Summary
Vi giver en skitse af den kliniske protokol for ikke-invasiv vurdering af menneskets ægmodenhed ved hjælp af polariseret lys mikroskopi.
Abstract
Den optimale timing af ICSI sperm injektion (ICSI) er af en alvorlig bekymring for fertilitets programmer, fordi urettidig sperm indrejse mindsker ægets udviklingsmæssige kompetence. Tilstedeværelsen af det første polære legeme (PB) sammen med den meiotiske spindel indikerer færdiggørelse af oocyt modning og æggets parathed til befrugtning. I klinisk praksis er det almindeligt at antage, at alle oocytter, der viser et PB, er modne metafase (MII) oocytter. PB ekstrudering går dog forud for dannelsen af den bipolære MII-spindel. Denne asynj gør den blotte tilstedeværelse af PB en upålidelig markør for oocyt modenhed. Ikke-invasiv spindel afbildning ved hjælp af polariseret let mikroskopi (PLM) giver mulighed for hurtig og nem inspektion af, om PB-visning oocyt faktisk samles en meiotisk spindel før ICSI. Her præsenterer vi en standardprotokol til at udføre Human Egg modenhed vurdering i det kliniske laboratorium. Vi viser også, hvordan man optimerer tiden af ICSI med hensyn til oocyte udviklingsmæssige fase for at forhindre for tidlig sædinjektion af sene modning oocytter. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, selv umodne oocytter ekstrudering PB in vitro kan være klinisk udnyttet. Bekræftelse af, at MII spindel er til stede før sædinjektion og individuel justering af tidspunktet for ICSI er særlig vigtigt i dårlig prognose in vitro fertilisering (IVF) cyklusser med et lavt antal oocytter til rådighed for befrugtning.
Introduction
For at blive et befrugte ligt haploide æg, har diploide oocyt til at ekstrudere halvdelen af sine genetiske oplysninger i en tilstødende celle, kaldet det første polære legeme (PB), og justere kromosomer i ækvator af den bipolar metafase II (MII) spindel. Mens PB tydeligt kan observeres ved konventionel lysmikroskopi, kræver påvisning af genetisk materiale og cytoskelet strukturer typisk invasive forberedende procedurer, der er uforenelige med oocyt's videre anvendelse til fertilitetsbehandling. I klinisk praksis anses tilstedeværelsen af PB derfor for at være et kendetegn for oocyt-modenhed. Men, levende billeddannelse af mikrotubulus og kromosom dynamik under Human oocyt modning afslørede, at PB bliver synlig et par timer før bipolar MII spindel er monteret og kromosomer er justeret1. Ikke desto mindre, i det transmitterede lys, de MII anholdt æg er umulig at skelne fra oocytter, som netop er trådt processen med kromosom adskillelse. Således, en kohorte af oocytter, klassificeret som MII oocytter baseret kun på PB tilstedeværelse, kan indeholde latematuring oocytter, der endnu ikke har afsluttet deres udvikling og dermed er ikke klar til befrugtning.
Forsinkelsen af oocyt modning vil sandsynligvis påvirke populationen af fattige responderende med et lavt antal MII oocytter og en høj andel af umodne oocytter indsamlet uventet i stimulerede cyklusser2. In vivo, kun en enkelt, bedste kvalitet æg opnår modenhed og bliver ovuleret. I in vitro fertilisering (IVF) cyklusser, kontrolleret ovarie hyperstimulation bruges til at rekruttere flere oocytter til modning. Gonadotropin Surge udløser en genoptagelse af det meiotiske program og ægprogenitorer formodes at nå MII anholdelse fase inden for 36 timer3. Oocytter, som er hentet fra præovulatoriske follikler, udgør dog ofte et sortiment af pbviser MII oocytter og umodne oocytter, enten ved metafase I (MI) eller avlsmateriale vesikelprotein Stadium (GV) (figur 1). Kun MII oocytter udsættes for intracytoplasmisk sædinjektion (ICSI), mens umodne oocytter typisk kasseres. Men når der dyrkes in vitro, MI oocytter er almindeligt observeret at Extrude PB in vitro. Til trods for deres generelle mindreværdighed er de sene modne oocytter, som spontant afsluttede den første meiotiske division under natten, blevet anvendt med succes som sidste ressource-oocytter, og levende fødsler er blevet rapporteret4,5 ,6,7,8. Derfor, den ubelejlige injektion af sædcellerne kan være en primær årsag underliggende dårlige udviklingsmæssige resultater af sene-modning oocytter rapporteret i tidligere undersøgelser9,10,11.
Polariseret lys mikroskopi (PLM) kombineret med en billedbehandling software giver mulighed for ikke-invasiv visualisering af den meiotiske spindel i levende oocyte. Den dobbelte refleksion genereres af samspillet mellem polariseret lysstråle med den højt ordnede samling af microtubuler, der bygger den bipolare spindel. Da det polariserede lys er af normal intensitet, kan teknikken anvendes sikkert i kliniske miljøer for at se dynamikken i divisions apparatet11,12,13,14. Tilstedeværelsen af MII spindel birefringence inden for oocyt er blevet identificeret som en markør for et æg's udviklingsmæssige kompetence9,15,16,17,18, 19,20,21,22,23. Det er således blevet antydet, at ikke-invasiv meiotisk spindel afbildning kan anvendes til ægkvalitetskontrol i klinisk praksis11,14,20.
Da tidslinjen for den mikrotubulære dynamik under oocyt-meiose er blevet løst1, kan det observerede PLM-mønster være bedre relateret til tidsforløbet af mi til MII-overgangen. Kort efter PB-emission bliver den spirende MII-spindel ikke detekterbar af PLM. Men hvis oocytterne holdes i kulturen, kan signalet fra birefringence dukke op senere, når den bipolære MII-spindel samler9,10,11. I oocytter, der Ekstruderer en PB in vitro, kan fraværet af spindlen således kun være midlertidig, hvilket svarer til den fysiologiske overgang af den sene modning oocyt fra mi til MII-stadiet. Hvis MII-spindel signalet ikke er målbart, kan sædinjektion udskydes til et senere tidspunkt, der giver ekstra tid til MII-spindel dannelsen. PLM-Aided optimering af ICSI tid maksimerer chancen for sene-modning oocytter at være klinisk udnyttet og gøre en forskel for dårlig prognose patienter9.
Nedenfor, vi giver en trin-for-trin protokol om, hvordan man udfører ikke-invasiv spindel Imaging i humane oocytter. Vi viser også, hvordan PLM kan anvendes for at undgå risikoen for for tidlig befrugtning af oocytter, der er sent modne.
Protocol
Denne protokol beskriver den kliniske procedure, som er en "add-on" til standard IVF-behandling. Det skal udføres af erfarne medarbejdere i overensstemmelse med god laboratoriepraksis og kliniske retningslinjer24,25. Det anbefales at indhente skriftligt informeret samtykke fra de støtteberettigede patienter. Denne protokol blev godkendt af den institutionelle etiske komité.
1. udtagning af æg og denudering
- Inducerer ovariestimulation ved hjælp af konventionelle stimulerings protokoller3. Justere dosis til individuel respons. Når to eller flere follikler, visualiseret ved ultralydsscanning, nå en diameter på 18 mm, inducerer oocyt modning med anvendelse af 250 μg humant choriongonadotropin (HCG). Planlæg oocyt pick-up (opu) ved 35 − 36 h post HCG injektion.
- Saml hentede Cumulus-oocyte komplekser (COCs) i CO2-uafhængig håndtering medium (tabel over materialer). Efter en kort inkubationsperiode (10 − 15 min.) i en CO2-uafhængig kuruator, udsætter kort (op til 30 s) indsamlede cocs til hyaluronidase opløsning (tabel over materialer). Under et stereomicroskop, mekanisk fjerne Cumulus-Corona celler ved forsigtigt pipettering COCs med en 200 μL filter spids.
- Brug af denudationsmikropipetter med en gradvist faldende diameter (200 μm, 180 μm og 150 μm), Strip forsigtigt oocytterne fra de resterende follikulære celler og vask oocytterne 3x i håndterings mediet.
- Vurdere antallet og den udviklingsmæssige status af de udledte oocytter i henhold til tilstedeværelsen eller fraværet af kernen og første PB (figur 1).
- Kontroller inklusionskriterierne for PLM-undersøgelse. Foretage en ægløbetids vurdering, hvis der er (1) en uventet dårlig respons på konventionel stimulation med færre end 6 MII oocytter indsamlet ved OPU og (2) en anamnese med tidligere befrugtnings svigt eller oocytumodenhed.
- Anbring GV, MI og MII oocytter i separate brønde i en IVF-skål, der hver indeholder 500 μL af det præligevædede CO2-afhængige dyrkningsmedium (tabel over materialer), som er dækket med mineralolie (tabel over materialer).
- Der inkubates for yderligere 3 − 4 timer ved 37 °C i en befuret atmosfære på 5% O2 og 6% Co2.
2. forberedelse til PLM-undersøgelse og EFTERfølgende ICSI
Bemærk: den protokol, der er angivet her, beskriver den PLM-bedømmelse, der udføres ved hjælp af OCTAX Polar AIDE-systemet (tabel over materialer). Alternativt kan andre kommercielt tilgængelige spindel visningssystemer anvendes.
- Forbered plader til embryo dyrkning.
- Afhængigt af antallet af oocytter, der skal undersøges (i alt MII oocytter, og MI oocytter, der Ekstruderer en PB i præinkubations perioden), skal der forberedes enten en 4-brønd plade eller en 12-brønd plade, fyld hver brønd med 500 μL eller 30 μL kulturmedium, henholdsvis og dækkes med tidligere ækvibreret mineralolie.
- Sørg for, at både dyrkningsmedium og mineralolie er blevet ækvibreret i CO2 inkubator natten over. Opbevar den forberedte skål i CO2-afhængige inkubator i mindst 2 h. antal brøndene, hvis det er nødvendigt for at spore den udviklingsmæssige skæbne af individuelle oocytter.
- Forbered ICSI skålen.
- Brug tildelt plastik skål og lav 5 μl dråbe af forvarmet håndterings medium for hver PB-visning oocyt og en ekstra dråbe til nål vask. Lav en ekstra dråbe af polyvinylpyrrolidon (PVP) opløsning (tabel af materialer) for sperm immobilisering forud for ICSI (tilsæt sperm lige før ICSI) og overlay med forvarmet mineralolie.
- Opbevar den forberedte ICSI-skål i CO2-uafhængig inkubator i mindst 20 min. antal brøndene, hvis det er nødvendigt for at spore oocytterne efter ICSI.
- Forbered PLM undersøgelses skålen.
- Brug den tildelte glasbund skål og lav 5 μL dråber af forvarmet håndterings medium for hver PB-visning oocyte. Overlay med forvarmede mineralolie.
- Opbevar skålen i den CO2-uafhængige inkubator i mindst 20 min. antallet af dråber, hvis det er nødvendigt for at spore oocytterne efter PLM undersøgelse.
- Sæt mikroskopet klar til PLM undersøgelse.
- Skift den opvarmede fase på det inverterede mikroskop på godt i forvejen for at opnå korrekt opvarmning temperatur. Sørg for, at indstillingerne justeres nøjagtigt for at vedligeholde 37 °C i håndterings mediet i PLM/ICSI-skålen under micromanipulation-procedurer.
- Monter den sterile bedrift og ICSI-kanylen i mikroinjektionholdere, og Bring dem i fokus. Alternativt kan du bruge en ruge nål.
- Vælg den relevante målsætning (20x og 25x er de mest velegnede), og sørg for, at kondensatoren er i en lys felt position.
- Indsæt grønt interferens filter (lyset bliver grønt), og Indstil skyderen flydende krystal analyse til arbejdsposition.
- Indstil udløseren til ~ 50%, og Juster cirkulær polarisator for at reducere baggrundsstøj.
- Indstil computeren klar til PLM-undersøgelse.
- Start billedbehandlings softwaren.
- Vælg video | Video kilde | polarAIDE i videomenuen i den øverste menubjælke.
- Skift til live video ved at gå til video siden og aktivere spindel og Zona analyse ved at trykke på ikonet (supplerende figur 1) på værktøjslinjen video.
- Vælg visningstilstand for dynamisk skalering under spindel afbildning: (1) rød (birefringence)/grøn (baggrund) kombineret visning eller (2) hvid (birefringence)/og sort (baggrund) visning. Den dynamiske scorings tilstand bruges til automatisk scoring af zona pellucida.
3. undersøgelse af ægmodenhed
- Efter præinkubations tiden (3 − 4 timer) udføres en PLM-undersøgelse, der afslører oocyt-modenhed på standard tidspunktet for ICSI (39 − 40 timer efter hCG-udløser).
- Overfør alle oocytter til individuelle dråber på PLM skålen og Placer den under det inverterede mikroskop, der er forberedt til spindel afbildning. Husk at fjerne plastiklåget fra glasbunden, inden du påbegynder undersøgelsen.
- Bring den første oocyt i fokus. Hvis det er svært at søge efter cellen under grønt lys, skal du trække det grønne filter ud midlertidigt. Sørg for, at det grønne filter indsættes før analyse.
- Observere den detekterede oocyt birefringence billede (rød/orange på grøn baggrund), da det er computer-behandlet og vises i realtid på computerskærmen. Husk, at signalet ikke er synligt i øjestykket.
- Hvis meddelelsen, der annoncerer lys eksponering er for lav/høj dukker op, justere lysstyrken til den passende intensitet ved hjælp af mikroskopet lysintensiteten knap.
- Brug en bedrift og ICSI nål til at dreje oocyt så PB er i klokken 12 position og fokus til PB.
- Hvis spindel birefringens ikke er synlig ved første øjekast i nærheden af PB, skal du forsigtigt dreje oocyt rundt om hver akse ved let at berøre zona pellucida for at sikre, at det polariserede lys er justeret med matrix spindel fibrene (supplerende video ). Erklære fraværet af MII spindlen, så længe oocyt undlader at vise spindel signalet trods streng rotation.
- Baseret på det observerede birefringens mønster klassificerer oocytterne i følgende kategorier (figur 2): (A) oocytter med skarpt signal af bipolar TØNDEFORMET MII-spindel med klart afgrænsede grænser og jævn fordeling af birefringence ; B) oocytter med dysmorfe, apolære og gennemsigtig MII-spindel med uregelmæssige grænser og ujævn fordeling af signalet C) oocytter uden påviselige MII-spindel birefringence i ooplasm D) kaldelse i/telophase i oocytter, der viser en mikrotubulær bro (en bindevæv mellem første PB og oocyt) i stedet for MII-spindel.
Bemærk: oocyte med detekterbart MII-spindel signal (klasse A eller B) er egnet til umiddelbar ICSI. - Tag et snapshot (F9), eller Optag video til en rapport og/eller en efterfølgende billedanalyse. Opbevar dokumentation af billedet mønster for at reducere subjektivitet af operatøren.
- Flyt til positionen for en næste oocyt, og Gentag trin 3.6 − 3,9.
4. optimering af ICSI-timing
- Overføre alle spindel-positive oocytter (lønklasse A eller B, trin 3,8) ind i ICSI skålen og underkaste dem ICSI i henhold til standardprotokollerne24,25.
- Hvis oocytterne ikke viser noget detekterbart MII-spindel signal, skal du anbringe PLM-skålen i den CO2-uafhængige inkubator og flytte ICSI til et senere tidspunkt.
- Udfør PLM re-eksamen ~ 2 − 3 h senere efter trin 3.3 − 3.9. Hvis nogle Oocyte (s) stadig mangler en MII-spindel, skal du yderligere forsinke ICSI for yderligere 1 − 2 h.
- Overfør alle oocytter til ICSI skålen og Injicer dem i henhold til standardprotokollerne24. Hvis PLM skålen er kompatibel med bøjningsvinklen på mikroinjektionsnål, skal du straks udføre ICSI i PLM skålen efter at have skiftet til en lys felt tilstand.
- Ved ICSI overføres oocytter til tilberedte plader til embryo dyrkning og kultur indtil blastocyst-stadiet.
Representative Results
Polariseret lys mikroskopi gør det muligt straks at inspicere, om oocyt afsluttet nuklear modning og samlet MII spindel før ICSI. På grund af sin ikke-invasive karakter, det kan bruges til sikkert at vurdere det menneskelige æg's parathed til befrugtning i kliniske indstillinger11,12,13,14. Spindled oocytter er mere tilbøjelige til at give anledning til levedygtige embryoner end oocytter uden en spindel9,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23. oocytter med en distinkt bipolar spindel synes også at have en højere udviklings kompetence end oocytter med dysmorfe spindler9,21,22. Sammen kan spindel afbildning tjene som et redskab til at identificere oocytterne med det største potentiale til at blive befrugtet, gennemgå præimplantations udvikling og understøtte fuldtids graviditet9,15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23.
Den rapporterede incidens af spindlen varierer (44 − 97%) afspejler mangfoldigheden af den undersøgt population9,15,16,17,18,19,20,21, 22 , 23 , 26 , 27 , 28. in vivo modnet oocytter fra normale responderende viser typisk bipolar MII spindel ved 40 h efter HCGTrigger 9,18,27,29. I langsomme respondere påvirkes puljen af oocytter, der er hentet fra præovulatoriske follikler, dog af modnings forsinkelse9,27. Her skal spindel billeddannelse udføres for at diskriminere de oocytter, der er arresteret i MII-fasen, fra dem, som gennemgår vigtig overgang (figur 3). Vi anbefaler fjernelse af follikulære celler straks efter hentning, og inkubation af MI og MII oocytter i separate brønde for at kunne skelne de in vivo modnet oocytter og sene-modning oocytter ekstrudering PB in vitro, kort før ICSI. I tilfælde af denudation udføres lige før ICSI, disse to populationer af oocytter er umulig at skelne baseret på PB udseende.
De fase specifikke ændringer af PLM-mønsteret skal fortolkes i forbindelse med viden om spindel dynamikken under meiotisk modning. Under interkinetikken gennemgår divisions apparatet en omfattende strukturel reorganisation, og PLM-signalet forsvinder i forbigående1,9,10,11. Således, i udviklingsmæssigt forsinkede oocytter ekstrudering PB in vitro, fraværet af MII spindel signalet ikke nødvendigvis afspejler cellulære forstyrrelser, men det kunne indikere oocyte progression fra MI til MII fase (figur 3). Hvis sædcellerne injiceres på et ufysiologisk tidspunkt, er æggets udviklingspotentiale kompromitteret. Udsættelse af ICSI giver sene modning oocytter med mere tid til at samle en MII spindel, hvis tilstedeværelse er forbundet med bedre kliniske resultater9,10,11. I den kliniske undersøgelse med langsomme/dårlige responderende udviklede næsten 60% af de oprindeligt spindel-negative oocytter spindel signalet, før PLM blev fornyet gennemgang ca. 2 h senere9. Afhængigt af udviklingsstadiet og den generelle egnethed af sene-modning oocytter, den MII spindel udseende efter PB ekstrudering typisk tager 2 − 6 h (ikke offentliggjort observation). De oocytter, der udviser en mikrotubulus-bro (anaphase/telophase, grade D) under den første PLM-undersøgelse, kræver længere tid til at udvikle MII-spindel signalet end oocytter uden synlig spindel (nye spindler, grad C). Individuel justering af tidspunktet for ICSI til ægens udviklingsmæssige fase forhindrer for tidlig aktivering af oocyt og resulterer i en forbedret gødskning sats og vellykket embryo udvikling9.
Selv om sene-modning oocytter ekstrudering PB in vitro generelt har en lavere udviklingsmæssige kompetence end in vivo modnet oocytter, er satsen for embryo udvikling acceptabelt, hvis de formår at samle en detekterbar spindel før forsinket ICSI (blastulation sats på 41,32%)9. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, selv umodne oocytter, som normalt afvises for fertilitetsbehandling, kan være klinisk udnyttet, producere omsættelige embryoner, og give anledning til fuldtids graviditeter. Evaluering af den modale fase af hver enkelt oocyt er især gavnlig i dårlig prognose cyklusser giver et lille antal MII oocytter og/eller efter udførelse af en redning in vitro modning af umodne oocytter9.
Bortset fra ægløbetids vurdering anbefales spindel afbildning også før PB biopsi for at undgå spindel ødelæggelse i kaldelse i/telophase oocytter. I eksperimentel embryologi anvendes visualisering af den meiotiske spindel under ægenuklering og/eller spindel overførings procedure13.
Figur 1: Human oocyt modning. In vivo modnet oocytter (MII) udviser PB på tidspunktet for hentning. Umodne oocytter (GV, MI) kan spontant fuldføre modning in vitro. Skala bjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: oocyt klassifikation baseret på PLM-detekteret mønster. Repræsentative eksempler på oocyt-kvaliteter (A-D) baseret på spindel signalets udseende. PLM-detekteret mønster: (a) fremtrædende signal af bipolar spindel, (B) gennemskinnelige apolære MII spindel spindel, (C) ingen detekterbar spindel, og (D) mikrotubulus Bridge. Skala bjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: stadier af mi til MII overgang i oocyt modning. Udseendet af oocytter i lyse felt (øverste række), kombineret med et fluorescens signal af kromosomer (cyan) og microtubuler (magenta) (midterste række), og i polariseret lys (nederste række) vises. Hver oocyt blev første PLM-undersøgt og straks fast. Fiksede oocytter var (immuno) mærket med Hoechst (DNA) og anti-α-Tubulin-antistof (microtubuler). Den gule pil indikerer tilstedeværelsen af PB og den hvide pil fremhæver positionen af birefringerende microtubuler. Skala bjælke = 20 μm. Dette tal er blevet modificeret fra Holubcová et al., JARG 20199. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: korrelation af kromosom-microtubule organisation med birefringence mønster detekteret af polariseret lys mikroskopi. Udseendet af oocytter i det lyse felt kombineret med et fluorescerende signal for kromosomer (cyan) og mikrotubuler (magenta) (øverste række) og i polariseret lys (nederste række) vises. Hver oocyt blev fastgjort umiddelbart efter PLM-eksamen. DNA (Hoechst) og mikrotubulus (α-Tubulin) blev plettet. (A-C) oocytter med PLM-detekterbar spindel, men ikke-justerede kromosomer (a, B) eller løst fokuserede spindel poler (C); (D-F) unormale oocytter uden PLM-detekterbar MII-spindel, der viser underudviklet (d), apolære (E) eller ingen spindel (F). Den hvide pil fremhæver positionen af birefringerende mikrotubuler, og Asterisk (*) indikerer positionen af dekomprimeret kromatin. Skala bjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Birefringence strukturer i humane oocytter. Repræsentative eksempler på (A-D) birefringerende strukturer detekteret af PLM i humane oocytter. ZP = zona pellucida; PM = plasma membran (oolema); RB = refraktile kroppe, vakuoler. Hvid pil, meiotisk spindel i forskellige stadier af modning. (E) MII spindel forskydning med Polar krop (PB). F) spindel løsrivelse fra plasma membran. Skala bjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: skrivebordslayout af billedanalyse softwaren. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende video: PLM-undersøgelsesprocedure. Rotationen af oocyt er nødvendig for at udelukke tilstedeværelsen af spindlen (pil). Scale bar = 20 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Acentrosomal meiotisk spindel i humane oocytter er meget dynamisk og en delikat struktur1. Under suboptimale betingelser, de mikrotubulære fibre hurtigt depolymerize og meiotisk spindel disassembler30,31,32,33. Derfor er det afgørende vigtigt at sikre, at oocyt kulturen og micromanipulation betingelser, nemlig temperatur og pH er i det optimale område. For at minimere risikoen for spindel afbrydelse skal oocytterne opbevares i et temperaturkontrolleret miljø, der bevarer 37 ± 0,5 °C i oocyt-mediet. Brug af mikroskoper og mikroindsprøjtnings opsætning, der er udstyret med en opvarmet fase, er strengt påkrævet. Al manipulation med oocytter uden for inkubator skal udføres i et HEPES/MOPS-buffer medie for at undgå pH-fluctulationer. For at undgå potentielle negative virkninger af overdreven oocyt aflevering i omgivende tilstand, bør den samlede tid for PLM undersøgelse ikke overstige 10 minutter. Oocytterne skal analyseres på glasset bund skålen med plastiklåget fjernet, fordi positionering af en standard plast i strålen hæmmer billedanalyse. Fordi plastik og glasbund retter har forskellige termiske egenskaber, bør temperaturen kontrolleres direkte i dråberne af håndterings mediet i undersøgelses skålen.
Ud over laboratorieforhold kan proceduremæssige forskelle og operatørens micromanipulation-færdigheder have en indvirkning på PLM-undersøgelses nøjagtigheden. Kun højt monterede bipolære spindler kan være ikke-invasivt visualiseret. Observerede signal er proportional med graden af strukturel organisering af spindlen. Nascent, apolar, løsnet eller disarrayed spindler viser kun sløret birefringence eller slet ingen (figur 3 og figur 4). Udover, ufuldkommen justering af polariseret lys med mikrotubulus arrays producerer kun en gennemsigtig og dårligt defineret birefringence på trods af den faktiske tilstedeværelse af veludviklet bipolar spindel (figur 4). Medmindre korrekt orienteret, kan spindel signalet være let savnet og oocyt modenhed fejldiagnosticeret (supplerende video). For optimal spindel afbildning skal oocyt drejes korrekt rundt om hver akse. Da birefringence ikke er synlig i okular, skal operatøren Se computerskærmen, mens den udfører rotation af oocyt. Tidligere erfaring med micromanipulation og træning af spindel Imaging i overskydende in vitro modnet oocytter er ønskelig, før der skiftes til klinisk anvendelse.
Foruden spindlen udviser Cumulus-cellerne omkring oocyt, oolema, det inderste lag af zona pellucida og nogle cytoplasmiske strukturer (f. eks. refraktile kroppe, vakuoler) birefringence (figur 5a-D). Medmindre det er grundigt fjernet fra oocyt før billeddannelse, producerer tæt fastsiddende follikulære celler baggrundsstøj og kompromitterer meiotisk spindel detektering. Vær omhyggelig med ikke at forveksle en stor refraktiel krop for spindlen. Mange cytoplasmiske indeslutninger bosiddende i cytoplasmaet viser høj lysstyrke, som skarpt kontrasterer med den mørke baggrund. Meiotisk spindel, på den anden side udviser kun moderat signal, sløret grænser og typisk binder sig til oolema under eller støder op til den første PB. Lejlighedsvis, PLM undersøgelse afslører en brutto spindel afvigelse fra sin standard position (figur 5E, F). Hvis der er en større uoverensstemmelse mellem divisions apparatet og PB, hjælper PLM med at orientere oocyt for at undgå risikoen for spindel skade under mikroinjektion. Den relative placering af spindlen i oocyt synes ikke at påvirke udviklingspotentialet i de resulterende embryoner17,34. Men når spindlen kompetent løsnes fra oolema, forekommer befrugtning abnormiteter. Interessant, nogle dårlig kvalitet oocytter undergår kromatin dekompensation umiddelbart efter PB ekstrudering i stedet for at starte mikrotubulus kimdannelse (figur 4F). Ved hjælp af konventionel lysinduskopi og PB som den eneste markør for oocyt-modenhed vil sådanne subkompetente oocytter blive betragtet som gødede. På toppen af den rutinemæssige morfologiske vurdering tilføjer spindel Imaging derfor vigtige oplysninger om æggets modenhed og kan tjene som en indirekte markør for dens kvalitet.
Forekomsten af spindled MII oocytter vil sandsynligvis blive påvirket af undersøgelsens karakteristika (f. eks. genetisk baggrund, sygdomstilstand, mødres alder). Desuden vil andelen af udviklingsmæssigt forsinkede oocytter inden for kohorten påvirke det faktiske antal fundne spindel-negative oocytter9,27. Meiotisk spindel visualisering gør det muligt klart at identificere gødet oocytter anholdt i MII fase. Desuden kan den anden inspektion på et senere tidspunkt afsløre, om den spindel-negative oocyt er unormal eller kun for nylig har udviklet sig gennem mi/MII Transition9,10,11. Når det tillades at udvikle en spindel før ICSI, kan selv umodne oocytter, som rutinemæssigt kasseres, producere levedygtige embryoner9. I cyklusser med meget få oocytter til rådighed for befrugtning, fintimet ICSI af oocytter ekstrudering PB kan tjene som en redningsstrategi og alternativ til cyklus aflysning.
Ikke desto mindre bør udvidelse af præinkubations tiden ikke generaliseret til alle oocytter. In vivo modnet oocytter fra normale responderende udviser typisk en MII-spindel9,20,21,27. Her falder chancen for succesfuld spindel Imaging med tiden som følge af post-ovulatoriske in vitro aldring35. Hvis det er muligt, bør ICSI udføres på dagen for hentning og bør ikke overstige 9 timer (45 timer efter HCG), den periode, der er forbundet med et fald i resulterende embryo kvalitet36,37. Oocytter, der viser særskilte bipolære spindler, bør underkastes ICSI uden yderligere forsinkelse. Kort sagt, individualiseret optimering af ICSI timing er umagen værd i fattige-prognose patienter til at udelukke enhver risiko for for tidlig sædinjektion. Det er dog unødvendigt, for tidskrævende og omstændelig at blive udført i alle IVF-cyklusser.
PLM analyse afslører, om oocyt nået MII fase. Men ikke-invasiv visualisering af den meiotiske spindel giver ingen oplysninger om kromosom organisation. Der kan være alvorlige kromosom misjustering og/eller maternel aldersrelateret kromatid-opdeling i oocytter med en bipolar spindel (figur 5). Forskellige andre faktorer har en betydelig indvirkning på reproduktionsevnen (f. eks. sædfaktor, mitokondrier, aktivering af embryonal genom, uregelmæssig spaltning, Epigenetik, endometrium, maternel immunitet). Påvisning af MII-spindlen i sig, garanterer derfor ikke et positivt klinisk udfald af IVF-proceduren.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke det embryologiske laboratorium for Reprofit International. Vi anerkender også den centrale facilitet CELLIM af CEITEC støttet af MEYS CR (LM2015062 Czech-bioimaging) for deres støtte med at opnå immunofluorescens imaging data præsenteret her.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 90164 | bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture |
| Denuding micropipette 150 µm | Microtech IVF | 005-150C | |
| Denuding micropipette 180 µm | Microtech IVF | 005-180B | suitable for oocyte transfer between dishes |
| Denuding micropipette 200 µm | Microtech IVF | 005-250-A | suitable for oocyte transfer between dishes |
| FluoroDish | World Precision Instruments | FD 5040-100 | glass-bottom dish |
| (alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells) | |||
| Holding micropipette | Microtech | 001-120-30 | sterile glass microneedles |
| Hyaluronidase solution | Irvine Scientific | 90101 | for oocyte denudation |
| ICSI micropipette | Microtech | 002-5-30 | sterile glass microneedles |
| Micro Droplet Culture Dish | Vitrolife | 16003 | 12-well plate for embryo culture |
| Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin | Irvine Scientific | 90163 | handling medium, MOPS/HEPES buffered |
| Nikon Eclipse TE 2000-U | Nikon | inverted microscope with heated stage | |
| Nunc IVF Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 150270 | plastic ICSI dish |
| Nunc non-treated 4-well IVF dish | Thermo Fisher Scientific | 179830 | 4-well plate for embryo culture |
| OCTAX polarAide | MTG | integrated PLM system | |
| Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | oil for overlay |
| Polyvinylpyrrolidone | Irvine Scientific | 90123 | for sperm immobilization prior to ICSI |
References
- Holubcova, Z., Blayney, M., Elder, K., Schuh, M. Human oocytes. Error-prone chromosome-mediated spindle assembly favors chromosome segregation defects in human oocytes. Science. 348 (6239), 1143-1147 (2015).
- Oudendijk, J. F., Yarde, F., Eijkemans, M. J., Broekmans, F. J., Broer, S. L. The poor responder in IVF: is the prognosis always poor?: a systematic review. Human Reproduction Update. 18 (1), 1-11 (2012).
- Gautam, N., Allahbadia, Y. M. Ovarian Stimulation Protocols. , Springer. India, Mumbai, India. (2016).
- Piqueras, P., et al. Live birth after replacement of an embryo obtained from a spontaneously in vitro matured metaphase-I oocyte. Systems Biology in Reproductive Medicine. 63 (3), 209-211 (2017).
- Liu, J., Lu, G., Qian, Y., Mao, Y., Ding, W. Pregnancies and births achieved from in vitro matured oocytes retrieved from poor responders undergoing stimulation in in vitro fertilization cycles. Fertility and Sterility. 80 (2), 447-449 (2003).
- Shu, Y., et al. Fertilization, embryo development, and clinical outcome of immature oocytes from stimulated intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertility and Sterility. 87 (5), 1022-1027 (2007).
- Sachdev, N. M., Grifo, J. A., Licciardi, F. Delayed intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with trophectoderm biopsy and preimplantation genetic screening (PGS) show increased aneuploidy rates but can lead to live births with single thawed euploid embryo transfer (STEET). Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (11), 1501-1505 (2016).
- De Vos, A., Van de Velde, H., Joris, H., Van Steirteghem, A. In-vitro matured metaphase-I oocytes have a lower fertilization rate but similar embryo quality as mature metaphase-II oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 14 (7), 1859-1863 (1999).
- Holubcova, Z., et al. Egg maturity assessment prior to ICSI prevents premature fertilization of late-maturing oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 36 (3), 445-452 (2019).
- Montag, M., Schimming, T., van der Ven, H. Spindle imaging in human oocytes: the impact of the meiotic cell cycle. Reproductive BioMedicine Online. 12 (4), 442-446 (2006).
- Montag, M., van der Ven, H. Symposium: innovative techniques in human embryo viability assessment. Oocyte assessment and embryo viability prediction: birefringence imaging. Reproductive BioMedicine Online. 17 (4), 454-460 (2008).
- Keefe, D., Liu, L., Wang, W., Silva, C. Imaging meiotic spindles by polarization light microscopy: principles and applications to IVF. Reproductive BioMedicine Online. 7 (1), 24-29 (2003).
- Caamano, J. N., Munoz, M., Diez, C., Gomez, E. Polarized light microscopy in mammalian oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 45, 49-56 (2010).
- Eichenlaub-Ritter, U., Shen, Y., Tinneberg, H. R. Manipulation of the oocyte: possible damage to the spindle apparatus. Reproductive BioMedicine Online. 5 (2), 117-124 (2002).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. The spindle observation and its relationship with fertilization after intracytoplasmic sperm injection in living human oocytes. Fertility and Sterility. 75 (2), 348-353 (2001).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Keefe, D. L. Developmental ability of human oocytes with or without birefringent spindles imaged by Polscope before insemination. Human Reproduction. 16 (7), 1464-1468 (2001).
- Moon, J. H., et al. Visualization of the metaphase II meiotic spindle in living human oocytes using the Polscope enables the prediction of embryonic developmental competence after ICSI. Human Reproduction. 18 (4), 817-820 (2003).
- Cohen, Y., et al. Spindle imaging: a new marker for optimal timing of ICSI? Human Reproduction. 19 (3), 649-654 (2004).
- Rama Raju, G. A., Prakash, G. J., Krishna, K. M., Madan, K. Meiotic spindle and zona pellucida characteristics as predictors of embryonic development: a preliminary study using PolScope imaging. Reproductive BioMedicine Online. 14 (2), 166-174 (2007).
- Heindryckx, B., De Gheselle, S., Lierman, S., Gerris, J., De Sutter, P. Efficiency of polarized microscopy as a predictive tool for human oocyte quality. Human Reproduction. 26 (3), 535-544 (2011).
- Kilani, S., Cooke, S., Tilia, L., Chapman, M. Does meiotic spindle normality predict improved blastocyst development, implantation and live birth rates? Fertility and Sterility. 96 (2), 389-393 (2011).
- Kilani, S., Chapman, M. G. Meiotic spindle normality predicts live birth in patients with recurrent in vitro fertilization failure. Fertility and Sterility. 101 (2), 403-406 (2014).
- Tilia, L., Venetis, C., Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Is oocyte meiotic spindle morphology associated with embryo ploidy? A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 105 (4), 1085-1092 (2016).
- ESHRE Guideline Group on Good Practice in IVF Labs, De los Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Human Reproduction. 31 (4), 685-686 (2016).
- Principles of IVF Laboratory Practice: Optimizing Performance and Outcomes. Montag, M., Morbeck, D. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2017).
- Chamayou, S., et al. Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos. Reproductive BioMedicine Online. 13 (5), 661-667 (2006).
- Rienzi, L., et al. Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar body position and oocyte developmental potential after ICSI. Human Reproduction. 18 (6), 1289-1293 (2003).
- Woodward, B. J., Montgomery, S. J., Hartshorne, G. M., Campbell, K. H., Kennedy, R. Spindle position assessment prior to ICSI does not benefit fertilization or early embryo quality. Reproductive BioMedicine Online. 16 (2), 232-238 (2008).
- Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Time course of meiotic spindle development in MII oocytes. Zygote. 19 (1), 55-62 (2011).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Human Reproduction. 16 (11), 2374-2378 (2001).
- Sun, X. F., Wang, W. H., Keefe, D. L. Overheating is detrimental to meiotic spindles within in vitro matured human oocytes. Zygote. 12 (1), 65-70 (2004).
- Mullen, S. F., et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of human oocytes, and the relevance to cryopreservation. Human Reproduction. 19 (5), 1148-1154 (2004).
- Swearman, H., et al. pH: the silent variable significantly impacting meiotic spindle assembly in mouse oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 37 (3), 279-290 (2018).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human Reproduction Update. 17 (1), 34-45 (2011).
- Miao, Y. L., Kikuchi, K., Sun, Q. Y., Schatten, H. Oocyte aging: cellular and molecular changes, developmental potential and reversal possibility. Human Reproduction Update. 15 (5), 573-585 (2009).
- Pujol, A., Garcia, D., Obradors, A., Rodriguez, A., Vassena, R. Is there a relation between the time to ICSI and the reproductive outcomes? Human Reproduction. 33 (5), 797-806 (2018).
- Yanagida, K., et al. Influence of oocyte preincubation time on fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (8), 2223-2226 (1998).
