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Genetics

छोटे आरएनए-सेक में सुधार: कम पूर्वाग्रह और 2'-O-मिथाइल आरएनए की बेहतर जांच

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/60056
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute for Integrative Biology of the Cell, UMR9198, CNRS CEA Univ Paris-Sud, Université Paris-Saclay

Summary

हम मानक तरीकों की तुलना में कम पूर्वाग्रह और 2'-O-मिथाइल आरएनए के लिए एक वृद्धि की संवेदनशीलता के साथ एक विस्तृत छोटे आरएनए पुस्तकालय मरम्मत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल लागत बचाने के लिए या सुविधा के लिए किट का उपयोग करने के लिए घर का बना अभिकर्मकों का उपयोग कर पीछा किया जा सकता है.

Abstract

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) द्वारा छोटे आरएनए (एसआरए) के अध्ययन को पुस्तकालय की तैयारी के दौरान पूर्वाग्रह के मुद्दों द्वारा चुनौती दी जाती है। इस तरह के संयंत्र microRNAs (mirnAs) के रूप में sRNA के कई प्रकार के अपने 3' टर्मिनल न्यूक्लिओटाइड पर एक 2'-O-मिथाइल (2'-OMe) संशोधन ले. यह संशोधन एक और कठिनाई कहते हैं के रूप में यह 3' एडाप्टर ligation रोकता है. हम पहले से प्रदर्शित किया है कि संशोधित संस्करण 'TruSeQ (टीएस) प्रोटोकॉल कम पूर्वाग्रह और 2'-OMe RNAs का एक बेहतर पता लगाने है. यहाँ हम विस्तार से प्रोटोकॉल 'TS5', जो सबसे अच्छा समग्र प्रदर्शन से पता चला में वर्णन. TS5 या तो घर का बना अभिकर्मकों या टीएस किट से अभिकर्मकों का उपयोग कर पीछा किया जा सकता है, समान प्रदर्शन के साथ.

Introduction

छोटे RNAs (sRNAs) जैविक प्रक्रियाओं की विविधता के नियंत्रण में शामिल हैं1. यूकैरियोटिक नियामक sRNAs आम तौर पर 20 और 30 के बीच आकार में nt रहे हैं; तीन प्रमुख प्रकार microRNAs (miRNA), piwi-इंटरैक्टिंग RNAs (piRNA) और छोटे हस्तक्षेप RNAs (siRNA) हैं. एबरेन्ट मिरना अभिव्यक्ति स्तर को विभिन्न प्रकार के रोगों में फंसाया गया है2. यह स्वास्थ्य और रोग में miRNAs के महत्व और सामान्य रूप से SRNAs का पता लगाने के लिए सटीक, मात्रात्मक अनुसंधान उपकरणों के लिए आवश्यकता को रेखांकित करता है.

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) sRNAs का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है। NGS के मुख्य लाभ के रूप में अन्य दृष्टिकोण के साथ तुलना में, इस तरह के मात्रात्मक पीसीआर या microarray तकनीक के रूप में (QPCR), कर रहे हैं कि यह sRNA दृश्यों की एक प्राथमिकता ज्ञान की जरूरत नहीं है और इसलिए उपन्यास RNAs की खोज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इसके अलावा यह कम ग्रस्त है पृष्ठभूमि संकेत और संतृप्ति प्रभाव. इसके अलावा, यह एकल न्यूक्लिओटाइड मतभेदों का पता लगा सकता है और माइक्रोरेरेंस की तुलना में इसका थ्रूपुट अधिक होता है। हालांकि, एनजीएस में भी कुछ कमियां हैं; अनुक्रमण रन की लागत अपेक्षाकृत अधिक रहती है और अनुक्रमण के लिए एक नमूना को लायब्रेरी में परिवर्तित करने के लिए आवश्यक बहुचरण प्रक्रिया पूर्वाग्रहों को पेश कर सकती है। एक ठेठ SRNA पुस्तकालय की तैयारी की प्रक्रिया में, एक 3' एडाप्टर पहले एसआरएनए के लिए ligated है (अक्सर कुल आरएनए से जेल शुद्ध) आरएनए लिगेज़ 2 (RNL2) और एक preadenylated 3' एडाप्टर के एक छोटा संस्करण का उपयोग कर (चित्रा 1) एटीपी की अनुपस्थिति में. यह sRNA-एडाप्टर लिगेशन की दक्षता बढ़ जाती है और इस तरह के SNA परिपत्र या concatemerization के रूप में पक्ष प्रतिक्रियाओं के गठन को कम कर देता है। बाद में, एक 5' एडाप्टर आरएनए लिगेस 1 (RNL1), रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) और पीसीआर प्रवर्धन के बाद द्वारा ligated है। इन सभी कदमों से पूर्वाग्रह3,4हो सकता है . नतीजतन, पढ़ने की संख्या कृत्रिम, विधि पर निर्भर अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए अग्रणी वास्तविक SRNA अभिव्यक्ति के स्तर को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है। विशिष्ट SRNAs या तो अधिक या किसी लायब्रेरी में underrepresented हो सकता है, और दृढ़ता से underrepresented SRNAs पता लगाने से बच सकते हैं. स्थिति विशेष रूप से पौधों miRNAs, कीड़ों और पौधों में siRNAs के साथ जटिल है, और कीड़ों, सूत्रकृमि और स्तनधारियों में piRNAs, जिसमें 3' टर्मिनल न्यूक्लिओटाइड एक 2'-O-O-मेथिल (2'-OMe) संशोधन1है. इस संशोधन दृढ़ता से रोकता है 3' एडाप्टर लिगेशन5, आरएनए के इन प्रकार के लिए पुस्तकालय की तैयारी एक मुश्किल काम कर रही है.

पिछले काम से पता चला है कि अनुकूलक लिगेशन गंभीर पूर्वाग्रह का परिचय देता है , आरएनए अनुक्रम/संरचना प्रभाव6,7,8,9,10,11के कारण . एडाप्टर लिगेशन के डाउनस्ट्रीम के कदम जैसे रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पीसीआर में पक्षपात नहीं होता6,11,12. लिगेशन बायस इस तथ्य के कारण संभव है कि किसी दिए गए अनुक्रम के साथ अनुकूलक अणु अभिक्रिया मिश्रण में एनआरएनए अणुओं के साथ सह-गुण बनाने के लिए सहभागिता करेंगे, जिससे या तो लिगेशन के लिए अनुकूल अथवा प्रतिकूल विन्यास हो सकता है (चित्र 2)। Sorefan एट अल7 से डेटा सुझाव है कि RNL1 एक भी फंसे संदर्भ पसंद करते हैं, जबकि RNL2 लिगेशन के लिए एक डबल किनारा पसंद करते हैं. तथ्य यह है कि एडाप्टर / SRNA सह गुना संरचनाओं विशिष्ट एडाप्टर द्वारा निर्धारित कर रहे हैं और sRNA अनुक्रम बताते हैं क्यों विशिष्ट sRNA पर कर रहे हैं - या एक दिए गए एडाप्टर सेट के साथ underrepresented. यह भी ध्यान दें कि SRNA पुस्तकालयों की एक श्रृंखला के भीतर तुलना की जा करने के लिए महत्वपूर्ण है, एक ही एडाप्टर दृश्यों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. वास्तव में, यह पहले देखा गया है कि विभिन्न बारकोड दृश्यों की शुरूआत से एडाप्टर बदलने अनुक्रमण पुस्तकालयों9,13में miRNA प्रोफाइल बदल जाता है.

लिगेशन संधि के निकट अनुकूलक अनुक्रमों का यादृच्छिकीकरण इन पूर्वाग्रहों को कम कर देता है। Sorefan और उनके सहयोगियों7 उनके extremities पर 4 यादृच्छिक न्यूक्लिओटाइड के साथ एडाप्टर का इस्तेमाल किया, नामित "उच्च परिभाषा" (HD) एडाप्टर, और पता चला कि इन एडाप्टर का उपयोग पुस्तकालयों कि बेहतर सच SRNA अभिव्यक्ति के स्तर को प्रतिबिंबित करने के लिए नेतृत्व. हाल ही में किए गए कार्य ने इन प्रेक्षणों की पुष्टि की और यह प्रकट किया कि यादृच्छिकीकृत क्षेत्र को लिगेशन जंक्शन11से सटे होने की आवश्यकता नहीं है . एडाप्टर के इस उपन्यास प्रकार का नाम "MidRand" एडाप्टर था. साथ में, इन परिणामों को बेहतर एडाप्टर डिज़ाइन पूर्वाग्रह को कम कर सकते हैं कि प्रदर्शित करता है।

एडाप्टर को संशोधित करने के बजाय, पूर्वाग्रह प्रतिक्रिया शर्तों के अनुकूलन के माध्यम से दबा दिया जा सकता है। पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी), एक मैक्रोआण्विक भीड़ एजेंट जो लिगेशन दक्षता14में वृद्धि करने के लिए जाना जाता है , को पूर्वाग्रह15,16को काफी कम करने के लिए दिखाया गया है । इन परिणामों के आधार पर, कई "कम पूर्वाग्रह" किट बाजार पर दिखाई दिया. ये kits कि ligation प्रतिक्रियाओं में खूंटी का उपयोग, या तो शास्त्रीय एडाप्टर या HD एडाप्टर के साथ संयोजन में शामिल हैं. अन्य किट ligation पूरी तरह से बचने के लिए, और 3' polyadenylation और टेम्पलेट का उपयोग करें 3' और 5' एडाप्टर इसके अलावा, क्रमशः12के लिए स्विचन. अभी तक एक और रणनीति में, 3' एडाप्टर लिगेशन एक परिपत्रीकरण कदम के बाद है, इस प्रकार 5 ' एडाप्टर लिगेशन17omitting.

एक पिछले अध्ययन में, हम पूर्वाग्रह के सबसे कम संभव स्तर और का सबसे अच्छा पता लगाने के साथ एक SRNA पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल के लिए खोज की 2'-OMe RNAs12. हम मानक प्रोटोकॉल (टीएस) की तुलना में 2'-OMe RNAs का एक बेहतर पता लगाने था जो ऊपर उल्लिखित 'कम पूर्वाग्रह' किट, में से कुछ का परीक्षण किया. हैरानी की बात है कि हालांकि, संशोधन पर ( यादृच्छिक एडाप्टर का उपयोग, लिगेशन प्रतिक्रियाओं में खूंटी और शुद्धि द्वारा अतिरिक्त 3' एडाप्टर को हटाने) बाद का पता लगाने के लिए अन्य प्रोटोकॉल outperformed 2'-OMe RNAs. यहाँ, हम विस्तार से एक प्रोटोकॉल TS प्रोटोकॉल पर आधारित वर्णन, 'TS5', जो का सबसे अच्छा समग्र पता लगाने था 2'-OMe RNAs. प्रोटोकॉल टीएस किट से अभिकर्मकों और 'Nf' किट से एक अभिकर्मक का उपयोग कर पीछा किया जा सकता है या, पैसे बचाने के लिए, घर का बना अभिकर्मकों का उपयोग कर, समान प्रदर्शन के साथ. हम भी कुल आरएनए से SRNA के शुद्धिकरण और preadenylated 3' एडाप्टर की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.

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Protocol

1. छोटे आरएनए का अलगाव

  1. फीनॉल-आधारित अभिकर्मकों या किसी अन्य विधि का उपयोग करके कुल आरएनए निकालें। सत्यापित करें कि आरएनए अच्छी गुणवत्ता का है या नहीं।
  2. पूर्व चलाने के एक 15% TBE-यूरिया जेल (सामग्री की तालिकादेखें) 200 वी पर 15 मिनट के लिए.
  3. जबकि जेल पूर्व चल रहा है, एक 5-15 डिग्री की मात्रा में कुल आरएनए के मिश्रण 5-20 डिग्री lf मात्रा formamide लोड हो रहा है डाई के एक बराबर मात्रा के साथ (सामग्री की मेजदेखें ; 95% deionized formamide, 0.025% ब्रोमोफेनोल नीले, 0.025% xylene cyanol, 5 mM EDTA पीएच 8) एक 200 पीसीएल ट्यूब में. इसी प्रकार, लघु-आरएनए सीढ़ी के 10 डिग्री एल (200 एनजी)को फार्मामाइड लोडिंग डाई के समान आयतन के साथ मिलालें। गर्म ढक्कन के साथ एक thermocycler में 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट, तो बर्फ पर तुरंत ट्यूब जगह है।
  4. सीढ़ी और उन दोनों के बीच कम से कम एक लेन के साथ एक ही जेल पर नमूना लोड और 200 V पर चलाने के लिए जब तक ब्रोमोफेनोल नीले (अंधेरे नीले) जेल लंबाई के बारे में दो तिहाई चले गए हैं (लगभग 40 मिनट).
  5. जेल से आरएनए को हल करने के लिए एक प्रणाली तैयार करें: 21 गेज सुई के साथ एक न्यूक्लीज-मुक्त 0.5 एमएल माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे पंचर करें। पंचर 0.5 एमएल ट्यूब को न्यूक्लीज-फ्री राउंड-बॉटम 2 एमएल माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें।
  6. जेल निकालें, और कमरे के तापमान पर 3 $L न्यूक्लिक एसिड जेल दाग (10,000 x ध्यान केंद्रित; सामग्री की तालिकादेखें) के साथ कमरे के तापमान पर incubate 10-15 मिनट के लिए 30 एमएल पानी में.
  7. एक 'डार्क रीडर' ट्रांस प्रदीपक पर जेल देखें (यह दृढ़ता से यूवी से बचने के रूप में यह आरएनए नुकसान हो सकता है की सिफारिश की है) और बाहर 17 nt और 29 nt सीढ़ी बैंड के बीच नमूना आरएनए में कटौती. कदम 1.5 से 0.5 एमएल ट्यूब के लिए जेल टुकड़ा स्थानांतरण.
  8. 2 मिनट के लिए अधिकतम गति से एक माइक्रो सेंट्रीफ्यूज में 2 एमएल ट्यूब में 0.5 एमएल ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। 0.5 एमएल ट्यूब निकालें, जो अब खाली होना चाहिए।
  9. कुचल जेल युक्त 2 एमएल ट्यूब के लिए nuclease मुक्त 0.3 एम NaCl के 300 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस रात भर (16 ज) पर कम से कम 2 एच के लिए बारी बारी से।
  10. कुचल जेल के टुकड़ों के निलंबन को स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें (सामग्री की तालिकादेखें ) और एक माइक्रो अपकेंद्रण में अधिकतम गति से 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  11. ग्लाइकोजन का 1 डिग्री एल (20 डिग्री/ -80 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र में अधिकतम गति से 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। सुपरनेंट निकालें, ठंड 80 % इथेनॉल के 800 डिग्री एल के साथ गोली धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए फिर से सेंट्रीफ्यूज, और ध्यान से सभी supernatant हटा दें। न्यूक्लीज मुक्त जल के 15 डिग्री एल में आरएनए गोली को पुन: निलंबित करें। आमतौर पर, इनपुट कुल आरएनए की मात्रा के आधार पर छोटे आरएनए की 5-20 एनजी की वसूली की जानी चाहिए (प्रति 1 डिग्री इनपुट कुल आरएनए के छोटे आरएनए की 1 एनजी)।
  13. अनुशंसित अतिरिक्त चरण: बरामद SRNA की मात्रा और गुणवत्ता की जाँच करें (उदा., केशिका जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा एक छोटे आरएनए किट का उपयोग करके; सामग्री की तालिकादेखें)।

2. preadenylated 3 'HD एडाप्टर की तैयारी

नोट: 3 ' HD एडाप्टर के Preadenylation चेन एट अल18द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के समान तरीके से किया गया था. ध्यान दें कि preadenylated एडाप्टर सीधे आदेश दिया जा सकता है (/

  1. आदेश 5' फॉस्फोरीलेट, 3' अवरुद्ध 3' HD एडाप्टर ओलिगोन्यूक्लिओटाइड। अनुक्रम और संशोधनों के लिए तालिका 1 देखें. ध्यान दें कि '3AmMO' एक 3' एमिनो संशोधक समूह है, सबसे आपूर्तिकर्ताओं इस संशोधन के साथ oligonucleotide उत्पादन कर सकते हैं. 100 डिग्री सेल्सियस के लिए न्यूक्लीज मुक्त पानी में पतला।
  2. निम्नलिखित अभिकर्मकों युक्त एक 100 $L प्रतिक्रिया सेट करें: ओलिगो के 10 डिग्री एल (100 डिग्री सेल्सियस), टी 4 आरएनए लिगे बफर (10x) के 10 डिग्री एल, एटीपी के 10 डिग्री एल (10 एमएम), 50% PEG8000 के 40 एल, टी 4 आरएनए लिगे के 5एल 1 (50 यूनिट), 25 $nuc-l पानी के 25 डिग्री। 20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
  3. इथेनॉल वर्षा के बाद preadenylated ओलिगोन्यूक्लिओटाइड की एक शास्त्रीय फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण प्रदर्शन करते हैं। 100 डिग्री सेल्सियस अम्ल (चह 4ण्5) फीनॉल:क्लोरोफॉर्म तथा भ्रमिल जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए स्पिन, अधिकतम गति। ध्यान से एक नई ट्यूब के लिए ऊपरी चरण के 90 डिग्री एल हस्तांतरण; 3 एम सोडियम ऐसीटेट पीएच 5.2 के 10 डिग्री एल, अल्ट्रा-शुद्ध ग्लाइकोजन के 1 डिग्री एल और ठंड 100% इथेनॉल के 250 डिग्री एल जोड़ें।
  4. कम से कम 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस अधिकतम गति पर। supernatant निकालें, गोली 500 डिग्री एल ठंड 80% इथेनॉल के साथ एक बार धो लो. फीनॉल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और इथेनॉल वर्षा के विकल्प के रूप में, न्यूक्लिओटाइड निष्कासन किट का उपयोग किया जा सकता है (सामग्री की तालिकादेखें)। 25 डिग्री सेल्सियस पानी में फिर से निलंबित करें।
  5. एकल-संक्षिप्त डीएनए का विशिष्ट पता लगाने के लिए एक किट का उपयोग कर एडाप्टर की एकाग्रता को मापने (सामग्री की तालिकादेखें)। 80 एनजी/जेडएल (10 डिग्री सेल्सियस) के लिए पतला।
  6. अनुशंसित अतिरिक्त चरण: एक 15% TBE-यूरिया जेल (सामग्री की तालिका) पर 10 डिग्री सेल्सियस एडाप्टर के 1 $L पलायन द्वारा preadenylation की प्रभावकारिता की पुष्टि करें अनुपचारित ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के साथ। preadenylated एडाप्टर अनुपचारित ओलिगोन्यूक्लिओटाइड की तुलना में थोड़ा धीमी माइग्रेट करना चाहिए। यदि वांछित, preadenylated एडाप्टर जेल शुद्ध किया जा सकता है; ऊपर वर्णित के रूप में आगे बढ़ना (चरण 1-2-1.12).

3. पुस्तकालय की तैयारी - प्रोटोकॉल TS5

नोट: हम यहाँ प्रस्तुत संशोधित टीएस प्रोटोकॉल 'TS5' कि हम पहले वर्णित12 और कि या तो किट से अभिकर्मकों के साथ या स्वयं प्रदान अभिकर्मकों के साथ किया जा सकता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हम एक अलग प्रोटोकॉल के साथ समान या थोड़ा बेहतर परिणाम प्राप्त, 'TS7'. हालांकि, TS7 के साथ यह एडाप्टर dimers को खत्म करने के लिए और अधिक कठिन है। इसलिए हम विस्तार से TS5 का वर्णन करने के लिए पसंद किया है, लेकिन TS7 बस एडाप्टर की जगह द्वारा पीछा किया जा सकता है. TS7 के लिए 'MidRand-Like (MRL)' एडाप्टर अनुक्रम (तालिका 1) का उपयोग करें. ध्यान दें कि यहाँ यादृच्छिक क्षेत्रों एडाप्टर के बीच में हैं. रिवर्स प्रतिलेखन और पीसीआर के लिए प्राइमर में यादृच्छिक क्षेत्र के नीचे दृश्यों के लिए संकर जाएगा 3' एडाप्टर और 5' एडाप्टर में यादृच्छिक क्षेत्र के अपस्ट्रीम. अनुक्रमण 5' एडाप्टर में पहली यादृच्छिक न्यूक्लिओटाइड से शुरू होगा.

  1. 3' एडाप्टर लिगेशन.
    1. एक 0.2 एमएल माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब में शुद्ध छोटे आरएनए ($0.1-1 $M) के 1 $L के साथ preadenylated 3 ' HD एडाप्टर (10 डिग्री सेल्सियस) के 1 $L का मिश्रण। एक थर्मो साइकिलर में 72 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट, तो बर्फ पर सीधे डाल दिया।
    2. 50 प्रतिशत पीईजी 8000 (विशाल विलयन; पाइप धीरे-धीरे) के 4 डिग्री एल जोड़ें, आरएनए लिगे बफर (10x) का 1 डिग्री एल, एच2ओ का 1 डिग्री एल, टी 4 आरएनए लिगे2 का 1 डिग्री एल छोटा, और आरएनसे अवरोधक का 1 डिग्री एल। रात भर में 16 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. अनलिगेट 3' एडाप्टर का उन्मूलन
    1. न्यूक्लीज-मुक्त जल के 10 डिग्री सेल्सियस डालकर अच्छी तरह मिला लें। एन एफ किट ( सामग्री कीतालिका)से 3 एम NaOAc पीएच 5.2 या 'एडप्टर डिलेवरी समाधान' के 6 डिग्री एल जोड़ें और अच्छी तरह से मिला लें। चुंबकीय शुद्धिन मोती के 40 डिग्री सेल्सियस (सामग्री की तालिका) और आइसोप्रोपेनोल के 60 डिग्री एल जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    2. समाधान स्पष्ट दिखाई देता है जब तक एक चुंबकीय रैक में नमूना रखो. अति-निकालिए को हटा दें और छोड़ दें।
    3. ताजा तैयार 80 % इथेनॉल के 180 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. $ 30 s के लिए इनक्यूबेट, फिर निकालें. ताजा तैयार 80% इथेनॉल का उपयोग करने के लिए ध्यान रखना और विस्तारित अवधि के लिए 80% इथेनॉल के साथ इनक्यूबेट नहीं करते।
    4. संक्षेप में ट्यूब स्पिन और अवशिष्ट तरल है कि अच्छी तरह से नीचे एकत्र हो सकता है हटा दें. 2 मिनट के लिए मोती सूखी, तो 10 लाख त्रिस पीएच 8 के 22 डिग्री एल में resuspend या Nf किट से बफर resuspension. 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट, तो नमूना चुंबक जब तक समाधान स्पष्ट दिखाई देता है.
    5. 3 M NaOAc pH 5.2 या 'एडप्टर डिप्लीशन सोल्यूशन' के 6 $L को एनएफ किट (सामग्री तालिका) से एक नई ट्यूब में जोड़ें। इस नई ट्यूब के लिए पिछले कदम से supernatant के 20 $L स्थानांतरण और pipeting द्वारा मिश्रण. चुंबकीय मोती के 40 डिग्री सेल्सियस और 100% आइसोप्रोपेनोल के 60 डिग्री एल जोड़ें और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    6. नमूना चुंबक जब तक समाधान स्पष्ट दिखाई देता है, तो निकालें और supernatant छोड़ दें.
    7. ताजा तैयार 80 % इथेनॉल के 180 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. $ 30 s के लिए इनक्यूबेट, फिर निकालें. टीएके देखभाल ताजा तैयार 80% इथेनॉल का उपयोग करने के लिए और विस्तारित अवधि के लिए 80% इथेनॉल के साथ के लिए इनक्यूबेट नहीं है।
    8. संक्षेप में ट्यूब स्पिन और अवशिष्ट तरल है कि अच्छी तरह से नीचे एकत्र हो सकता है हटा दें. मोती 2 मिनट के लिए सूख, और nuclease मुक्त पानी के 10 डिग्री एल में फिर से निलंबित करते हैं। 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट, तो नमूना चुंबक जब तक समाधान स्पष्ट दिखाई देता है.
    9. एक नई ट्यूब के लिए supernatant के 9 $L स्थानांतरण. टी 4 आरएनए लिगेज बफर (10x) और 1 डिग्री एल जल का 1 डिग्री एल जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, टीएस किट से लिगे बफर के 2 डिग्री एल जोड़ें।
  3. 5' एडाप्टर का लिगेशन.
    1. 5 'एचडी एडाप्टर (10 डिग्री सेल्सियस) का 1 $L जोड़ें; तालिका 1) गर्म ढक्कन के साथ एक थर्मो साइकिलर में एक 200 डिग्री एल पीसीआर ट्यूब के लिए। 70 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट, तो बर्फ पर सीधे ट्यूब डाल दिया।
    2. 10 एमएम एटीपी का 1 डिग्री एल और टी 4 आरएनए लिगेस 1 का 1 डिग्री एल जोड़ें। धीरे से पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। इस मिश्रण का 3 डिग्री सेल्सियस चरण 3.2.9 से 3' ligated आरएनए में जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मिश्रण. 28 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट।
  4. रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी)
    1. स्थानांतरण 6 $L 3' और 5' एडाप्टर एक नया 200 डिग्री एल पीसीआर ट्यूब के लिए आरएनए ligated (बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर शेष $ 80 डिग्री सेल्सियस रखें यदि आवश्यक हो)। आरटी प्राइमर (10 डिग्री सेल्सियस) का 1 $L जोड़ें; तालिका 1) और पाइपिंग द्वारा मिश्रण. 70 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट, तो बर्फ पर सीधे ट्यूब डाल दिया।
    2. आरटी के लिए निम्नलिखित अभिकर्मक जोड़ें: 5x पहले किनारा बफर का 2 $L, 12.5 एमएम डीएनटीपी मिश्रण का 0.5 डिग्री एल, 100 एमएम डीटीटी का 1 $L, आरनेस अवरोधक का 1 $L, और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज का 1 $L(सामग्री की तालिका)। 50 डिग्री सेल्सियस पर 1 h के लिए इनक्यूबेट।
  5. पीसीआर प्रवर्धन
    1. आरटी प्रतिक्रिया मिश्रण के 12.5 डिग्री एल में निम्नलिखित अभिकर्मकों को जोड़ें: पीसीआर पॉलिमरेज बफर के 10 डिग्री सेल्सियस, सार्वभौमिक पी 5 प्राइमर के 2 डिग्री एल (10 डिग्री सेल्सियस; तालिका 1), P7-index प्राइमर के 2 $L (10 डिग्री सेल्सियस; सारणी 1), 1 2ण्5 एम एम डीएनटीपी का 1 डिग्री एल, 0.5 डिग्री सेल्सियस डीएनए पॉलिमरेज (सामग्री की तालिका), और 22 डिग्री सेल्सियस जल का। उपयोग करने तक बर्फ पर प्रतिक्रिया रखें.
    2. निम्नलिखित पीसीआर कार्यक्रम चलाएँ: 30 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 11 चक्र (98 डिग्री सेल्सियस के लिए 10 s, 30 s के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और 15 s के लिए 72 डिग्री सेल्सियस) और 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस. जब समाप्त हो गया पर प्रतिक्रिया रखें 4 डिग्री सेल्सियस।
      नोट: PCR चक्र की संख्या के बारे में: हम आम तौर पर 11 चक्र प्रदर्शन, लेकिन यह उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलित किया जाना चाहिए. पीसीआर चक्र की सबसे छोटी संभव संख्या प्रदर्शन करने का प्रयास करें।
  6. जेल शोधन
    1. एक देशी 6% TBE जेल पर पीसीआर उत्पाद के 5, 10 और 20 डिग्री सेल्सियस भागो (सामग्री की मेजदेखें) एक उपयुक्त सीढ़ी के साथ (सामग्री की तालिकादेखें)। 145 V पर लगभग 1 h के लिए जेल चलाएँ (जब तक ब्रोमोफेनोल नीला नीचे नहीं पहुंचता है; यह डाई 65 बीपी स्थिति में माइग्रेट करता है)।
    2. जेल निकालें, और 10-15 मिनट के लिए पानी में न्यूक्लिक एसिड जेल दाग के साथ इनक्यूबेट (सामग्री की तालिकादेखें)।
    3. एक "डार्क रीडर" ट्रांस illuminator पर जेल देखें (यह दृढ़ता से यूवी से बचने के रूप में यह आरएनए नुकसान हो सकता है की सिफारिश की है) और 150 बीपी पर पुस्तकालय बैंड में कटौती. कदम 1.5 में वर्णित के रूप में जेल से RNA को दूर करने के लिए एक प्रणाली तैयार करें और 0.5 एमएल ट्यूब के लिए जेल टुकड़ा हस्तांतरण.
    4. 2 मिनट के लिए अधिकतम गति पर एक माइक्रो सेंट्रीफ्यूज में सेंट्रीफ्यूज। 0.5 एमएल ट्यूब निकालें, जो अब खाली होना चाहिए।
    5. कुचल जेल युक्त 2 एमएल ट्यूब के लिए nuclease मुक्त पानी के 300 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस रात में कम से कम 2 एच के लिए बारी बारी से।
    6. पानी में कुचल जेल टुकड़े के निलंबन को एक स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें और अधिकतम गति से 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    7. जोड़ें 1 $L (20 g/$L) ग्लाइकोजन, 3 एम NaOAc के 30 डिग्री एल और बर्फ ठंड 100% इथेनॉल के 975 डिग्री एल. 4 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम गति से 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    8. 10 एमएम ट्राइस पीएच8 के 20 डिग्री एल में गोली को फिर से निलंबित करें। एकाग्रता माप के लिए 1 $L और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए 1 $L का उपयोग करें।

4. डेटा विश्लेषण

नोट: नीचे वर्णित डेटा विश्लेषण प्रक्रिया लिनक्स ऑपरेटिंग सिस्टम Ubuntu 16.04 एलटीएस पर आधारित है।

  1. कच्चे अनुक्रम फ़ाइलों का उपचार
    1. अनुक्रमण रन के दौरान उत्पन्न FASTQ अनुक्रम फ़ाइल (ओं) डाउनलोड करें। यदि आवश्यक हो, तो bcl2fastQ2 (संस्करण V2.2.18.12; एक मैनुअल निम्न लिंक से डाउनलोड किया जा सकता है: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html) के साथ deएकाधिकxing प्रदर्शन करते हैं।
      निम्न आदेश का उपयोग करें:
      nohup Pathway[of]bcl2fastQ /bcl2fastQ--runfolder-dir Pathway[of]Run --ignore-missing-bcl --आउटपुट-dir Pathway[of]Output]Directory --barcode-mismatches 1 --aggregated-tiles AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w16
    2. Cutadapt19 संस्करण 1.15 का उपयोग कर एडाप्टर दृश्यों को निकालें। एक मैनुअल यहाँ डाउनलोड किया जा सकता है: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
      निम्न आदेश का उपयोग करें:
      पथ [to]cutadapt/ cutadapt -a TGGAATTCTCGGGGCCCAAGG -n 5 -O 4 -m 10 -J 0 --nextseQ-trim 10 -o Output[File]Read1]cutadapt.fastQ.gz Input[File]Read1.fastQ.gz
      ध्यान दें कि आदेश में अनुक्रम 4 यादृच्छिक न्यूक्लिओटाइड के बिना 3' HD एडाप्टर से मेल खाती है; इसलिए ये इस चरण के दौरान निकाला नहीं जाएगा।
    3. अनुक्रमण में टर्मिनल यादृच्छिक न्यूक्लिओटाइडको हटाने के लिए सेक्ट (https://github.com/lh3/seqtk) का उपयोग करें। निम्न आदेश (चर नाम बोल्ड में) का उपयोग करें:
      सेकटक ट्रिमफक -बी 4 -ई 4 आउटपुट[फ़ाइल]Read1]cutadapt .fastQq gt; आउटपुट[फ़ाइल] Read1 $ट्रिम किया हुआ .फास्टक
    4. 10 nt से कम अनुक्रमों को छोड़ने के लिए निम्न awk आदेश का उपयोग करें:
      awk 'BEGIN [FS ] "$t" ; OFS [ "n"] [हेडर ] [0 ; getline seQ ; getline QseQ ; if (लंबाई (seQ) ;gt; ] 10) [प्रिंट हेडर, सेक, क़हेडर, Qse]' Output[File]Read1[ttrimmed]gt; Length Filter .fastQ
  2. छंटनी की अनुक्रमों का मानचित्रण
    1. निम्नानुसार miRBase से अध्ययन के जीव के लिए इसी डेटाबेस डाउनलोड करें. http://www.mirbase.org/ftp.shtml पर जाएँ और 'mature.fa' फ़ाइल डाउनलोड करें. ध्यान दीजिए कि दृश्यों को आरएनए संकेतन में दर्शाया गया है। U अवशेषों को T द्वारा निम्न आदेश से बदलें:
      sed -i '/ s/U/T/g' परिपक्व.fa
      नोट: यह miRBase में सभी miRNAs की एक पूरी सूची उपज, जीवों की एक किस्म से शुरू होगा.
    2. निम्नलिखित आदेश के साथ ब्याज की अपनी जीव के miRNA दृश्यों का चयन करें:
      awk 'name[of]the[संगठन]प्रिंट; nr[NR+1]; अगला]; NR' mature.fa में NR[ mature.fa]name[of]the[संगठन]mirs.fa
    3. Mapto-created File Bowtie220 (संस्करण 2.3.0) का उपयोग करके कोई बेमेल नहीं होने दें. सबसे पहले, निम्न आदेश के साथ अपनी फ़ाइल के लिए कोई अनुक्रमणिका बनाएँ:
      bowti2-build mature[name[of]the[संगठन]mirs.fa mature[name[of]the[the]जीव]mirs
    4. अनुक्रमण डेटाबेस के लिए पढ़ता संरेखित करें, की आवश्यकता होती है कि एक पढ़ने के नक्शे पूरी तरह से डेटाबेस के एक miRNA करने के लिए, किसी भी बेमेल के बिना. इस अंत में, निम्न उपकरण का उपयोग करें:
      bowti2 -N 0 -L 10 --score-min C,0,0 --end-to-end --time -x mature]name[of]the]जीव]mirs -U Length[Filtered.fastQ -S Length Filter]ALIGNMENT.sam
      नोट: विकल्प: --स्कोर-मिन C,0,0 यह सुनिश्चित करता है कि संरेखण किसी भी बेमेल के बिना है। उपकरण में विभिन्न मापदंडों की एक व्याख्या के लिए, कृपया निम्नलिखित वेबसाइट पर जाएँ: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
    5. संरेखित नहीं किया गया पढ़ता को छोड़ने के लिए, निम्न आदेश का उपयोग करें:
      samtools दृश्य -F 4 लंबाई [Filtered]ALIGNMENT.sam ; Reads[aligned]to$Mirs.sam
      नोट: इन चरणों का एक परिणाम के रूप में, आप अब गठबंधन पढ़ता प्राप्त करना चाहिए, miRNAs के लिए इसी.

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Representative Results

महत्वपूर्ण चरण प्रारंभिक कुल आरएनए सामग्री के छोटे आरएनए अंश का पृथक्करण (चित्र 3) तथा वांछित अंतिम पुस्तकालय उत्पाद (चित्र 4) हैं । दोनों चरणों में पॉलीऐक्रिलमाइड जेल शोधन शामिल है; छोटे आरएनए 15% TBE यूरिया जैल से अलग है, जबकि अंतिम पुस्तकालयों से अलग कर रहे हैं 6% देशी TBE जैल. जेल से अलग छोटे आरएनए का विश्लेषण एक छोटे आरएनए केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस चिप (सामग्री की तालिका) पर किया जा सकता है ; चित्र 3 इससेउपयोगकर्ताओं को बरामद किए गए छोटे आरएनए की मात्रा और तैयारी में miRNA के अनुपात का अनुमान लगाने की अनुमति मिलेगी।

अंतिम पुस्तकालय उत्पाद के जेल शोधन एक नाजुक कदम के रूप में अतिरिक्त उत्पादों की एक संख्या है कि वांछित पुस्तकालय के करीब माइग्रेट का गठन कर रहे हैं. यह जेल अधिभार नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह इस तरह के एडाप्टर dimers के रूप में अन्य प्रजातियों के साथ पुस्तकालय दूषित करने के लिए जोखिम में वृद्धि होगी. एक उदाहरण के रूप में (चित्र 4), पीसीआर-एम्पलीड लाइब्रेरी की बढ़ती मात्रा (बी नेपस आरएनए से) जेल पर लोड की गई थी और अपेक्षित आकार (150 बीपी) के अनुरूप उत्पाद को काट दिया गया था (चित्र 4ए)। elution के बाद, शुद्ध पुस्तकालय एक केशिका जेल electrophoresis चिप पर जाँच की गई थी; अपेक्षित 150 बीपी उत्पाद के अलावा, एक 130 बीपी प्रजातियों की बढ़ती अनुपात, एडाप्टर dimers के लिए इसी पीसीआर उत्पाद की बढ़ती मात्रा के रूप में लोड किया गया देखा गया था (चित्र 4बी, सी).

हम प्रोटोकॉल TS5 किट से अभिकर्मक के साथ के रूप में घर का बना अभिकर्मकों के साथ इसी तरह प्रदर्शन करता है, तो हम परीक्षण किया है. यह अंत करने के लिए, हम सिंथेटिक छोटे RNAs 1-6 के मिश्रण से पुस्तकालयों तैयार, प्रत्येक के बिना या एक 2'-OMe संशोधन के साथ मौजूद, के रूप में हमारे पिछले अध्ययन12में किया. चित्र 5 पहले से प्राप्त इन RNAs में से प्रत्येक के लिए इसी पढ़ता के अनुपात से पता चलता है और नए पुस्तकालयों टीएस और Nf किट से या अन्य आपूर्तिकर्ताओं से अभिकर्मकों का उपयोग कर बनाया के साथ. जैसा कि देखा जा सकता है, बहुत समान परिणाम प्राप्त किए गए थे।

चित्र 6 संयंत्र का पता लगाने के लिए मानक टीएस प्रोटोकॉल के साथ प्रोटोकॉल TS5 के प्रदर्शन की तुलना से पता चलता है (ए thaliana और बी napus) miRNAs, जो 2'-OMe संशोधित कर रहे हैं, और असंशोधित मानव miRNAs की. हम भी piRNAs का पता लगाने का परीक्षण किया, 2'-OMe मानव नमूनों में संशोधित. जैसा कि देखा जा सकता है, TS5 2'-OMe RNAs का पता लगाने के लिए TS से काफी बेहतर प्रदर्शन करता है, लेकिन असंशोधित आरएनए के लिए नहीं। हालांकि, असंशोधित sRNAs के लिए भी, भले ही RNAs की एक बड़ी संख्या का पता नहीं चला रहे हैं, प्राप्त पढ़ें संख्या शायद बेहतर पूर्वाग्रह के निचले स्तर के कारण टीएस के साथ की तुलना में TS5 के साथ सच अभिव्यक्ति के स्तर को प्रतिबिंबित.

Figure 1
चित्र 1 . Illumina अनुक्रमण के लिए SRNA पुस्तकालय तैयारी कार्यप्रवाह के Schematic प्रतिनिधित्व. सबसे पहले, sRNAs एक जेल शुद्धि कदम से अलग कर रहे हैं. यहाँ, miRNAs के आकार रेंज संकेत दिया है, लेकिन किसी भी अन्य आकार रेंज का चयन किया जा सकता है, ब्याज के RNAs पर निर्भर करता है. एक गुणवत्ता नियंत्रण (QC) कदम तो अलग SRNA की गुणवत्ता और मात्रा की जांच करने के लिए किया जाता है. पुस्तकालय की तैयारी के दौरान, एक preadenylated (ऐप) 3' एडाप्टर पहले SRNA करने के लिए ligated है। उसके बाद, एक 5' एडाप्टर ligated है. इसके बाद रिवर्स प्रतिलेखन 3' एडाप्टर के लिए एक प्राइमर पूरक का उपयोग कर के लिए किया जाता है, पीसीआर प्रवर्धन के बाद, जिसके दौरान Illumina P5, P7, और सूचकांक ('In') दृश्यों जोड़ रहे हैं. जिसके परिणामस्वरूप पुस्तकालय जेल शुद्ध है, एक गुणवत्ता नियंत्रण कदम के बाद. फिर पुस्तकालय अनुक्रम है, और डेटा का विश्लेषण कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 . अनुक्रम-निर्भर एडाप्टर-SRNA सह-फोल्डिंग के कारण ब्यास। एडाप्टर लिगेशन मिश्रण में, एडाप्टर एक तरह से है कि एडाप्टर और sRNA के अनुक्रम पर निर्भर करता है में sRNAs के साथ cofold जाएगा. इस प्रकार, विभिन्न SRNAs (उदाहरण ए, बी, और ग द्वारा चित्रित; हरे रंग के विभिन्न रंगों द्वारा इंगित किया गया है) किसी दिए गए एडाप्टर के साथ अलग ढंग से cofold जाएगा (3' एडाप्टर लाल रंग में संकेत दिया है, 5' एडाप्टर नीले रंग में संकेत दिया है).। काले तीर लिगिंग जंक्शनों को दर्शाते हैं। यह लिगिंग के लिए एक अनुकूल या प्रतिकूल संदर्भ के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. के रूप में RNL2 एक डबल फंसे वातावरण पसंद प्रतीत होता है, 3' लिगेशन आरएनए ए और बी के लिए आरएनए सी की तुलना में अधिक कुशल होने की उम्मीद है। RNL1 लिगेशन जंक्शन के आसपास एक एकल फंसे क्षेत्र के लिए एक प्राथमिकता होने के साथ, 5' एडाप्टर लिगेशन आरएनए के लिए सबसे कुशल हो सकता है एक, बी के बाद और सी के लिए कम से कम कुशल एक साथ यह एसआरएनए एक, एक मध्यवर्ती के एक overrepresentation में परिणाम हो सकता है आरएनए ख का प्रतिनिधित्व और अंतिम पुस्तकालय में आरएनए सी का एक अल्प प्रतिनिधित्व, भले ही तीन आरएनए मूल आरएनए नमूने में समान मात्रा में मौजूद हों। ध्यान दें कि एक समान फैशन में, एक दिया sRNA अलग ढंग से प्रस्तुत किया जाएगा जब एडाप्टर अनुक्रम बदल रहा है (उदाहरण के लिए, विभिन्न बारकोड जोड़कर). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . छोटे आरएनए और गुणवत्ता नियंत्रण का अलगाव। (क) ब्रासिका नेपस कुल आरएनए (10 ग्राम) का इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण 15% टीबीई यूरिया डेनिंग पॉलीऐक्रिलमाइड जेल पर। एक छोटी सी आरएनए सीढ़ी (सामग्री की तालिका देखें) एक आणविक आकार मार्कर के रूप में साथ चले गए थे. प्रवास के बाद जेल दागा गया था और आरएनए एक ट्रांस प्रदीपक पर कल्पना की गई थी. 17 से 29 न्यूक्लिओटाइड क्षेत्र काट दिया गया था (एक लाल आयत द्वारा इंगित) और आरएनए eluted था. (बी) शुद्ध आरएनए की गुणवत्ता की जांच केशिका जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा की गई थी। ध्यान दें कि इस विश्लेषण के नमूने में miRNA के अनुपात पर जानकारी प्रदान करता है (93% इस मामले में). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 . एक बी napus छोटे आरएनए पुस्तकालय के जेल शुद्धि प्रोटोकॉल TS5 और गुणवत्ता नियंत्रण के बाद तैयार किया. (ए) बी नेपस छोटे आरएनए से एक पीसीआर प्रवर्धित पुस्तकालय की बढ़ती मात्रा एक 6% देशी टीबीई जेल पर लोड किया गया; 2.5 डिग्री सेल्सियस (क), 5 डिग्री एल (ख), 10 डिग्री सेल्सियस (ग) या 20 डिग्री सेल्सियस (घ) पीसीआर उत्पाद। एक 50 बीपी सीढ़ी के साथ माइग्रेट किया गया था. पीसीआर उत्पादों की उम्मीद 150 पीबी स्थिति पर पलायन अलग थे (लाल आयत), डीएनए eluted और शुद्ध किया गया था. (बी) शुद्ध पुस्तकालय की गुणवत्ता नियंत्रण; जेल प्रतिनिधित्व. (C) एक ही विश्लेषण के इलेक्ट्रोफेरोग्राम प्रतिनिधित्व. के रूप में देखा जा सकता है, 150 पीबी उत्पाद तेजी से एडाप्टर dimers के साथ दूषित है ($130 bp) पीसीआर उत्पाद की बड़ी मात्रा के रूप में जेल पर चले गए हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 . प्रोटोकॉल TS5 टीएस और Nf किट से या अन्य आपूर्तिकर्ताओं से अभिकर्मकों के साथ अभिकर्मकों के साथ इसी तरह करता है. कच्चे पढ़ता की कुल संख्या के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व Histograms (ट्रिमिंग से पहले) आरएनए (OMe)1-6 प्रोटोकॉल TS5 के साथ संगत टीएस और Nf किट (नीले सलाखों), या अन्य आपूर्तिकर्ताओं से अभिकर्मकों के साथ पीछा किया (नारंगी सलाखों). तुलना के लिए, हमारे पिछले अध्ययन से परिणाम ग्रे सलाखों द्वारा दिखाए जाते हैं. आरएनए1-6(कुल आरएनए) या आरएनए-ओमे1-6(कुल आरएनए-ओमे) के संगत पदोकी संख्या ओंठियों को भी दर्शाया गया है। दिखाया गया है कम से कम दो स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब मान रहे हैं. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलनों का प्रतिनिधित्व करती हैं. इस आंकड़े का एक हिस्सा Dard-Dascot एट अल से संशोधित किया गया है, 201812कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 6
चित्र 6 . शास्त्रीय टीएस विधि के साथ प्रोटोकॉल TS5 के miRNA का पता लगाने की तुलना. (ए) मिराबेस में ए. थालियाना, बी नेपस, या एच सैपियन्स मिर्नास के लिए मैपिंग का अनुपात निर्धारित किया गया था। हम भी piRNA का पता लगाने के लिए piRBase करने के लिए मानव पुस्तकालयों के पढ़ता मैप. ध्यान दें कि A.thaliana और B.napus miRNAs, साथ ही साथ मानव piRNAs 2'-OMe संशोधित कर रहे हैं, मानव miRNAs के विपरीत. दिखाए गए कम से कम दो स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य मान हैं और त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलनों का प्रतिनिधित्व करती हैं. (बी) की पहचान की miRNAs (या piRNAs) की संख्या. हम प्रोटोकॉल टीएस या TS5 के साथ की पहचान की विभिन्न प्रजातियों से ज्ञात miRNAs की संख्या निर्धारित किया. ध्यान दें कि ए thaliana, बी napus, या एच sapiens,427, 92, और 2588 miRNAs के लिए क्रमशः miRBase में पंजीकृत किया गया है. 0.5 लाख TS या TS5 पुस्तकालयों से पढ़ता miRbase में बी napus miRNAs के लिए मैप किया गया, 1 लाख पढ़ता ए thaliana या मानव डेटाबेस के लिए मैप किया गया. दिखाया गया त्रुटि पट्टियों द्वारा प्रदर्शित मानक विचलनों के साथ कम से कम दो स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य मान हैं. यह आंकड़ा Dard-Dascot एट अल, 201812से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नाम ओलिगोन्यूक्लिओटाइड 5' संशोधन 3' संशोधन अनुक्रम 5' से 3' शोधन
5' HD (TS5) एडाप्टर 5AmMC6 [5AmMC6] GTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCNRNrNN (ध्यान दें कि इस ओलिगो एक डीएनए-RNA चिमेरिक है; तीन 3' टर्मिनल nts आरएनए हैं) Hplc
3' HD (TS5) एडाप्टर फॉस्फेट 3एएमओ [Phos]rNrNrNRNTGGAATTCTCGGGTGGCGAG[3AMO] (ध्यान दें कि यह ओलिगो एक डीएनए-RNA चिमेरिक है; चार 5' टर्मिनल nts आरएनए हैं) Hplc
5' एमआरएल (TS7) एडाप्टर 5AmMC6 [5AmMC6] GTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCNNNNRCrGrArArArC (ध्यान दें कि यह ओलिगो एक डीएनए-RNA चिमेरिक है; सात 3' टर्मिनल एनटीएस आरएनए हैं) Hplc
3' एमआरएल (TS7) एडाप्टर फॉस्तेस 3एएमओ [फॉस] GTATCGTNNNNNNTGGAATTCCG[3AmMO] Hplc
आरटी प्राइमर जीसीसीटीजीसीसीसीकागागाटाका Hplc
यूनिवर्सल P5 प्राइमर AATGATACGGCGACCGAGTCTACTACTACTCGTACAGTACA Hplc
P7-इंडेक्स प्राइमर कागआगागगगगगगगगगगगगगगगगटगगटगगटगगगगगटगगगगटकगगटकगगटकगगटकगगटका (NNNNन ]सूचकांक) Hplc
सूचकांक 1: CGTGAT
सूचकांक 2: ACATCG
सूचकांक 3: GCCTAA
सूचकांक 4: TGGTCA
सूचकांक 5: CACTGT
सूचकांक 6: ATTGGC
सूचकांक 7: GATCTG
सूचकांक 8: TCAAGT
सूचकांक 9: CTGATC
सूचकांक 10: AAGCTA
सूचकांक 11: GTAGCC
सूचकांक 12: TACAAG

तालिका 1. इस प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग किया जाने वाले ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स।

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Discussion

छोटे आरएनए पुस्तकालय की तैयारी पूर्वाग्रह के कारण चुनौतीपूर्ण बनी हुई है, मुख्य रूप से एडाप्टर लिगिंग चरणों के दौरान शुरू की गई। उनके 3 के अंत में एक 2'-OMe संशोधन के साथ RNAs इस तरह के संयंत्र mirna, कीड़े में piRNA, सूत्रकृमि और स्तनधारियों, और छोटे हस्तक्षेप RNAs (siRNA) कीड़े और पौधों में अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से मुश्किल है क्योंकि 2 'OMe संशोधन रोकता है 3' एडाप्टर लिगेशन. साहित्य में कई समाधान ों का प्रस्ताव किया गया है ताकि SRNA पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल में सुधार किया जा सके, लेकिन सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट अभी भी शास्त्रीय टीएस प्रोटोकॉल पर आधारित हैं, जिसमें गंभीर पूर्वाग्रह है। कुछ 'कम पूर्वाग्रह' किट मौजूद हैं, तथापि, यादृच्छिक एडाप्टर और लिगेशन प्रतिक्रियाओं में खूंटी के साथ Nf किट सहित, और कुछ किट हाल ही में दिखाई दिया है कि एडाप्टर ligation पूरी तरह से12से बचने . हमने पहले बताया कि Nf मानक TS प्रोटोकॉल की तुलना में अधिक अलग miRNAs का पता लगाता है, लेकिन प्रोटोकॉल 'एस' (एडाप्टर लिगेशन के बिना) पक्ष-उत्पादों के एक महत्वपूर्ण गठन के कारण अपेक्षाकृत खराब प्रदर्शन किया12. हैरानी की बात है, संशोधन पर टीएस प्रोटोकॉल अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में 2'-OMe sRNAs का एक अधिक संवेदनशील पता लगाने था, लेकिन सामान्य sRNAs की नहीं. हम यहाँ चुना विस्तार से TS5 प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए, जिसमें एडेप्टर उनके extremities पर यादृच्छिक कर रहे हैं, खूंटी लिगेशन प्रतिक्रियाओं में प्रयोग किया जाता है और अतिरिक्त 3' एडाप्टर मोती पर शुद्धि द्वारा समाप्त हो जाता है. यह यहाँ ध्यान दिया जाना चाहिए कि कोई भिन्न प्रोटोकॉल (TS7), MRL एडाप्टर का उपयोग कर TS5 प्रोटोकॉल से थोड़ा बेहतर प्रदर्शन कर सकते हैं। हालांकि, के रूप में वहाँ दोनों के बीच केवल मामूली अंतर हैं और क्योंकि TS7 के साथ, यह अधिक अनुकूलक dimers से वांछित पुस्तकालय उत्पाद को अलग करने के लिए कठिन है, हम यहाँ पसंद विस्तार से TS5 प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए. हालाँकि, उपयोगकर्ताओं को, यदि वांछित, TS5 एडाप्टर TS7 एडाप्टर द्वारा प्रतिस्थापित कर सकते हैं। ध्यान दें कि ये थोड़ा लंबे समय तक $ 170 बीपी के एक अंतिम पुस्तकालय उत्पाद के बजाय $ 150 बीपी के लिए अग्रणी रहे हैं.

'घर का बना' सामग्री के साथ प्रोटोकॉल TS5 या TS7 प्रदर्शन करने की संभावना काफी हद तक लागत को कम करने की अनुमति देता है. हालांकि, घर का बना सामग्री के साथ गुणवत्ता के मामले में एक बड़ा परिवर्तनशीलता हो सकती है; विशेष रूप से घर का बना पूर्व adenylated 3' एडाप्टर पूर्व-adenylation के विभिन्न प्रभाव के कारण चर गुणवत्ता के अधीन हो सकता है. इसलिए यह एक बड़ा स्टॉक तैयार करने के लिए सिफारिश की है और अगर एक नया स्टॉक तैयार है, पिछले एक के साथ अपने प्रदर्शन की तुलना करें. एक नियंत्रण आरएनए नमूना इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

प्रोटोकॉल का एक नुकसान यहाँ का वर्णन पक्ष उत्पादों के अपेक्षाकृत मजबूत गठन और इन उत्पादों से वांछित पुस्तकालय को अलग करने के लिए कठिनाई है. देखभाल शुद्धि के लिए acrylamide जेल अधिभार नहीं करने के लिए लिया जाना चाहिए. हाल ही में, संशोधित एडाप्टर विकसित किए गए थे जो डिमर्स21बनाने की प्रबल रूप से कम प्रवृत्ति वाले होते हैं। एक 2'-OMe संशोधन के 3' अंत में 5' एडाप्टर के 5' पर एक methylphosphonate संशोधन के साथ संयुक्त 3' एडाप्टर कुशलतापूर्वक एडाप्टर dimers दबा की चरम सीमा. यह यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में इस तरह के संशोधित एडाप्टर का परीक्षण करने के लिए दिलचस्प हो जाएगा।

प्रोटोकॉल TS5 में जेल शोधन कदम अपेक्षाकृत श्रम गहन हैं. संशोधित एडाप्टर का उपयोग कुशलता से एडाप्टर dimers के गठन को कम कर देता है, तो अंतिम पुस्तकालय के जेल शोधन अब और आवश्यक नहीं हो सकता है। इसके अलावा, छोटे आरएनए को अलग करने के लिए जेल शोधन कदम के लिए एक विकल्प के रूप में (चरण 1), छोटे आरएनए के लिए समृद्ध करने के लिए चुंबकीय मोती का उपयोग कर एक रणनीति मौजूद है (https://ls.beckmancoulter.co.jp/files/appli_note/Supplemental_Protocol_for_miRNA_.pdf). हम इस विधि अपने आप को इस्तेमाल नहीं किया है, लेकिन यह परीक्षण के लायक है और अगर यह अच्छी तरह से काम करता है यह काफी प्रोटोकॉल को सरल सकता है.

अंत में, जबकि प्रोटोकॉल TS5 आगे सुधार किया जा सकता है, यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट की तुलना में बेहतर प्रदर्शन करता है, कम से कम उन हमारे पिछले तुलनात्मक विश्लेषण में परीक्षण किया, 2'OMe SRNA का पता लगाने के लिए. यह घर का बना सामग्री का उपयोग कर पीछा किया जा सकता है, महत्वपूर्ण लागत में कमी की अनुमति. सुविधा के लिए, और शायद अधिक निरंतर प्रदर्शन, टीएस और Nf किट से अभिकर्मकों इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए राष्ट्रीय केंद्र (CNRS), फ्रेंच वैकल्पिक ऊर्जा और परमाणु ऊर्जा आयोग (सीईए) और पेरिस-सूड विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था. इस अध्ययन के लिए सभी पुस्तकालय तैयारी, Illumina अनुक्रमण और bioinformaticविश्लेषण विश्लेषण I2BC अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) सुविधा में प्रदर्शन किया गया. I2BC NGS सुविधा के सदस्यों पांडुलिपि और उपयोगी सुझावों के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए स्वीकार कर रहे हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument  Agilent G2939BA
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) ThermoFisher AM9720
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) Nex England Biolabs P0756S
Agencourt AMPure XP beads Beckman Coulter A63880
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626
Bioanalyzer Small RNA Kit Agilent 5067-1548
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters Sigma Aldrich CLS8162-96EA
Dark Reader transilluminator various suppiers
HotStart PCR Kit, with dNTPs Kapa Biosystems KK2501
NEXTflex small RNA-seq V3 kit BIOO Scientific NOVA-5132-05 optional
Novex TBE gels 6% ThermoFisher EC6265BOX
Novex TBE Urea gels 15% ThermoFisher EC6885BOX
QIAquick Nucleotide Removal Kit Qiagen  28304
Qubit 4 Quantitation Starter Kit ThermoFisher Q33227
Qubit ssDNA Assay Kit ThermoFisher Q10212
RNA Gel Loading Dye (2X) ThermoFisher R0641
RNA Gel Loading Dye (2X) ThermoFisher R0641
RNase Inhibitor, Murine  Nex England Biolabs M0314S
SuperScript IV Reverse Transcriptase ThermoFisher 18090200
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain ThermoFisher S11494
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) Nex England Biolabs M0204S
T4 RNA Ligase 2, truncated Nex England Biolabs M0242S
TrackIt 50 bp DNA ladder ThermoFisher 10488043
TruSeq Small RNA Library Prep Kit Illumina RS-200-0012/24/36/48 optional
UltraPure Glycogen ThermoFisher 10814010
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher EI0001
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher EI0001
ZR small RNA ladder Zymo Research R1090
the last two numbers correspond to the set of indexes

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References

  1. Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
  2. Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
  3. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
  4. van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
  5. Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
  6. Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
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छोटे आरएनए-सेक में सुधार: कम पूर्वाग्रह और 2'-O-मिथाइल आरएनए की बेहतर जांच
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van Dijk, E. L., Eleftheriou, E.,… More

van Dijk, E. L., Eleftheriou, E., Thermes, C. Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs. J. Vis. Exp. (151), e60056, doi:10.3791/60056 (2019).

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