das gewünschte Bibliotheksprodukt von Adapterdimern zu trennen, haben wir es hier vorgezogen, das TS5-Protokoll im Detail zu beschreiben. Benutzer können jedoch die TS5-Adapter auf Wunsch durch TS7-Adapter ersetzen. Beachten Sie, dass diese etwas länger zu einem endgültigen Bibliotheksprodukt von 170 bp statt 150 BP führen.
Die Möglichkeit, das Protokoll TS5 oder TS7 mit "hausgemachten" Materialien durchzuführen, ermöglicht eine erhebliche Kostensenkung. Es kann jedoch zu einer größeren Qualitätsunterschiede bei hausgemachten Materialien bestehen; insbesondere hausgemachte voradenylierte 3' Adapter können aufgrund unterschiedlicher Wirkungsgrade der Voradenylierung einer variablen Qualität unterliegen. Es wird daher empfohlen, einen großen Bestand zu zuerstellen und wenn ein neuer Bestand vorbereitet wird, vergleichen Sie seine Wertentwicklung mit dem vorherigen. Dazu kann eine Kontroll-RNA-Probe verwendet werden.
Ein Nachteil der hier beschriebenen Protokolle ist die relativ starke Bildung von Nebenprodukten und die Schwierigkeit, die gewünschte Bibliothek von diesen Produkten zu trennen. Es ist darauf zu achten, dass das Acrylamid-Gel zur Reinigung nicht überlastet wird. Kürzlich wurden modifizierte Adapter entwickelt, die eine stark reduzierte Tendenz zur Bildung von Dimeren haben21. Eine 2'-OMe-Modifikation am 3'-Ende des 5'-Adapters kombiniert mit einer Methylphosphonat-Modifikation an der 5' Extremität des 3'-Adapters, die Adapterdmere effizient unterdrückt. Es wird interessant sein, solche modifizierten Adapter im hierbeschriebenen Protokoll zu testen.
Die Gelreinigungsschritte im Protokoll TS5 sind relativ arbeitsintensiv. Wenn der Einsatz modifizierter Adapter die Bildung von Adapterdimeren effizient reduziert, ist eine Gelreinigung der Endbibliothek möglicherweise nicht mehr erforderlich. Darüber hinaus existiert als Alternative zum Gelreinigungsschritt zur Isolierung kleiner RNA (Schritt 1) eine Strategie, bei der magnetische Perlen für kleine RNAs angereichert werden (https://ls.beckmancoulter.co.jp/files/appli_note/Supplemental_Protocol_for_miRNA_.pdf). Wir haben diese Methode nicht selbst verwendet, aber es lohnt sich zu testen, und wenn es gut funktioniert, könnte es das Protokoll erheblich vereinfachen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Protokoll TS5 zwar weiter verbessert werden könnte, aber besser abschneidet als kommerziell erhältliche Kits, zumindest die, die in unserer vorherigen vergleichenden Analyse für den Nachweis von 2'OMe sRNA getestet wurden. Es kann mit hausgemachten Materialien verfolgt werden, was eine erhebliche Kostensenkung ermöglicht. Für den Komfort und vielleicht konstantere Leistung können Reagenzien aus den TS- und Nf-Kits verwendet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Center for Scientific Research (CNRS), der Französischen Kommission für alternative Energien und Atomenergie (CEA) und der Universität Paris-Sud unterstützt. Alle Bibliotheksvorbereitungs-, Illumina-Sequenzierungs- und Bioinformatik-Analysen für diese Studie wurden in der I2BC Next-Generation Sequencing (NGS)-Anlage durchgeführt. Die Mitglieder der I2BC NGS-Einrichtung werden für die kritische Lektüre des Manuskripts und hilfreiche Vorschläge gewürdigt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes | |||
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
- Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
- Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
- Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
- Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
- Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
- Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).
