Summary
Vi presentiamo un piccolo protocollo di riparazione della libreria di RNA dettagliato con meno distorsione rispetto ai metodi standard e una maggiore sensibilità per 2'-O-metilRNA. Questo protocollo può essere seguito utilizzando reagenti fatti in casa per risparmiare sui costi o utilizzando kit per comodità.
Abstract
Lo studio dei piccoli RNA (sRNA) da parte del sequenziamento di nuova generazione (NGS) è messo in discussione da problemi di pregiudizio durante la preparazione della libreria. Diversi tipi di sRNA come i microRNA vegetali (miRNA) portano una modifica di 2'-O-metile (2'-OMe) al loro nucleotide terminale 3'. Questa modifica aggiunge un'altra difficoltà in quanto inibisce la legatura dell'adattatore da 3'. In precedenza abbiamo dimostrato che le versioni modificate del protocollo "TruSeq (TS)" hanno meno pregiudizi e un miglioramento del rilevamento di 2'OMe RNA. Qui descriviamo in dettaglio il protocollo 'TS5', che ha mostrato le migliori prestazioni complessive. TS5 può essere seguito utilizzando reagenti fatti in casa o reagenti dal kit TS, con le stesse prestazioni.
Introduction
I piccoli RNA (sRNA) sono coinvolti nel controllo di una diversità di processi biologici1. Gli sRNA normativi eucarioti sono in genere di dimensioni comprese tra 20 e 30 nt; i tre tipi principali sono i microRNA (miRNA), gli RNA che interagiscono con il piwi (piRNA) e i piccoli RNA interferenti (siRNA). I livelli di espressione dell'aberrro miRNA sono stati implicati in una varietà di malattie2. Ciò sottolinea l'importanza dei miRNA nella salute e nelle malattie e la necessità di strumenti di ricerca accurati e quantitativi per rilevare gli sRNA in generale.
Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è un metodo ampiamente utilizzato per studiare gli sRNA. I principali vantaggi di NGS rispetto ad altri approcci, come le tecniche quantitative PCR o microarray (qPCR), sono che non ha bisogno di una conoscenza a priori delle sequenze di sRNA e può quindi essere utilizzato per scoprire nuovi RNA, e in aggiunta soffre meno di effetti di segnale di fondo e saturazione. Inoltre, è in grado di rilevare differenze di singolo nucleotide e ha una velocità effettiva più elevata rispetto ai microarray. Tuttavia, NGS presenta anche alcuni inconvenienti; il costo di un'esecuzione della sequenza rimane relativamente elevato e il processo multifase necessario per convertire un campione in una libreria per la sequenza può introdurre distorsioni. In un tipico processo di preparazione della libreria sRNA, un adattatore da 3' viene prima legato allo sRNA (spesso purificato in gel dall'RNA totale) utilizzando una versione troncata di RNA ligase 2 (RNL2) e un adattatore predeterminato 3' (Figura 1) in assenza di ATP. Questo aumenta l'efficienza della legatura sRNA-adattatore e riduce la formazione di reazioni laterali come la circolarizzazione sRNA o la concatenazione. Successivamente, un adattatore da 5' è legato da RNA ligase 1 (RNL1), seguito dalla trascrizione inversa (RT) e dall'amplificazione PCR. Tutti questi passaggi possono introdurre bias3,4. Di conseguenza, i numeri letti potrebbero non riflettere i livelli effettivi di espressione sRNA che portano a modelli di espressione artificiali dipendenti dal metodo. Gli sRNA specifici possono essere sovrarappresentati o sottorappresentati in una libreria e gli sRNA fortemente sottorappresentati possono sfuggire al rilevamento. La situazione è particolarmente complicata con miRNA vegetali, siRNA in insetti e piante e piRNA in insetti, nematodi e mammiferi, in cui il nucleotide terminale 3 ha una modifica 2'-O-metila (2'-OMe)1. Questa modifica inibisce fortemente la legatura dell'adattatore5,rendendo la preparazione della libreria per questi tipi di RNA un compito difficile.
Il lavoro precedente ha dimostrato che la legatura dell'adattatore introduce gravi distorsioni, a causa degli effetti di sequenza/struttura dell'RNA6,7,8,9,10,11. I passaggi a valle della legatura dell'adattatore, ad esempio la trascrizione inversa e la PCR, non contribuiscono in modo significativo alladistorsione 6,11,12. La distorsione della legatura è probabilmente dovuta al fatto che le molecole dell'adattatore con una data sequenza interagiranno con le molecole di sRNA nella miscela di reazione per formare co-fold, che possono portare a configurazioni favorevoli o sfavorevoli per la legatura (Figura 2). I dati di Sorefan et al7 suggeriscono che RNL1 preferisce un singolo contesto spiaggiato, mentre RNL2 preferisce un doppio filo per la legatura. Il fatto che le strutture di co-piegadelle adattatore/sRNA siano determinate dall'adattatore specifico e dalle sequenze sRNA spiega perché specifici sRNA sono sovrarappresentati o sottorappresentati con un determinato set di adattatori. È anche importante notare che all'interno di una serie di librerie di sRNA da confrontare, devono essere utilizzate le stesse sequenze di adattatori. In fatti, è stato osservato in precedenza che la modifica degli adattatori con l'introduzione di diverse sequenze di codici a barre altera i profili miRNA nelle librerie di sequenziamento9,13.
La randomizzazione delle sequenze dell'adattatore vicino alla giunzione di legatura probabilmente riduce queste distorsioni. Sorefan e colleghi7 hanno usato adattatori con 4 nucleotidi casuali alle loro estremità, designati adattatori "High Definition" (HD), e hanno dimostrato che l'uso di questi adattatori porta a librerie che riflettono meglio i livelli di espressione di sRNA reali. Un lavoro più recente ha confermato queste osservazioni e ha rivelato che la regione randomizzata non ha bisogno di essere adiacente alla giunzione di ligazione11. Questo nuovo tipo di adattatori è stato chiamato "MidRand" adattatori. Insieme, questi risultati dimostrano che una migliore progettazione dell'adattatore può ridurre la distorsione.
Invece di modificare gli adattatori, la distorsione può essere soppressa attraverso l'ottimizzazione delle condizioni di reazione. Il glicole in polietilene (PEG), un agente di crowding macromolecolare noto per aumentare l'efficienza della legatura14, ha dimostrato di ridurre significativamente la distorsione15,16. Sulla base di questi risultati, diversi kit "low bias" sono apparsi sul mercato. Questi includono kit che utilizzano PEG nelle reazioni di legatura, sia in combinazione con adattatori classici o adattatori HD. Altri kit evitano del tutto la legatura e utilizzano la poliadenilazione 3' e la commutazione del modello per l'aggiunta dell'adattatore 3 e 5', rispettivamente12. In un'altra strategia, la legatura dell'adattatore 3' è seguita da una fase di circolarizzazione, omettendo così la legatura dell'adattatore 5'17.
In uno studio precedente, abbiamo cercato un protocollo di preparazione della libreria sRNA con i più bassi livelli possibili di bias e la migliore rilevazione di 2'-OMe RNA12. Abbiamo testato alcuni dei suddetti kit "low bias", che avevano una migliore rilevazione di 2'-OMe RNA rispetto al protocollo standard (TS). Sorprendentemente, tuttavia, al momento della modifica (l'uso di adattatori randomizzati, PEG nelle reazioni di legatura e rimozione dell'adattatore in eccesso 3' per purificazione) quest'ultimo ha sovraperformato gli altri protocolli per il rilevamento di 2'OMe RNA. Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo basato sul protocollo TS, 'TS5', che ha avuto il miglior rilevamento complessivo di 2'-OMe RNA. Il protocollo può essere seguito utilizzando reagenti del kit TS e un reagente dal kit 'Nf' o, per risparmiare denaro, utilizzando reagenti fatti in casa, con le stesse prestazioni. Forniamo anche un protocollo dettagliato per la purificazione dello sRNA dall'RNA totale e la preparazione di un adattatore pre-denunciato 3'.
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Protocol
1. Isolamento di piccoli RNA
- Estrarre l'RNA totale usando reagenti a base di fenolo o qualsiasi altro metodo. Verificare se l'RNA è di buona qualità.
- Pre-eseguire un 15% gel TBE-urea (vedi Tabella dei Materiali)per 15 min a 200 V.
- Mentre il gel è in esecuzione, mescolare 5-20 g di RNA totale in un volume di 5-15 l con un volume uguale di colorante da carico formamide (vedi Tabella dei materiali; 95% deionizzato formamide, 0.025% bromophenol blu, 0.025% xylene cyanol, 5 mM EDTA pH 8) in un 200L. Allo stesso modo, mescolare 10 l (200 ng) di scala di RNA piccolo (vedi Tabella dei materiali) con un volume uguale di colorante di carico formamide. Incubare per 5 min a 65 gradi centigradi in un termociclore con coperchio riscaldato, quindi posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio.
- Caricare la scala e il campione sullo stesso gel con almeno una corsia tra di loro e correre a 200 V fino a quando il bromofenolo blu (blu scuro) è migrato circa due terzi della lunghezza del gel (circa 40 min).
- Preparare un sistema per eluire l'RNA dal gel come segue: forare il fondo di un tubo di micro centrifuga di 0,5 mL senza nuclesione con un ago da 21 calibro. Posizionare il tubo forato da 0,5 mL in un tubo di micro centrifugatura da 2 mL senza nuclesi.
- Togliere il gel e incubare a temperatura ambiente con una macchia di gel acido nucleico (10.000 x concentrato; vedi Tabella dei materiali)in 30 mL di acqua per 10-15 min.
- Guarda il gel su un illuminatore trans 'Dark Reader' (si consiglia vivamente di evitare i raggi UV in quanto ciò potrebbe danneggiare l'RNA) e ritagliare l'RNA campione tra le bande da 17 nt e 29 nt. Trasferire il pezzo di gel al tubo da 0,5 mL dal punto 1.5.
- Centrifugare il tubo da 0,5 mL nel tubo da 2 mL in una micro centrifuga alla velocità massima per 2 min. Rimuovere il tubo da 0,5 mL, che ora dovrebbe essere vuoto.
- Aggiungete 300 l di nuclenon-free 0,3 M NaCl al tubo da 2 mL contenente il gel frantumato e ruotate per almeno 2 h a temperatura ambiente o a 4 gradi durante la notte (16 h).
- Trasferire la sospensione dei pezzi di gel schiacciati in una colonna di spin (vedi Tabella dei materiali)e centrifugare per 2 min alla massima velocità in una micro centrifuga.
- Aggiungete 1 ll di glicogeno (cfr. tabella dei materiali)e 950 l un po' di temperatura ambiente 100% di etanolo. Incubare per almeno 30 min a -80 gradi centigradi.
- Centrifuga per 20 min alla massima velocità in una micro centrifuga a 4 gradi centigradi. Togliere il supernatante, lavare il pellet con 800 o lun di freddo 80 % di etanolo. Centrifuga di nuovo per 5 min a 4 gradi centigradi, e rimuovere con attenzione tutti i supernatali. Risospendere l'RNA pellet in 15 gradi di acqua priva di nucleato. Tipicamente, 5-20 ng di piccolo RNA dovrebbero essere recuperati, a seconda della quantità di ingresso totale di RNA (1 ng di piccolo RNA per 1 g di RNA totale di ingresso).
- Passo aggiuntivo consigliato: Controllare la quantità e la qualità dello sRNA recuperato (ad esempio, mediante elettroforesi gel capillare utilizzando un piccolo kit di RNA; vedi Tabella dei materiali).
2. Preparazione dell'adattatore HD pre-anegato 3'
NOTA: La pre-negazione dell'adattatore HD 3' è stata effettuata in modo simile al protocollo descritto da Chen et al18. Si noti che l'adattatore preadentale può essere ordinato direttamente (/5rApp / modifica), ma questo è piuttosto costoso.
- Ordina 5' fosforolato, 3' bloccato 3' oligonucleotide adattatore HD. Vedere la Tabella 1 per la sequenza e le modifiche. Si noti che '3AmMO' è un 3' amino modificatore gruppo, la maggior parte dei fornitori possono produrre oligonucleotide con questa modifica. Diluire in acqua priva di nuclea fino a 100 M.
- Impostare una reazione di 100 gradi con i seguenti reagenti: 10 ldi di oligo (100 m), 10 lof di T4 RNA ligase buffer (10x), 10 L di ATP (10 mM), 40 L del 50% PEG8000, 5 -L di T4 RNA ligase 1 (50 unità), 25L di acqua senza nucleato. Incubare per una notte a 20 gradi centigradi.
- Eseguire un'estrazione fenomenolismitale classica dell'oligonucleotide pre-adentata seguita da precipitazioni di etanolo. Aggiungere 100 l di acido (pH 4,5) fenolo: cloroformio e vortice. Girare per 5 min a temperatura ambiente, velocità massima. Trasferire con cura 90 l della fase superiore in un nuovo tubo; aggiungete 10 L di pH di acetato di sodio da 3 M 5,2, 1 L di glicogeno ultra-puro e 250 l di etanolo freddo 100%.
- Mantenere a -20 gradi centigradi per almeno 30 min. Centrifuga per 30 min alla velocità massima di 4 gradi centigradi. Togliere il supernatante, lavare il pellet una volta con 500 o luna fredda 80% etanolo. In alternativa all'estrazione del fenolo-cloroformio e alla precipitazione dell'etanolo, può essere utilizzato un kit di rimozione dei nucleotidi (vedere Tabella dei materiali). Risospendere in 25 acqua l.
- Misurare la concentrazione dell'adattatore utilizzando un kit per il rilevamento specifico del DNA a filamento singolo (vedere Tabella dei materiali). Diluire fino a 80 ng/l (10 M).
- Passo aggiuntivo consigliato: Verificare l'efficacia della preadenlazione migrando 1 o l'insieme di 10 m di adattatore su un gel TBE-urea del 15% (Tabella dei materiali)insieme a oligonucleotide non trattata. L'adattatore pre-negato dovrebbe migrare leggermente più lentamente dell'oligonucleotide non trattato. Se lo si desidera, l'adattatore preadensato può essere purificato in gel; come descritto in precedenza (passaggi 1.2-1.12).
3. Preparazione della libreria - Protocollo TS5
NOTA: Presentiamo qui il protocollo TS modificato 'TS5' che abbiamo descritto in precedenza12 e che può essere eseguito sia con reagenti dal kit che con reagenti auto-forniti. Va notato che abbiamo ottenuto risultati simili o anche leggermente migliori con un protocollo diverso, 'TS7'. Tuttavia, con TS7 è più difficile eliminare i dimeri dell'adattatore. Abbiamo quindi preferito descrivere TS5 in dettaglio, ma TS7 può essere seguito semplicemente sostituendo gli adattatori. Per TS7 utilizzare le sequenze di adattatori 'MidRand-Like (MRL)'(Tabella 1). Si noti che in questo caso le aree randomizzate si trovano al centro degli adattatori. I Primer per la trascrizione inversa e la PCR si istitreranno alle sequenze a valle dell'area randomizzata nell'adattatore 3' e a monte dell'area randomizzata nell'adattatore 5'. Il sequenziamento inizierà dal primo nucleotide randomizzato nell'adattatore da 5'.
- 3' legatura dell'adattatore.
- Unire 1 luna di adattatore HD pre-adenurato da 3' (10 m) con 1 o l un'RNA di piccolo dna purificato (0,1-1 M) in un micro impianto di fusione da 0,2 mL. Incubare per 2 min a 72 gradi centigradi in un termociclolo, quindi mettere direttamente sul ghiaccio.
- Aggiungete 4 - L del 50 % PEG 8000 (soluzione viscosa; pipet lentamente), 1 -L di tampone di ligase di RNA (10x), 1 -L di H2O, 1 L di T4 RNA ligase2 troncato, e 1 -L di inibitore di RNase. Incubare per notando a 16 gradi centigradi.
- Eliminazione dell'adattatore 3' non ligato
- Aggiungere 10 l di acqua priva di nuclenonri e mescolare bene. Aggiungete 6 -L di 3 M NaOAc pH 5.2 o 'Soluzione di esaurimento dell'adattatore' dal kit Nf (Tabella dei materiali) e mescolate bene. Aggiungete 40 -L di perline di purificazione magnetica (Tabella dei materiali) e 60 -L di isopropanolo e mescolate bene. Incubare per 5 min a temperatura ambiente.
- Mettere il campione in un rack magnetico fino a quando la soluzione non appare chiara. Rimuovere e scartare il super-natante.
- Aggiungete 180 l di etanolo appena preparato all'80 %. Incubare per 30 dollari, quindi rimuovere. Fare attenzione a utilizzare l'80% di etanolo appena preparato e non incubare con l'80% di etanolo per lunghi periodi.
- Ruotare brevemente il tubo e rimuovere il liquido residuo che potrebbe aver raccolto sul fondo del pozzo. Lasciare asciugare le perline per 2 min, quindi risospendere in 22 mL di 10 mM Tris pH 8 o buffer di sospensione dal kit Nf. Incubare per 2 min, quindi magnetizzare il campione fino a quando la soluzione appare chiara.
- Aggiungete 6 -L di 3 M NaOAc pH 5.2 o 'Soluzione di esaurimento dell'adattatore' dal kit Nf (Tabella dei materiali) a un nuovo tubo. Trasferire 20 l del supernatante dal passo precedente a questo nuovo tubo e mescolare con il pipettaggio. Aggiungete 40 - L di perline magnetiche e 60 -L di 100% isopropanolo e mescolate bene pipettando. Incubare per 5 min.
- Magnetizzare il campione fino a quando la soluzione appare chiara, quindi rimuovere e scartare il supernatante.
- Aggiungete 180 l di etanolo appena preparato all'80 %. Incubare per 30 dollari, quindi rimuovere. Take cura di utilizzare appena preparato 80% etanolo e non incubare per con 80% etanolo per lunghi periodi.
- Ruotare brevemente il tubo e rimuovere il liquido residuo che potrebbe aver raccolto sul fondo del pozzo. Lasciare asciugare le perline per 2 min e risospendere a 10 gradi di acqua priva di nuclea. Incubare per 2 min, quindi magnetizzare il campione fino a quando la soluzione appare chiara.
- Trasferire 9 l.l di supernatante in un nuovo tubo. Aggiungere 1 - L di T4 RNA ligase tampone (10x) e 1 - L di acqua. In alternativa, aggiungere 2 lofon di ligase buffer dal kit TS.
- Ligazione dell'adattatore da 5' .
- Aggiungere 1 adattatore HD da 5' (10 M; Tabella 1) a un tubo PCR da 200 luna in un termociclore con coperchio riscaldato. Incubare per 2 min a 70 gradi centigradi, quindi mettere il tubo direttamente sul ghiaccio.
- Aggiungete 1 OL da 10 mM ATP e 1 L di T4 RNA ligase 1. Mescolare bene pipettando delicatamente. Aggiungere 3 - L di questo mix all'RNA ligated 3' dal passo 3.2.9 e mescolare con la pipa. Incubare per 1 h a 28 gradi centigradi.
- Trascrizione inversa (RT)
- Trasferire l'RNA ligate dell'adattatore di 6 e 5' su un nuovo tubo PCR da 200 litri (mantenere il restante 8 A -80 gradi centigradi per un uso successivo, se necessario). Aggiungete 1 - L di RT primer (10 M; Tabella 1) e mescolare con il pipettaggio. Incubare per 2 min a 70 gradi centigradi, quindi mettere il tubo direttamente sul ghiaccio.
- Aggiungere i seguenti reagenti per RT: 2 l'luna di 5 volte il primo buffer di filamento, 0,5 ll di miscela dNTP da 12,5 mM, 1 DTT da 100 mM, 1 l di inibitore di RNase e 1 ll di trascrizione inversa (Tabella dei materiali). Incubare per 1 h a 50 gradi centigradi.
- Amplificazione PCR
- Aggiungere i seguenti reagenti alla miscela di reazione di 12,5 litri di RT: 10 litri di buffer di polimerasi PCR, 2 l di primer P5 universale (10 M; Tabella 1), 2 l of P7-index primer (10 M; Tabella 1), 1 L da 12,5 mM dNTP, 0,5 l di polimerasi di DNA (Tabella dei materiali) e 22 l di acqua. Mantenere la reazione sul ghiaccio fino all'uso.
- Eseguire il seguente programma di PCR: 98 gradi centigradi per 30 s, 11 cicli (98 gradi centigradi per 10 s, 60 gradi centigradi per 30 s e 72 gradi per 15 s) e 72 gradi per 10 min. Mantenere la reazione a 4 gradi centigradi quando è terminato.
NOTA: Per quanto riguarda il numero di cicli PCR: in genere eseguiamo 11 cicli, ma questo dovrebbe essere ottimizzato dall'utente. Provare a eseguire il minor numero possibile di cicli PCR.
- Purificazione del gel
- Eseguire 5, 10 e 20 . Eseguire il gel per circa 1 h a 145 V (fino a quando il blu bromofenolo raggiunge il fondo; questo colorante migra alla posizione 65 bp).
- Rimuovere il gel e incubare con macchia di gel acido nucleico (vedi Tabella dei materiali)in acqua per 10-15 min.
- Guarda il gel su un "Dark Reader" trans illuminatore (si consiglia vivamente di evitare UV in quanto ciò potrebbe danneggiare l'RNA) e ritagliare la banda della libreria a 150 bp. Preparare un sistema per eluire l'RNA dal gel come descritto nel passaggio 1.5 e trasferire il pezzo di gel al tubo da 0,5 mL.
- Centrifuga in una micro centrifuga alla massima velocità per 2 min. Rimuovere il tubo da 0,5 mL, che ora dovrebbe essere vuoto.
- Aggiungere 300 l' di acqua priva di nuclenono al tubo da 2 mL contenente il gel tritato e ruotare per almeno 2 h a temperatura ambiente o a 4 gradi durante la notte.
- Trasferire la sospensione dei pezzi di gel schiacciati in acqua in una colonna di spin e centrifugare per 2 min alla massima velocità.
- Aggiungete 1 ll di glicogeno, 30 di 3 M NaOAc e 975 L di ghiaccio freddo 100% di etanolo. Centrifuga per 20 min alla velocità massima a 4 gradi centigradi.
- Risospendere il pellet a 20 gradi l un valore di 10 mM Tris pH8. Utilizzare 1 : L per la misurazione della concentrazione e 1 L per il controllo di qualità.
4. Analisi dei dati
NOTA: la procedura di analisi dei dati descritta di seguito si basa sul sistema operativo Linux Ubuntu 16.04 LTS.
- Trattamento dei file di sequenza raw
- Scaricare i file di sequenza FASTQ generati durante l'esecuzione della sequenza. Se necessario, eseguire il demultiplexing con bcl2fastq2 (versione V2.2.18.12; un manuale può essere scaricato dal seguente collegamento: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
Utilizzare il seguente comando:
nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway_of_Run --ignore-missing-bcl --output-dir Pathway_of_Output_Directory --barcode-mismatches 1 --aggregated-tiles AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w 16 - Rimuovere le sequenze dell'adattatore utilizzando Cutadapt versione 19 1.15.Remove adapter sequences usingCutadapt 19 version 1.15. Un manuale può essere scaricato qui: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
Utilizzare il seguente comando:
Percorso_to_cutadapt/ cutadapt -a TGGAATTCTCGGGCCAAGG -n 5 -O 4 -m 10 -j 0 --nextseq-trim 10 -o Output_File_Read1_cutadapt.fastq.gz Input_File_Read1.fastq.gz Input_File_Read1 .fastq.gz
Si noti che la sequenza nel comando corrisponde all'adattatore HD 3' senza i 4 nucleotidi casuali; questi non verranno pertanto rimossi durante questo passaggio. - Utilizzare seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) per la rimozione dei nucleotidi casuali terminali nelle letture di sequenziamento. Utilizzare il comando seguente (nomi di variabili in grassetto):
seqtk trimfq -b 4 -e 4 Output_File_Read1_cutadapt .fastq > Output_File_Read1 _trimmed File con estensione fastq - Utilizzare il seguente comando awk per eliminare le sequenze più corte di 10 nt:
awk 'BEGIN 'FS ' "'t" ; OFS : "n" , intestazione , 0 ; getline seq ; getline qheader ; getline qseq ; if (lunghezza (seq) > 10) - intestazione di stampa, seq, qheader, qseq ' Output_File_Read1_triturato.fastq > Length_Filtered.fastq
- Scaricare i file di sequenza FASTQ generati durante l'esecuzione della sequenza. Se necessario, eseguire il demultiplexing con bcl2fastq2 (versione V2.2.18.12; un manuale può essere scaricato dal seguente collegamento: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
- Mappatura delle sequenze tagliate
- Scaricare il database corrispondente all'organismo di studio da miRBase come segue. Vai su http://www.mirbase.org/ftp.shtml e scarica il file 'mature.fa'. Si noti che le sequenze sono indicate nella notazione RNA. Sostituire i residui U con T con il seguente comando:
sed -i '/>/! s/U/T/g' mature.fa
NOTA: Questo produrrà un elenco completo di tutti i miRNA in miRBase, provenienti da una varietà di organismi. - Selezionate le sequenze di miRNA del vostro organismo di interesse con il seguente comando:
awk 'nome_dell'organismo:print; nr[NR'1]; next; NR in nr' mature.fa >mature_name_of_the_organism_mirs.fa - Eseguire il mapping delle letture al file creato sopra utilizzando Bowtie220 (versione 2.3.0) senza corrispondenze. Creare innanzitutto un indice per il file con il comando seguente:First, build an index for your file with the following command:
bowtie2-buildmature_name_of_the_organism_mirs.famature_name_of_the_organism_mirs - Allineare le letture di sequenziamento al database, richiedendo che una lettura sia mappata interamente a un miRNA del database, senza alcuna corrispondenza. A tal fine, utilizzare il seguente strumento:
bowtie2 -N 0 -L 10 --score-min C,0,0 --end-to-end --time -xmature_name_of_the_organism_mirs -U Length_Filtered.fastq -S Length_Filtered_FILTERED _ALIGNMENT.sam
NOTA: l'opzione: --score-min C,0,0 assicura che l'allineamento sia senza corrispondenze. Per una spiegazione dei vari parametri dello strumento, visitare il seguente sito Web: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml - Per eliminare le letture non allineate, utilizzare il comando seguente:
Visualizzazione samtools -F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT.sam > Reads_aligned_to_Mirs.sam
NOTA: a seguito di questi passaggi, ora dovresti aver ottenuto le letture allineate, corrispondenti ai miRNA.
- Scaricare il database corrispondente all'organismo di studio da miRBase come segue. Vai su http://www.mirbase.org/ftp.shtml e scarica il file 'mature.fa'. Si noti che le sequenze sono indicate nella notazione RNA. Sostituire i residui U con T con il seguente comando:
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Representative Results
I passaggi critici sono l'isolamento della piccola frazione di RNA del materiale RNA totale iniziale (Figura 3) e del prodotto biblioteca finale desiderato (Figura 4). Entrambi i passaggi comportano la purificazione del gel di poliacrilammide; piccolo RNA è isolato dal 15% di gel di urea TBE, mentre le librerie finali sono isolate dai gel TBE nativi del 6%. Piccolo RNA isolato dal gel può essere analizzato su un piccolo chip di elettroforesi capillare di RNA (Tabella dei materiali; Figura 3 B). Ciò consentirà agli utenti di stimare la quantità di piccolo RNA recuperato e la percentuale di miRNA nella preparazione.
La purificazione del gel del prodotto finale della biblioteca è un passo delicato in quanto si formano una serie di prodotti aggiuntivi che migrano vicino alla biblioteca desiderata. È importante non sovraccaricare il gel in quanto ciò aumenterà il rischio di contaminare la libreria con altre specie come i dimeri di adattatori. Ad esempio (Figura 4), quantità crescenti di libreria amplificata PCR (da B. napus RNA) sono state caricate sul gel e il prodotto corrispondente alla dimensione prevista (150 bp) è stato tagliato (Figura 4A). Dopo l'elusione, la libreria purificata è stata controllata su un chip di elettroforesi gel capillare; oltre al prodotto previsto di 150 bp, è stata osservata una percentuale crescente di una specie di 130 bp, corrispondente ai dimeri adattatori, con il caricamento di quantità crescenti di prodotto PCR(Figura 4B,C).
Abbiamo testato se il protocollo TS5 funziona allo stesso modo con reagenti fatti in casa come con il reagente dai kit. A tal fine, abbiamo preparato librerie da una miscela di RNA piccoli sintetici 1-6, ogni regalo senza o con una modifica 2'OMe, come fatto nel nostro studio precedente12. La figura 5 mostra la proporzione di letture corrispondenti a ciascuno di questi RNA ottenuti in precedenza e con le nuove librerie effettuate utilizzando reagenti provenienti dai kit TS e Nf o da altri fornitori. Come si può vedere, risultati molto simili sono stati ottenuti.
La figura 6 mostra un confronto tra le prestazioni del protocollo TS5 e il protocollo Standard TS per il rilevamento di miRNA vegetali (A. thaliana e B. napus), modificati da 2'OMe, e di miRNA umani non modificati. Abbiamo anche testato il rilevamento di piRNA, 2'-OMe modificati in campioni umani. Come si può vedere, TS5 si comporta significativamente meglio di TS per il rilevamento di 2'OMe RNA, ma non per gli RNA non modificati. Tuttavia, anche per gli sRNA non modificati, anche se non viene rilevato un numero maggiore di RNA, i numeri letti ottenuti probabilmente riflettono meglio i livelli di espressione con TS5 rispetto a TS a causa di livelli più bassi di distorsione.
Figura 1 . Rappresentazione schematica del flusso di lavoro di preparazione della libreria sRNA per il sequenziamento Illumina. In primo luogo, gli sRNA sono isolati da una fase di purificazione del gel. In questo caso, viene indicato l'intervallo di dimensioni dei miRNA, ma qualsiasi altra gamma di dimensioni potrebbe essere selezionata, a seconda degli RNA di interesse. Viene quindi eseguita una fase di controllo qualità (QC) per verificare la qualità e la quantità di sRNA isolati. Durante la preparazione della libreria, un adattatore precerto (App) 3' viene prima legato allo sRNA. Quindi, un adattatore da 5' viene legato. Successivamente la trascrizione inversa viene eseguita utilizzando un primer complementare all'adattatore 3', seguito dall'amplificazione PCR, durante la quale vengono aggiunte le sequenze Illumina P5, P7 e index ('In'). La libreria risultante viene purificata in gel, seguita da una fase di controllo qualità. Quindi la libreria viene sequenziata e i dati vengono analizzati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Bias a causa della piegatura co-sRNA adattatore dipendente dalla sequenza. Nella miscela di legatura dell'adattatore, gli adattatori si concliteranno con gli sRNA in un modo che dipende dalla sequenza dell'adattatore e dello sRNA. Pertanto, diversi sRNA (illustrati dagli esempi a, b e c; indicati da diverse tonalità di verde) si accoppiano in modo diverso con un determinato adattatore (l'adattatore 3' è indicato in rosso, l'adattatore 5' è indicato in blu). Le frecce nere indicano giunzioni di ligazione. Questo può portare a un contesto favorevole o sfavorevole per la legatura. Poiché RNL2 sembra preferire un ambiente a doppio spiaggiamento, la legatura 3' dovrebbe essere più efficiente per gli RNA a e b rispetto all'RNA c. Con RNL1 che ha una preferenza per una singola regione spiaggiata intorno alla giunzione di legatura, la legatura dell'adattatore 5' può essere più efficiente per l'RNA a, seguita da b e meno efficiente per c. Insieme questo può provocare una sovrarappresentazione di sRNA a, un rappresentazione dell'RNA b e una sottorappresentazione dell'RNA c nella libreria finale, anche se i tre RNA sono presenti in quantità uguali nel campione originale di RNA. Si noti che in modo simile, un determinato sRNA sarà rappresentato in modo diverso quando si modifica la sequenza dell'adattatore (ad esempio, aggiungendo codici a barre diversi). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Isolamento di piccolo RNA e controllo di qualità. (A). Separazione elettroforetica dell'RNA totale del napus Brassica (10 g) su un gel di poliacrilammide denatura TBE del 15%. Un piccolo manicio di RNA (vedi Tabella dei materiali) è stato migrato insieme come marcatore di dimensioni molecolari. Dopo la migrazione il gel è stato macchiato e l'RNA è stato visualizzato su un illuminatore trans. La regione da 17 a 29 nucleotidi è stata tagliata (indicata da un rettangolo rosso) e l'RNA è stato eluito. (B). La qualità dell'RNA purificato è stata controllata dall'elettroforesi del gel capillare. Si noti che questa analisi fornisce informazioni sulla percentuale di miRNA nel campione (93% in questo caso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . La purificazione del gel di una piccola libreria di RNA B. napus preparata seguendo il protocollo TS5 e il controllo di qualità. (A). La quantità crescente di una libreria amplificata PCR da B. napus piccolo RNA sono stati caricati su un gel TBE nativo del 6%; 2,5 Ll (a), 5 L (b), 10 L (c) o 20 -L (d) prodotto PCR. A fianco è stata migrata una scala di 50 bp. I prodotti PCR che migrano nella posizione prevista di 150 pb sono stati isolati (rettangolo rosso), il DNA è stato eluito e purificato. (B). Controllo di qualità della biblioteca purificata; rappresentazione del gel. (C). Rappresentazione electropherogramma della stessa analisi. Come si può vedere, il prodotto 150 pb è sempre più contaminato dai dimeri dell'adattatore (130 bp) poiché grandi quantità di prodotto PCR vengono migrate su gel. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Il protocollo TS5 funziona allo stesso modo con i reagenti dei kit TS e Nf o con i reagenti di altri fornitori. Istogrammi che rappresentano la percentuale del numero totale di letture grezze (prima del taglio) corrispondenti all'RNA(OMe)1-6 con protocollo TS5 seguito da reagenti dei kit TS e Nf (barre blu) o reagenti di altri fornitori (barre arancioni). Per fare un confronto, i risultati del nostro studio precedente sono indicati da barre grigie. Vengono mostrati anche i numeri totali delle letture corrispondenti a RNA1-6(RNA totale)o RNA-OMe1-6(RNA-OMe totale). Sono riportati i valori medi di almeno due esperimenti indipendenti. Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard. Parte di questa figura è stata modificata da Dard-Dascot et al, 201812Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . Confronto tra il rilevamento di miRNA del protocollo TS5 con il metodo TS classico. (A). È stata determinata la proporzione di letture che si mappano ad A. thaliana, B. napus o H. sapiens miRNA in miRBase. Abbiamo anche mappato le letture delle librerie umane a piRBase per il rilevamento del piRNA. Si noti che A.thaliana e B.napus miRNA, così come piRNA umani sono 2'-OMe modificati, in contrasto con i miRNA umani. Sono indicati i valori medi di almeno due esperimenti indipendenti e le barre di errore rappresentano le deviazioni standard. (B). Sono stati identificati i numeri dei miRNA (o piRNA). Abbiamo determinato il numero di miRNA noti delle diverse specie identificate con protocolli TS o TS5. Si noti che per A. thaliana, B. napus o H. sapiens, 427, 92 e 2588 miRNA sono stati registrati rispettivamente in miRBase. 0,5 milioni di letture dalle librerie di Servizi di controllo rete o TS5 sono state mappate a B. napus miRNA in miRbase, 1 milione di letture sono state mappate al database A. thaliana o umano. Sono indicati i valori medi di almeno due esperimenti indipendenti con deviazioni standard rappresentate da barre di errore. Questa cifra è stata modificata da Dard-Dascot et al, 201812. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome oligonucleotide | 5' modifica | 3' modifica | sequenza da 5 a 3' | Purificazione | |||||
| Adattatore HD (TS5) da 5' | 5AmMC6 (informazioni in inglese) | [5AmMC6] GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCrNrNrNrN (si noti che questo oligo è un chimerico DNA-RNA; i tre nt sterminali terminali 3' sono RNA) | Hplc | ||||||
| Adattatore HD (TS5) da 3' | fosfato | 3AMMO | [Phos]rNrNrNTNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG[3AaMO] (si noti che questo oligo è un chimerico DNA-RNA; i quattro terminali sono RNA) | Hplc | |||||
| Adattatore MRL (TS7) da 5' | 5AmMC6 (informazioni in inglese) | [5AmMC6] GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCNNNrArCrGrUrUrArC (si noti che questo oligo è un chimerico DNA-RNA; i sette 3' nt terminali sono RNA) | Hplc | ||||||
| Adattatore MRL (TS7) da 3' | fofoste | 3AMMO | [Phos] GTATCGTNNNNTGGAATTCTCGG[3AmMO] | Hplc | |||||
| Primer RT | GCCTCTCGGCACCCGAGAATTCCA | Hplc | |||||||
| Primer Universale P5 | AATGATACGGCACCACCGACATCGTTGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | Hplc | |||||||
| Primer indice P7 | CAAGCAGAGAAGACGGCATGANNNNGGGAGGACTTGGCACCCGAGAATTCCA (NNNNNN - indice) | Hplc | |||||||
| indice 1: CGTGAT | |||||||||
| indice 2: ACATCG | |||||||||
| indice 3: GCCTAA | |||||||||
| indice 4: TGGTCA | |||||||||
| indice 5: CACTGT | |||||||||
| indice 6: ATTGGC | |||||||||
| indice 7: GATCTG | |||||||||
| indice 8: TCAAGT | |||||||||
| indice 9: CTGATC | |||||||||
| indice 10: AAGCTA | |||||||||
| indice 11: GTAGCC | |||||||||
| indice 12: TACAAG | |||||||||
Tabella 1. Oligonucleotidi usati con questo protocollo.
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Discussion
La preparazione della piccola libreria di RNA rimane impegnativa a causa della distorsione, introdotta principalmente durante le fasi di legatura dell'adattatore. Gli RNA con una modifica di 2'OMe alla loro estremità 3' come miRNA vegetali, piRNA in insetti, nematodi e mammiferi e piccoli RNA interferenti (siRNA) negli insetti e nelle piante sono particolarmente difficili da studiare perché la modifica di 2'-OMe inibisce la legatura dell'adattatore 3'. Un certo numero di soluzioni sono state proposte in letteratura per migliorare i protocolli di preparazione della libreria sRNA, ma la maggior parte dei kit disponibili in commercio sono ancora basati sul protocollo TS classico, che ha una forte distorsione. Esistono alcuni kit 'low bias', tuttavia, tra cui il kit Nf con adattatori randomizzati e PEG nelle reazioni di legatura, e alcuni kit sono apparsi di recente che evitano la legatura dell'adattatore del tutto12. Abbiamo riferito in precedenza che Nf rileva più miRNA diversi rispetto al protocollo Standard TS, ma il protocollo 'S' (senza legatura dell'adattatore) ha funzionato relativamente male a causa di una formazione significativa di prodotti collaterali12. Sorprendentemente, al momento della modifica i protocolli di TS avevano un rilevamento più sensibile di 2'OMe sRNA rispetto agli altri protocolli, ma non di sRNA normali. Abbiamo scelto qui per descrivere in dettaglio il protocollo TS5, in cui gli adattatori sono randomizzati alle loro estremità, PEG viene utilizzato nelle reazioni di legamento e l'eccesso 3' adattatore viene eliminato dalla purificazione sulle perline. Si noti qui che un protocollo diverso (TS7), utilizzando adattatori MRL può funzionare leggermente meglio rispetto al protocollo TS5. Tuttavia, poiché ci sono solo piccole differenze tra i due e perché con TS7, è più difficile separare il prodotto biblioteca desiderato dai dimeri adattatori, abbiamo preferito qui per descrivere in dettaglio il protocollo TS5. Tuttavia, gli utenti possono, se lo si desidera, sostituire le schede TS5 con le schede TS7. Si noti che questi sono leggermente più a lungo che porta a un prodotto di libreria finale di 170 pb invece di 150 bp.
La possibilità di eseguire il protocollo TS5 o TS7 con materiali "fatti in casa" permette di ridurre sostanzialmente i costi. Tuttavia, ci può essere una maggiore variabilità in termini di qualità con materiali fatti in casa; soprattutto l'adattatore pre-adenylato fatto in casa può essere soggetto a qualità variabile a causa di efficacie variabili di pre-adenilazione. Si raccomanda quindi di preparare un grande stock e se viene preparato un nuovo stock, confrontare le sue prestazioni con quella precedente. A questo scopo può essere utilizzato un campione di RNA di controllo.
Uno svantaggio dei protocolli qui descritti è la formazione relativamente forte di prodotti collaterali e la difficoltà di separare la libreria desiderata da questi prodotti. Occorre prestare attenzione a non sovraccaricare il gel di acrilammide per la purificazione. Recentemente, sono stati sviluppati adattatori modificati che hanno una tendenza fortemente ridotta a formare dimeri21. Una modifica di 2'-OMe alla fine 3' dell'adattatore 5' combinata con una modifica del metilfosofato all'estremità 5' dei dimeri dell'adattatore 3' soppressi in modo efficiente. Sarà interessante testare tali adattatori modificati nel protocollo descritto nel presente documento.
Le fasi di purificazione del gel nel protocollo TS5 sono relativamente laboriose. Se l'uso di adattatori modificati riduce in modo efficiente la formazione di dimeri di adattatori, la purificazione del gel della libreria finale potrebbe non essere più necessaria. Inoltre, in alternativa alla fase di purificazione del gel per isolare il piccolo RNA (passaggio 1), esiste una strategia che utilizza perline magnetiche per arricchire per piccoli RNA (https://ls.beckmancoulter.co.jp/files/appli_note/Supplemental_Protocol_for_miRNA_.pdf). Non abbiamo usato questo metodo noi stessi, ma vale la pena di essere testati e se funziona bene potrebbe semplificare significativamente il protocollo.
In conclusione, mentre il protocollo TS5 potrebbe essere ulteriormente migliorato, si comporta meglio dei kit disponibili in commercio, almeno quelli testati nella nostra precedente analisi comparativa, per il rilevamento dello sRNA 2'OMe. Può essere seguito utilizzando materiali fatti in casa, consentendo una significativa riduzione dei costi. Per comodità, e forse prestazioni più costanti, possono essere utilizzati reagenti dei kit TS e Nf.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Center for Scientific Research (CNRS), dal Francese Alternative Energies and Atomic Energy Commission (CEA) e dall'Università Parigi-Sud. Tutta la preparazione della biblioteca, il sequenziamento dell'illuminazione e le analisi bioinformatiche per questo studio sono stati eseguiti presso l'impianto I2BC Next-Generation Sequencing (NGS). I membri della struttura NGS I2BC sono riconosciuti per la lettura critica del manoscritto e suggerimenti utili.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes | |||
References
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