Summary
Vi presenterer en detaljert liten RNA bibliotek oppreisning protokoll med mindre bias enn standard metoder og en økt følsomhet for 2 '-O-methyl RNAs. Denne protokollen kan følges ved hjelp av hjemmelagde reagenser for å spare kostnader eller bruke kits for enkelhets skyld.
Abstract
Studiet av små RNAs (sRNAs) av neste generasjons sekvensering (NGS) er utfordret av bias problemer under biblioteket forberedelse. Adskillige typer av sRNA som plante microRNAs (miRNAs) befordre en 2 '-O-methyl (2 '-OMe) modifisering på deres 3 ' Terminal nukleotid. Denne endringen legger til en annen vanskelighet som hemmer 3 ' adapter ligation. Vi har tidligere demonstrert at modifiserte versjoner av ' TruSeq (TS) ' protokoll har mindre bias og en forbedret påvisning av 2 '-OMe RNAs. Her beskriver vi i detalj protokollen ' TS5 ', som viste den beste samlede ytelsen. TS5 kan følges enten med hjemmelagde reagenser eller reagenser fra TS-settet, med samme ytelse.
Introduction
Små RNAs (sRNAs) er involvert i kontroll av et mangfold av biologiske prosesser1. Eukaryote regulatoriske sRNAs er vanligvis mellom 20 og 30 NT i størrelse; de tre hovedtyper er microRNAs (miRNA), piwi-interaksjon RNAs (piRNA) og små forstyrrende RNAs (siRNA). Avvikende miRNA uttrykks nivåer har vært innblandet i en rekke sykdommer2. Dette understreker viktigheten av miRNAs i helse og sykdom og kravet om nøyaktig, kvantitativ forskning verktøy for å oppdage sRNAs generelt.
Neste generasjons sekvensering (NGS) er en mye brukt metode for å studere sRNAs. Hovedfordelene med NGS sammenlignet med andre tilnærminger, slik som kvantitativ PCR eller Microarray teknikker (qPCR), er at den ikke trenger a priori kjennskap til sRNA sekvenser og kan derfor brukes til å oppdage romanen RNAs, og i tillegg lider det mindre av bakgrunns signal og metning effekter. Videre, den kanne merker enkelt nukleotid forskjellene og har en høyere produksjon enn Microarrays. Men NGS har også noen ulemper; kostnaden for en sekvensering kjøre fortsatt relativt høy og flertrinnsprosessen som kreves for å konvertere et eksempel til et bibliotek for sekvensering kan innføre skjevheter. I en typisk sRNA bibliotek Forberedelses prosess, en 3 ' adapter er først ligaturer til sRNA (ofte gel-renset fra total RNA) ved hjelp av en avkortet versjon av RNA ligase 2 (RNL2) og en preadenylated 3 ' adapter (figur 1) i fravær av ATP. Dette øker effektiviteten til sRNA-adapter-ligation og reduserer dannelsen av side reaksjoner som sRNA circularization eller concatemerization. Deretter blir en 5-adapter ligaturer av RNA ligase 1 (RNL1), etterfulgt av omvendt transkripsjon (RT) og PCR forsterkning. Alle disse trinnene kan innføre bias3,4. Derfor kan ikke lese tall gjenspeile faktiske sRNA uttrykks nivåer som fører til kunstige, metode avhengige uttrykks mønstre. Spesifikke sRNAs kan være enten over-eller underrepresentert i et bibliotek, og sterkt underrepresentert sRNAs kan unnslippe deteksjon. Situasjonen er spesielt komplisert med anlegget miRNAs, siRNAs i insekter og planter, og piRNAs i insekter, nematoder og pattedyr, der 3 ' Terminal nukleotid har en 2 '-O-metyl (2 '-OMe) modifikasjon1. Denne endringen hemmer sterkt 3 ' adapter ligation5, noe som gjør biblioteket forberedelse for disse typer RNA en vanskelig oppgave.
Tidligere arbeid demonstrerte at adapter ligation introduserer alvorlige bias, på grunn av RNA sekvens/struktur effekter6,7,8,9,10,11. Trinn nedstrøms for adapter ligation som omvendt transkripsjon og PCR ikke signifikant bidra til bias6,11,12. Ligation bias er sannsynligvis på grunn av det faktum at adapter molekyler med en gitt sekvens vil samhandle med sRNA molekyler i reaksjonsblandingen å danne co-folder, som kan enten føre til gunstige eller ugunstige konfigurasjoner for ligation (figur 2). Data fra Sorefan et al7 tyder på at RNL1 foretrekker en enkelt strandet sammenheng, mens RNL2 foretrekker en dobbel tråd for ligation. Det faktum at adapter/sRNA co-fold strukturer bestemmes av bestemte kortet og sRNA sekvenser forklarer hvorfor bestemte sRNA er over-eller underrepresentert med et gitt adaptersett. Det er også viktig å merke seg at innenfor en serie sRNA biblioteker som skal sammenlignes, bør de samme adapter sekvensene brukes. Faktisk har det tidligere blitt observert at skiftende adaptere ved innføringen av ulike strekkode sekvenser endrer miRNA profiler i sekvensering biblioteker9,13.
Tilfeldiggjøring av kort sekvenser i nærheten av ligation knutepunkt reduserer sannsynligvis disse skjevheter. Sorefan og kolleger7 brukte adaptere med 4 tilfeldige nukleotider på sine ekstremiteter, utpekt "High Definition" (HD) adaptere, og viste at bruken av disse kortene føre til biblioteker som bedre reflekterer sanne sRNA uttrykks nivåer. Nyere arbeid bekreftet disse observasjonene og avslørte at den randomiserte regionen ikke trenger å være ved siden av ligation Junction11. Denne romanen type adaptere ble kalt "MidRand" adaptere. Sammen viser disse resultatene at forbedret adapter design kan redusere bias.
I stedet for å endre kortene, kan bias undertrykkes gjennom optimalisering av reaksjonsbetingelser. Polyetylen glykol (PEG), en makro molekylære trengsel agent kjent for å øke ligation effektivitet14, har vist å redusere bias15,16. Basert på disse resultatene, flere "lav bias" kits dukket opp på markedet. Disse inkluderer kits som bruker PEG i ligation reaksjoner, enten i kombinasjon med klassiske adaptere eller HD-adaptere. Andre kits unngå ligation helt, og bruke 3 ' polyadenylation og mal bytte for 3 ' og 5 ' adapter tillegg, henholdsvis12. I enda en strategi, 3 ' adapter ligation etterfølges av en circularization trinn, og dermed Utelat 5 ' adapter ligation17.
I en tidligere studie, søkte vi etter en sRNA bibliotek forberedelse protokoll med lavest mulige nivåer av bias og den beste oppdagelsen av 2 '-OMe RNAs12. Vi testet noen av de ovenfor nevnte "lav bias" kits, som hadde en bedre oppdagelse av 2 '-OMe RNAs enn standardprotokollen (TS). Overraskende imidlertid, ved modifisering (bruk av randomiserte adaptere, PEG i ligation reaksjoner og fjerning av overflødig 3 ' adapter ved rensing) sistnevnte bedre resultater enn de andre protokollene for påvisning av 2 '-OMe RNAs. Her beskriver vi i detalj en protokoll basert på TS protokollen, ' TS5 ', som hadde den beste generelle oppdagelsen av 2 '-OMe RNAs. Protokollen kan følges ved hjelp av reagenser fra TS-settet og én reagens fra "NF"-settet, eller for å spare penger ved å bruke hjemmelagde reagenser, med lik ytelse. Vi gir også en detaljert protokoll for rensing av sRNA fra total RNA og utarbeidelse av preadenylated 3 ' adapter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. isolering av små RNAs
- Trekk ut total RNA ved hjelp av fenol-baserte reagenser eller en annen metode. Kontroller at RNA-en er av god kvalitet.
- Pre-Run en 15% TBE-urea gel (se tabell over materialer) for 15 min på 200 V.
- Mens gelen er pre-running, bland 5-20 μg av total RNA i et 5-15 μL volum med et likt volum av formamid lasting fargestoff (se tabell av materialer; 95% deionisert formamid, 0,025% bromophenol blå, 0,025% xylen cyanol, 5 mm EDTA pH 8) i en 200 μL PCR tube. På samme måte, bland 10 μL (200 ng) av liten-RNA stigen (se tabell over materialer) med et likt volum av formamid lasting fargestoff. Ruge i 5 min ved 65 ° c i en thermocycler med oppvarmet lokk, og plasser rørene umiddelbart på isen.
- Last stigen og prøven på samme gel med minst ett kjørefelt mellom dem og kjøre på 200 V til bromophenol blå (mørk blå) har migrert omtrent to tredjedel av gel lengde (ca 40 min).
- Klargjør et system for å eluere RNA-en fra gelen slik: punktering av bunnen av et nuklease 0,5 mL mikro sentrifugerør med en 21-gauge nål. Plasser punktert 0,5 mL rør i et nuklease 2 mL mikro sentrifugerør.
- Fjern gelen og ruge ved romtemperatur med 3 μL nukleinsyre yre gel beis (10 000 x konsentrat; se tabell over materialer) i 30 ml vann for 10-15 min.
- Vis gelen på en "Dark Reader" trans-belysning (det anbefales på det sterkeste å unngå UV som dette kan skade RNA) og kutte ut prøven RNA mellom 17 NT og de 29 NT stigen band. Overfør gel-stykket til 0,5 mL slangen fra trinn 1,5.
- Sentrifuger 0,5 mL rør i 2 mL rør i en mikro sentrifuge med maksimal hastighet i 2 min. Fjern 0,5 mL røret, som skal være tomt nå.
- Tilsett 300 μL av nuklease-fri 0,3 M NaCl til 2 mL rør som inneholder knust gel og roter i minst 2 timer ved romtemperatur eller ved 4 ° c over natten (16 h).
- Overfør suspensjonen av knuste gel brikker til en spin kolonne (se tabell over materialer) og sentrifuger for 2 min med maksimal hastighet i en mikro sentrifuge.
- Tilsett 1 μL (20 μg/μL) av glykogen (se tabell over materialer) og 950 μL av romtemperatur 100% etanol. Ruge i minst 30 min ved-80 ° c.
- Sentrifuger for 20 min med maksimal hastighet i en mikro sentrifuge ved 4 ° c. Fjern supernatanten, vask pellet med 800 μL av kaldt 80% etanol. Sentrifuger igjen i 5 min. ved 4 ° c, og Fjern alle supernatanten forsiktig. Resuspend RNA pellet i 15 μL av nuklease fritt vann. Vanligvis bør ~ 5-20 ng av liten RNA gjenopprettes, avhengig av mengden input total RNA (~ 1 ng av liten RNA per 1 μg av input total RNA).
- Anbefalt ekstra trinn: Kontroller mengden og kvaliteten på gjenopprettede sRNA (f.eks. ved kapillær gel-elektroforese ved hjelp av et lite RNA-sett; se tabell over materialer).
2. utarbeidelse av preadenylated 3 ' HD-adapter
Merk: Preadenylation av 3 ' HD adapter ble gjort på en måte som ligner på protokollen beskrevet av Chen et al18. Merk at preadenylated adapter kan bestilles direkte (/5rApp/modifikasjon), men dette er ganske dyrt.
- Order 5 ' fosforylert, 3 ' blokkert 3 ' HD adapter oligonukleotid. Se tabell 1 for sekvenser og modifikasjoner. Merk at ' 3AmMO ' er en 3 ' amino spesialgruppe, de fleste leverandører kan produsere oligonukleotid med denne endringen. Fortynne i nuklease fritt vann til 100 μM.
- Sett opp en 100 μL reaksjon som inneholder følgende reagenser: 10 μL av oligo (100 μM), 10 μL av T4 RNA ligase buffer (10x), 10 μL av ATP (10 mM), 40 μL av 50% PEG8000, 5 μL av T4 RNA ligase 1 (50 enheter), 25 μL av nuklease vann. Ruge over natten ved 20 ° c.
- Utfør en klassisk fenol-kloroform ekstraksjon av preadenylated oligonukleotid etterfulgt av etanol nedbør. Tilsett 100 μL av syre (pH 4,5) fenol: kloroform og Vortex. Spin for 5 min ved romtemperatur, maksimal hastighet. Overfør nøye 90 μL av den øvre fase til et nytt rør; Tilsett 10 μL av 3 M natrium acetate pH 5,2, 1 μL av ultra-rent glykogen og 250 μL av kaldt 100% etanol.
- Oppbevares ved-20 ° c i minst 30 min. sentrifuger for 30 min ved 4 ° c maksimal hastighet. Fjern supernatanten, vask pellet en gang med 500 μL kaldt 80% etanol. Som et alternativ til kloroform ekstraksjon og etanol utfelling, kan et nukleotid fjernings sett brukes (se tabell over materialer). Resuspend i 25 μL vann.
- Mål konsentrasjonen av adapteren ved hjelp av et sett for spesifikk påvisning av enkelt-strandet DNA (se tabell over materialer). Fortynne til 80 ng/μL (10 μM).
- Anbefalt ekstra trinn: Kontroller effekten av preadenylation ved å migrere 1 μL av 10 μM-adapter på en 15% TBE-urea-gel (tabell av materialer) sammen med ubehandlet oligonukleotid. Den preadenylated adapteren bør migrere litt tregere enn ubehandlet oligonukleotid. Hvis ønskelig, kan preadenylated adapteren være gel-renset; som beskrevet ovenfor (trinn 1,2-1.12).
3. utarbeidelse av bibliotek-protokoll TS5
Merk: Vi presenterer her den modifiserte TS-protokollen "TS5" som vi beskrev tidligere12 , og som kan utføres enten med reagenser fra settet eller med selvbetjente reagenser. Det bør bemerkes at vi fikk lignende eller enda litt bedre resultater med en annen protokoll, ' TS7 '. Men med TS7 er det vanskeligere å eliminere adapter dimers. Vi har derfor foretrukket å beskrive TS5 i detalj, men TS7 kan følges ved å bare bytte ut adapterne. For TS7 bruk "MidRand-like (MRL)" adapter sekvenser (tabell 1). Merk at her de randomiserte regionene er i midten av adaptere. Primere for omvendt transkripsjon og PCR vil hybridize til sekvenser nedstrøms av randomiserte regionen i 3 ' adapter og oppstrøms av randomisert regionen i 5 ' adapter. Sekvensering vil starte fra den første randomiserte nukleotid i 5 ' adapter.
- 3 ' adapter ligation.
- Kombiner 1 μL av preadenylated 3 ' HD-adapter (10 μM) med 1 μL renset liten RNA (~ 0.1-1 μM) i et 0,2 mL mikro sentrifugerør. Ruge for 2 min ved 72 ° c i en Thermo cycler, deretter satt direkte på isen.
- Tilsett 4 μL av 50% PEG 8000 (viskøs oppløsning; Pipet langsomt), 1 μL av RNA ligase buffer (10x), 1 μL av H2O, 1 μL av T4 RNA ligase2 avkortet, og 1 μL av RNase inhibitor. Ruge over natten ved 16 ° c.
- Eliminering av unligated 3 ' adapter
- Tilsett 10 μL av nuklease vann og bland godt. Tilsett 6 μL av 3 M NaOAc pH 5,2 eller "adapter tømming Solution" fra NF Kit (tabell over materialer) og bland godt. Tilsett 40 μL av magnetiske rensing perler (tabell av materialer) og 60 μL av isopropanol og bland godt. Ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
- Sett prøven i en magnetisk rack til løsningen vises klar. Fjern og kast supernatanten.
- Tilsett 180 μL av ferskt tilberedte 80% etanol. Ruge for ~ 30 s, og deretter fjerne. Pass på å bruke ferskt forberedt 80% etanol og ikke ruge med 80% etanol i lengre perioder.
- Snurr kort på røret og fjern rester av væske som kan ha samlet på bunnen av brønnen. La perlene tørke i 2 min, deretter resuspend i 22 μL av 10 mM Tris pH 8 eller blanding buffer fra NF Kit. Ruge for 2 min, deretter magnetize prøven til løsningen vises klar.
- Tilsett 6 μL av 3 M NaOAc pH 5,2 eller "adapter tømming Solution" fra NF Kit (tabell av materialer) til et nytt rør. Overfør 20 μL av supernatanten fra forrige trinn til dette nye røret og bland med pipettering. Tilsett 40 μL av magnetiske perler og 60 μL av 100% isopropanol og bland godt med pipettering. Ruge i 5 min.
- Magnetize prøven til løsningen vises tydelig, og fjern og kast deretter supernatanten.
- Tilsett 180 μL av ferskt tilberedte 80% etanol. Ruge for ~ 30 s, og deretter fjerne. TAke Care å bruke ferskt forberedt 80% etanol og ikke ruge for med 80% etanol i lengre perioder.
- Snurr kort på røret og fjern rester av væske som kan ha samlet på bunnen av brønnen. La perlene tørke i 2 min. og resuspend i 10 μL av nuklease vann. Ruge for 2 min, deretter magnetize prøven til løsningen vises klar.
- Overføring 9 μL av supernatanten til et nytt rør. Tilsett 1 μL av T4 RNA ligase buffer (10x) og 1 μL vann. Du kan også legge til 2 μL ligase buffer fra TS-settet.
- Ligation av 5 ' adapter.
- Tilsett 1 μL av 5 ' HD-adapter (10 μM; Tabell 1) til en 200 μL PCR slange i en Thermo cycler med oppvarmet lokk. Ruge for 2 min ved 70 ° c, deretter sette røret direkte på isen.
- Tilsett 1 μL av 10 mM ATP og 1 μL av T4 RNA ligase 1. Bland godt med forsiktig pipettering. Tilsett 3 μL av denne blandingen i 3 ' ligaturer RNA fra trinn 3.2.9 og bland med pipettering. Ruge til 1 time ved 28 ° c.
- Omvendt transkripsjon (RT)
- Overføring 6 μL av 3 ' og 5-adapter ligaturer RNA til en ny 200 μL PCR-slange (Behold de resterende ~ 8 μL ved-80 ° c for senere bruk om nødvendig). Tilsett 1 μL av RT-primer (10 μM; Tabell 1) og bland med pipettering. Ruge for 2 min ved 70 ° c, deretter sette røret direkte på isen.
- Legg til følgende reagenser for RT: 2 μL av 5x første tråd buffer, 0,5 μL av 12,5 mM dNTP mix, 1 μL av 100 mM DTT, 1 μL av RNase-hemmere og 1 μL av omvendt transkriptase (tabell over materialer). Ruge for 1 t ved 50 ° c.
- PCR forsterkning
- Tilsett følgende reagenser til 12,5 μL av RT reaksjons blanding: 10 μL av PCR polymerase buffer, 2 μL av universell P5 primer (10 μM; Tabell 1), 2 ΜL av P7-index primer (10 μM; Tabell 1), 1 μL av 12,5 mm dNTPs, 0,5 ΜL av DNA-polymerase (tabell over materialer) og 22 μL vann. Hold reaksjonen på isen til bruk.
- Kjør følgende PCR-program: 98 ° c i 30 s, 11 sykluser (98 ° c i 10 s, 60 ° c for 30 s og 72 ° c for 15 s) og 72 ° c i 10 min. Hold reaksjonen ved 4 ° c når du er ferdig.
Merk: når det gjelder antall PCR-sykluser: Vi utfører vanligvis 11 sykluser, men dette bør optimaliseres av brukeren. Prøv å utføre minst mulig antall PCR-sykluser.
- Gel rensing
- Kjør 5, 10 og 20 μL av PCR-produkt på en innfødt 6% TBE gel (se tabell over materialer) sammen med en passende stige (se tabell over materialer). Kjør gel for ca 1 t på 145 V (inntil bromophenol blå når bunnen, dette fargestoff migrerer på 65 BP posisjon).
- Fjern gelen, og ruge med nukleinsyre syre beis (se tabell over materialer) i vann i 10-15 min.
- Vis gelen på en "Dark Reader" trans-belysning (det anbefales på det sterkeste å unngå UV som dette kan skade RNA) og klipp ut biblioteket bandet på 150 BP. klargjør et system for å eluere RNA-en fra gelen som beskrevet i trinn 1,5, og Overfør gel-brikken til 0,5 mL-slangen.
- Sentrifuger i en mikro sentrifuge med maksimal hastighet i 2 min. Fjern 0,5 mL røret, som skal være tomt nå.
- Tilsett 300 μL av nuklease vann til 2 mL røret som inneholder den knuste gelen og roter i minst 2 timer ved romtemperatur eller ved 4 ° c over natten.
- Overfør suspensjonen av knuste gel brikker i vann til en spin kolonne og sentrifuger for 2 min ved maksimal hastighet.
- Tilsett 1 μL av (20 μg/μL) glykogen, 30 μL av 3 M NaOAc og 975 μL av iskald 100% etanol. Sentrifuger for 20 min ved maks hastighet ved 4 ° c.
- Resuspend pellet i 20 μL av 10 mM Tris pH8. Bruk 1 μL til konsentrasjons måling og 1 μL for kvalitetskontroll.
4. data analyse
Merk: dataanalyse prosedyren beskrevet nedenfor er basert på Linux operativsystem Ubuntu 16,04 LTS.
- Behandling av rå sekvens filer
- Last ned FASTQ-sekvens-filen (e) som genereres under kjøring av sekvensering. Om nødvendig, Utfør demultiplexing med bcl2fastq2 (versjon V 2.2.18.12; en manual kan lastes ned fra følgende link: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
Bruk det fulgte kommandere:
nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq--runfolder-dir Pathway_of_Run --Ignorer-mangler-BCL--output-dir Pathway_of_Output_Directory --strekkode-uoverensstemmelser 1--aggregert-fliser Auto-r 16-d 16-p 16-w 16 - Fjern adapter sekvenser med Cutadapt19 versjon 1,15. En manual kan lastes ned her: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
Bruk det fulgte kommandere:
Pathway_to_cutadapt/ cutadapt-en TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-n 5-O 4-m 10-j 0--nextseq-trim 10-O Output_File_Read1_cutadapt. Fastq. gz Input_File_Read1. fastq. gz
Note det rekken inne kommandoen korresponderer å det 3 ' HD adapter uten det 4 tilfeldig nukleotider; disse vil derfor ikke bli fjernet i løpet av dette trinnet. - Bruk seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) for fjerning av Terminal tilfeldig nukleotider i sekvensering leser. Bruk følgende kommando (variabelnavn i fet skrift):
seqtk trimfq-b 4-e 4 Output_File_Read1_cutadapt . fastq > Output_File_Read1 _trimmed . fastq - Bruk følgende AWK-kommando for å forkaste sekvensene som er kortere enn 10 NT:
AWK ' BEGIN {FS = "\t"; OFS = "\n"} {header = $0; getline SEQ; getline qheader; getline qseq; hvis (lengde (SEQ) > = 10) {utskrifts hode, SEQ, qheader, qseq}} ' Output_File_Read1_Trimmed. fastq > Length_Filtered. fastq
- Last ned FASTQ-sekvens-filen (e) som genereres under kjøring av sekvensering. Om nødvendig, Utfør demultiplexing med bcl2fastq2 (versjon V 2.2.18.12; en manual kan lastes ned fra følgende link: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
- Kartlegging av trimmet sekvenser
- Last ned databasen tilsvarende til organismen av studien fra miRBase som følger. Gå til http://www.mirbase.org/ftp.shtml og laste ned ' eldre. FA ' fil. Legg merke til at sekvensene er angitt i RNA-notasjon. Erstatt U rester av T med følgende kommando:
SED-i '/^ >/! s/U/T/g ' eldre. FA
Merk: Dette vil gi en fullstendig liste over alle miRNAs i miRBase, som stammer fra en rekke organismer. - Velg den miRNA sekvenser av din organisme av interesse med følgende kommando:
AWK 'name_of_the_organism{utskrift; NR [nr + 1]; neste}; NR i nr ' moden. FA > mature_name_of_the_organism_mirer. FA - Kart det leser å det over-skapt arkiv benytter Bowtie220 (versjon 2.3.0) tillater nei uoverensstemmelser. Først bygger du en indeks for filen med følgende kommando:
bowtie2-bygge mature_name_of_the_organism_mirer. FA mature_name_of_the_organism_mirer - Juster sekvensering leser til databasen, som krever at en leser kart helt til en miRNA av databasen, uten uoverensstemmelser. For dette formål bruker du følgende verktøy:
bowtie2-N 0-L 10--score-min C, 0, 0--ende-til-ende--tid-x mature_name_of_the_organism_Mirer-U Length_Filtered. fastq-S Length_Filtered_ALIGNMENT. Sam
Merk: alternativet:--score-min C, 0, 0 sikrer at justeringen er uten uoverensstemmelser. For en forklaring av de ulike parametrene i verktøyet, kan du gå til følgende nettsted: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml - Hvis du vil forkaste leser som ikke er justert, bruker du følgende kommando:
samtools utsikt-F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT. Sam > Reads_aligned_to_Mirs. Sam
Merk: som et resultat av disse trinnene, skal du nå ha fått justert leser, tilsvarende miRNAs.
- Last ned databasen tilsvarende til organismen av studien fra miRBase som følger. Gå til http://www.mirbase.org/ftp.shtml og laste ned ' eldre. FA ' fil. Legg merke til at sekvensene er angitt i RNA-notasjon. Erstatt U rester av T med følgende kommando:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kritiske trinn er isolering av den lille RNA-fraksjonen av Start totalt RNA-materiale (Figur 3) og det ønskede endelige bibliotek produktet (Figur 4). Begge trinnene innebære polyakrylamid gel rensing; liten RNA er isolert fra 15% TBE urea gels, mens de endelige bibliotekene er isolert fra 6% native TBE gels. Liten RNA isolert fra gel kan analyseres på en liten RNA kapillær elektroforese chip (tabell av materialer; Figur 3 B). Dette vil tillate brukere å anslå mengden av små RNA utvinnes og andelen av miRNA i forberedelsene.
Gel rensing av det endelige biblioteket produktet er et delikat skritt som en rekke ekstra produkter er dannet som migrerer nær ønsket bibliotek. Det er viktig å ikke overbelaste gelen da dette vil øke risikoen for å forurense biblioteket med andre arter som adapter dimers. Som et eksempel (Figur 4), ble økende mengder av PCR-forsterket bibliotek (fra B. napus RNA) lastet på gelen og produktet tilsvarende den forventede størrelsen (150 BP) ble kuttet ut (Figur 4A). Etter eluering ble renset biblioteket sjekket på en kapillær gel elektroforese chip; i tillegg til forventet 150 BP produkt, en økende andel av en 130 BP arter, tilsvarende adapter dimers ble observert som økende mengder PCR produktet ble lastet (Figur 4B, C).
Vi har testet om protokoll TS5 utfører på samme måte med hjemmelagde reagenser som med reagens fra settene. For dette formål, forberedte vi bibliotekene fra en blanding av syntetiske små RNAs 1-6, hver til stede uten eller med en 2 '-OMe modifikasjon, som gjort i vår forrige studie12. Figur 5 viser andelen av leser som tilsvarer hver av disse RNAs innhentet tidligere, og med de nye bibliotekene gjort ved hjelp av reagenser fra TS og NF kits eller fra andre leverandører. Som det kan sees, svært like resultater ble innhentet.
Figur 6 viser en sammenligning av ytelsen til protokollen TS5 med standard TS protokollen for påvisning av anlegget (a. thaliana og B. napus) miRNAs, som er 2 '-OMe endret, og av uendret menneskelig miRNAs. Vi testet også oppdagelsen av piRNAs, 2 '-OMe modifisert i menneskelige prøver. Som det kan sees, TS5 utfører betydelig bedre enn TS for påvisning av 2 '-OMe RNAs men ikke for uendret RNAs. Men også for uendret sRNAs, selv om ikke et større antall RNAs oppdages, den oppnådde lese tall trolig bedre gjenspeile sanne uttrykk nivåer med TS5 enn med TS grunn av lavere nivåer av bias.
Figur 1 . Skjematisk representasjon av arbeidsflyten for sRNA-biblioteket for Illumina-sekvensering. Først sRNAs er isolert av en gel rensing trinn. Her angis størrelsesområdet miRNAs, men alle andre størrelses områder kan velges, avhengig av RNAs av interesse. En kvalitetskontroll (QC) trinn blir deretter utført for å kontrollere kvaliteten og mengden av isolerte sRNA. Under klargjøring av biblioteket er et preadenylated (App) 3-kort først ligaturer til sRNA. Deretter, en 5 ' adapter er ligaturer. Senere omvendt transkripsjon utføres ved hjelp av en primer komplementær til 3 ' adapter, etterfulgt av PCR forsterkning, der Illumina P5, P7, og indeksen (' in ') sekvenser er lagt til. Den resulterende biblioteket er gel renset, etterfulgt av en kvalitetskontroll trinn. Deretter er biblioteket sekvensielt, og dataene analyseres. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Bias skyldes sekvens avhengig adapter-sRNA co-folding. I kort ligation blanding vil adaptere cofold med sRNAs på en måte som avhenger av sekvensen av kortet og sRNA. Således, annerledes sRNAs (belyst av eksempler en, b, og c; angitt av annerledes skyggen av grønn) ville cofold annerledes med en gitt adapter (det 3 ' adapter er angitt inne rød, det 5 ' adapter er angitt inne blåfarge). De svarte pilene angir ligation veikryss. Dette kan føre til en gunstig eller ugunstig kontekst for ligation. Som RNL2 ser ut til å foretrekke en dobbel strandet miljø, 3 ' ligation forventes å være mer effektiv for RNAs a og b enn for RNA c. Med RNL1 å ha en preferanse for en enkelt strandet område rundt ligation krysset, 5 ' adapter ligation kan være mest effektive for RNA a, etterfulgt av b og minst effektiv for c. sammen kan dette resultere i en overrepresentasjon av sRNA a, en mellomliggende representasjon av RNA b og en underrepresentation av RNA c i det endelige biblioteket, selv om de tre RNAs er til stede ved like mengder i den opprinnelige RNA-prøven. Legg merke til at på samme måte vil en gitt sRNA representeres annerledes når du endrer kort sekvensen (f.eks. ved å legge til forskjellige strekkoder). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Isolering av liten RNA og kvalitetskontroll. (A). Elektroforetiske separasjon av Brassica NAPUS total RNA (10 μg) på en 15% TBE urea denaturering polyakrylamid gel. En liten RNA stige (se tabell over materialer) ble migrert sammen som en molekylær størrelse markør. Etter migrasjon ble gelen flekkete og RNA-en ble så på som en trans-lampe. Regionen fra 17 til 29 nukleotider ble kuttet ut (indikert med et rødt rektangel) og RNA ble eluert. (B). kvaliteten på renset RNA ble kontrollert av kapillær gel elektroforese. Merk at denne analysen gir informasjon om andelen av miRNA i utvalget (93% i dette tilfellet). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Gel rensing av et B. napus lite RNA-bibliotek utarbeidet etter protokoll TS5 og kvalitetskontroll. (A). økende mengder av en PCR forsterket bibliotek fra B. NAPUS liten RNA ble lastet på en 6% innfødt TBE gel; 2,5 μL (a), 5 μL (b), 10 μL (c) eller 20 μL (d) PCR-produkt. En 50 BP stigen ble migrert sammen. PCR-produkter som migrerer på forventet 150 PB posisjon var isolert (rødt rektangel), DNA ble eluert og renset. (B). kvalitetskontroll av renset biblioteket; og gel representasjon. (C). elektroferogrammet representasjon av samme analyse. Som man kan se, er 150 PB produktet i økende grad forurenset med adapter dimers (~ 130 BP) som større mengder PCR-produkt er migrert på gel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Protokoll TS5 utfører på samme måte med reagenser fra TS-og NF-settene eller med reagenser fra andre leverandører. Histogrammer som representerer prosentandelen av det totale antallet rådata som leses (før trimming) som TILSVARER RNA (OMe) 1-6 med protokoll TS5, etterfulgt av reagenser i TS-og NF-settene (blå stolper) eller reagenser fra andre leverandører (oransje stolper). Til sammenligning er resultatene fra vår tidligere studie vist av grå søyler. Det totale antallet leser som tilsvarer RNA1-6 (Total RNA) eller RNA-OMe1-6 (totalt RNA-OMe) vises også. Vist er gjennomsnittet verdier av minst to uavhengige eksperimenter. Feilfelt representerer standardavvik. En del av dette tallet er endret fra dard-Dascot et al, 201812Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Sammenligning av miRNA deteksjon av protokollen TS5 med den klassiske TS metoden. (A). andelen leser tilordning til A. thaliana, B. napus, eller H. sapiens miRNAs i miRBase ble bestemt. Vi har også kartlagt leser av den menneskelige bibliotekene til piRBase for piRNA deteksjon. Merk at A. thaliana og B. napus MiRNAs, samt menneskelig piRNAs er 2 '-OMe endret, i motsetning til menneskelig miRNAs. Vist er gjennomsnittet verdier av minst to uavhengige eksperimenter og feilfeltene representerer standardavvik. (B). antall miRNAs (eller piRNAs) identifisert. Vi bestemte antall kjente miRNAs fra de ulike artene identifisert med protokoller TS eller TS5. Merk at for A. thaliana, B. Napus, eller H. sapiens, 427, 92 og 2588 MiRNAs er registrert i miRBase, henholdsvis. 500 000 leser fra TS eller TS5 bibliotekene ble tilordnet B. napus MiRNAs i miRbase, 1 000 000 leser ble tilordnet til A. thaliana eller menneskelige databaser. Vist er gjennomsnittet verdier av minst to uavhengige eksperimenter med standardavvik representert ved feilfelt. Dette tallet er endret fra dard-Dascot et al, 201812. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Navn oligonukleotid | 5 ' modifikasjon | 3 ' modifikasjon | sekvens 5 ' til 3 ' | Rensing | |||||
| 5-tommers HD-adapter (TS5) | 5AmMC6 | [5AmMC6] GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCNrNrNrN (Merk at denne oligo er en DNA-RNA-chimeric; de tre 3 ' Terminal NTS er RNA) | HPLC | ||||||
| 3-tommers HD-adapter (TS5) | Fosfat | 3AmMO | [Phos] rNrNrNrNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG [3AaMO] (Merk at dette oligo er en DNA-RNA-chimeric, de fire 5 ' Terminal NTS er RNA) | HPLC | |||||
| 5-MRL (TS7)-adapter | 5AmMC6 | [5AmMC6] GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCNNNNrArCrGrArUrArC (Merk at denne oligo er en DNA-RNA-chimeric; de syv 3 ' Terminal NTS er RNA) | HPLC | ||||||
| 3-MRL (TS7)-adapter | phospate | 3AmMO | Phos GTATCGTNNNNNNTGGAATTCTCGG[3AmMO] | HPLC | |||||
| RT primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | HPLC | |||||||
| Universell P5 primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | HPLC | |||||||
| P7-index primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA (NNNNNN = indeks) | HPLC | |||||||
| indeks 1: CGTGAT | |||||||||
| indeks 2: ACATCG | |||||||||
| indeks 3: GCCTAA | |||||||||
| indeks 4: TGGTCA | |||||||||
| indeks 5: CACTGT | |||||||||
| indeks 6: ATTGGC | |||||||||
| indeks 7: GATCTG | |||||||||
| indeks 8: TCAAGT | |||||||||
| indeks 9: CTGATC | |||||||||
| indeks 10: AAGCTA | |||||||||
| indeks 11: GTAGCC | |||||||||
| indeks 12: TACAAG | |||||||||
Tabell 1. Oligonukleotider brukt med denne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Liten RNA biblioteket forberedelse er fortsatt utfordrende på grunn av bias, hovedsakelig innført under adapter ligation trinn. RNAs med en 2 '-OMe modifikasjon på deres 3 ' end som plante miRNAs, piRNA i insekter, nematoder og pattedyr, og små forstyrrende RNAs (siRNA) i insekter og planter er spesielt vanskelig å studere fordi 2 '-OMe modifikasjon hemmer 3 ' adapter ligation. En rekke løsninger har blitt foreslått i litteraturen for å forbedre sRNA bibliotek forberedelse protokoller, men de fleste kommersielt tilgjengelige kits er fortsatt basert på den klassiske TS protokollen, som har alvorlige bias. Noen få "lav bias" kits eksisterer, men inkludert NF Kit med randomiserte adaptere og PEG i ligation reaksjoner, og noen kits dukket nylig som unngår adapter ligation helt12. Vi rapporterte tidligere at NF oppdager flere forskjellige miRNAs enn standard TS protokollen, men protokollen ' s ' (uten adapter ligation) utført relativt dårlig på grunn av en betydelig dannelse av side-produkter12. Overraskende, ved modifisering av TS protokollene hadde en mer følsom påvisning av 2 '-OMe sRNAs enn de andre protokollene, men ikke av normal sRNAs. Vi valgte her for å beskrive i detalj TS5 protokollen, der adaptere er randomisert i ekstremiteter, PEG brukes i ligation reaksjoner og overflødig 3 ' adapter er eliminert ved rensing på perler. Det bør bemerkes her at en annen protokoll (TS7), bruker MRL adaptere kan utføre litt bedre enn TS5 protokollen. Men som det er bare mindre forskjeller mellom de to, og fordi med TS7, er det vanskeligere å skille ønsket biblioteket produktet fra adapter dimers, vi foretrakk her for å beskrive i detalj TS5 protokollen. Men brukere kan, hvis ønskelig, erstatte TS5-adaptere med TS7-adaptere. Merk at disse er litt lenger fører til en endelig bibliotek produkt av ~ 170 BP snarere enn ~ 150 BP.
Muligheten til å utføre protokoll TS5 eller TS7 med "hjemmelaget" materialer gjør det mulig å redusere kostnadene betraktelig. Det kan imidlertid være en større variasjon når det gjelder kvalitet med hjemmelagde materialer; spesielt hjemmelaget pre-adenylated 3 ' adapter kan være gjenstand for variabel kvalitet på grunn av varierende efficacies av pre-adenylation. Det er derfor anbefalt å utarbeide en stor aksje, og hvis en ny aksje er forberedt, sammenligne resultatene med den forrige. Et kontroll RNA-utvalg kan brukes til dette formålet.
En ulempe med protokollene beskriver her er den relativt sterke dannelsen av side-produkter og vanskeligheter med å skille ønsket bibliotek fra disse produktene. Det må utvises forsiktighet for å ikke overbelaste akrylamid for rensing. Nylig ble modifiserte adaptere utviklet som har en sterkt redusert tendens til å danne dimers21. En 2 '-OMe modifikasjon på 3 ' slutten av 5 ' adapter kombinert med en methylphosphonate modifikasjon på 5 ' enden av 3 ' adapter effektivt undertrykt adapter dimers. Det vil være interessant å teste slike endrede adaptere i det her beskrevne protokollen.
Gelen rensing trinnene i protokollen TS5 er relativt arbeidskrevende. Hvis bruk av modifiserte adaptere effektivt reduserer dannelsen av adapter dimers, kan gel rensing av det endelige biblioteket ikke være nødvendig lenger. I tillegg, som et alternativ til gel rensing trinn for å isolere små RNA (trinn 1), en strategi ved hjelp av magnetiske perler å berike for små RNAs finnes (https://ls.beckmancoulter.co.jp/files/appli_note/Supplemental_Protocol_for_miRNA_.pdf). Vi har ikke brukt denne metoden selv, men det er verdt å teste, og hvis det fungerer godt det kunne betydelig forenkle protokollen.
I konklusjonen, mens protokollen TS5 kunne bli ytterligere forbedret, den utfører bedre enn kommersielt tilgjengelige kits, i hvert fall de testet i vår forrige sammenlignende analyse, for påvisning av 2 ' OMe sRNA. Det kan følges ved hjelp av hjemmelaget materiale, slik at betydelig kostnadsreduksjon. For enkelhets skyld, og kanskje mer konstant ytelse, kan reagenser fra TS og NF kits brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Center for Scientific Research (CNRS), den franske alternative energier og Atomic Energy Commission (CEA) og Paris-Sud University. Alle bibliotek forberedelse, Illumina sekvensering og bioinformatikk analyser for denne studien ble utført på I2BC neste generasjons sekvensering (NGS) anlegget. Medlemmene av I2BC NGS-anlegget er anerkjent for kritisk lesning av manuskriptet og nyttige forslag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes | |||
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
- Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
- Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
- Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
- Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
- Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
- Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).
