Summary
Wir geben einen Überblick über das klinische Protokoll zur nicht-invasiven Bewertung der menschlichen Eireife mittels polarisierter Lichtmikroskopie.
Abstract
Das optimale Timing der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) ist für Fruchtbarkeitsprogramme von großer Bedeutung, da der vorzeitige Spermieneintrag die Entwicklungskompetenz des Eis schmälert. Die Anwesenheit des ersten Polarkörpers (PB) zusammen mit der meiotischen Spindel zeigt den Abschluss der Eizellenreifung und die Befruchtungsbereitschaft des Eis an. In der klinischen Praxis ist es üblich anzunehmen, dass alle Eizellen, die einen PB zeigen, reife Metaphase (MII)-Oozyten sind. Die PB-Extrusion geht jedoch der Bildung der bipolaren MII-Spindel voraus. Diese Asynchronie macht die bloße Anwesenheit von PB zu einem unzuverlässigen Marker der Oozytenreife. Die nichtinvasive Spindelbildgebung mittels polarisierter Lichtmikroskopie (PLM) ermöglicht eine schnelle und einfache Untersuchung, ob die PB-darstellungende Oozyte tatsächlich eine meiotische Spindel vor ICSI wieder zusammengebaut hat. Hier stellen wir ein Standardprotokoll zur Beurteilung der menschlichen Eireife im klinischen Labor vor. Wir zeigen auch, wie die Zeit von ICSI in Bezug auf die Entwicklungsphase der Oozyte zu optimieren, um eine vorzeitige Spermieninjektion von spätreifenden Oozyten zu verhindern. Mit diesem Ansatz können auch unreife Eizellen, die PB in vitro extrudieren, klinisch genutzt werden. Die Bestätigung, dass die MII-Spindel vor der Spermieninjektion vorhanden ist, und die individuelle Anpassung der Zeit von ICSI ist besonders wichtig bei schlechten Prognose-In-vitro-Fertilisationszyklen (IVF) mit einer geringen Anzahl von Eizellen, die für die Befruchtung zur Verfügung stehen.
Introduction
Um ein befruchtbares haploides Ei zu werden, muss die diploide Oozyte die Hälfte ihrer genetischen Informationen in eine benachbarte Zelle extrudieren, den ersten polaren Körper (PB), und Chromosomen im Äquator der bipolaren Metaphase II (MII) Spindel ausrichten. Während PB durch konventionelle Lichtmikroskopie eindeutig beobachtet werden kann, erfordert der Nachweis von genetischem Material und zytoskelettalen Strukturen in der Regel invasive vorbereitende Verfahren, die mit der weiteren Verwendung der Eizelle für die Fruchtbarkeitsbehandlung unvereinbar sind. Daher wird in der klinischen Praxis das Vorhandensein des PB als Kennzeichen der Oozytenreife angesehen. Die Live-Bildgebung der Mikrotubuli- und Chromosomendynamik während der menschlichen Eizellreifung ergab jedoch, dass PB einige Stunden vor der Zusammenstellung der bipolaren MII-Spindel sichtbar wird und Chromosomen ausgerichtet sind1. Dennoch sind die von miI verhafteten Eier im übertragenen Licht nicht von den Eizellen zu unterscheiden, die gerade in den Prozess der Chromosomensegregation eingetreten sind. So könnte eine Kohorte von Eizellen, die als MII-Oozyten klassifiziert sind, die nur auf der PB-Präsenz basieren, spätreife Eizellen enthalten, die ihre Entwicklung noch nicht abgeschlossen haben und daher nicht zur Befruchtung bereit sind.
Die Verzögerung der Eizellenreifung wird wahrscheinlich die Bevölkerung von armen Respondern mit einer geringen Anzahl von MII-Oozyten und einem hohen Anteil an unreifen Eizellen beeinflussen, die unerwartet in stimulierten Zyklen gesammelt werden2. In vivo erreicht nur ein einziges, qualitativ hochwertiges Ei die Reife und wird eiförmig. In In-vitro-Fertilisationszyklen (IVF) wird eine kontrollierte Ovarialhyperstimulation verwendet, um mehrere Oozyten für die Reifung zu rekrutieren. Gonadotropin Welle löst eine Wiederaufnahme des meiotischen Programms und Ei-Vorläufer sollen die MII-Verhaftungsphase innerhalb von 36 Stunden3erreichen. Eizellen, die aus präovarischen Follikel gewonnen werden, stellen jedoch häufig eine Auswahl von PB-Darstellungen von MII-Oozyten und unreifen Eizellen dar, entweder in der Metaphase I (MI) oder im Keimbläschenstadium (GV) (Abbildung 1). Nur MII-Oozyten werden einer intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) unterzogen, während unreife Eizellen in der Regel verworfen werden. Doch wenn mi Oozyten in vitro kultiviert werden, werden häufig beobachtet, um PB in vitro zu extrudieren. Trotz ihrer allgemeinen Unterlegenheit wurden spät reifende Eizellen, die spontan die erste meiotische Teilung während der Nachtkultur abgeschlossen haben, erfolgreich als letzte Ressourcenoozyten genutzt, und Lebendgeburten wurden gemeldet4,5 ,6,7,8. Daher könnte die vorzeitige Injektion des Spermas ein Hauptgrund dafür sein, dass schlechte Entwicklungsergebnisse von spätreifenden Oozyten, die in früheren Studien berichtet wurden,zugrundeliegen 9,10,11.
Polarisierte Lichtmikroskopie (PLM) in Kombination mit einer Bildverarbeitungssoftware ermöglicht eine nicht-invasive Visualisierung der meiotischen Spindel in der lebenden Oozyte. Die Doppelreflexion wird durch das Zusammenspiel von polarisiertem Lichtstrahl mit der hochgeordneten Montage von Mikrotubuli erzeugt, die die bipolare Spindel bilden. Da das polarisierte Licht von normaler Intensität ist, könnte die Technik sicher in klinischen Umgebungen verwendet werden, um die Dynamik des Divisionsapparates11,12,13,14zu sehen. Das Vorhandensein der MII-Spindelbirefrealität innerhalb der Oozyte wurde als Marker für dieEntwicklungskompetenzeines Eis 9,15,16,17,18, 19,20,21,22,23. So wurde vorgeschlagen, dass nicht-invasive meiotische Spindel-Bildgebung für die Eiqualitätskontrolle in der klinischen Praxis verwendet werden könnte11,14,20.
Da die Zeitachse für die mikrotubuläre Dynamik während der Oozytenmeiose1aufgelöst wurde, kann das beobachtete PLM-Muster besser mit dem Zeitverlauf von MI zu MII-Übergang in Beziehung stehen. Kurz nach der PB-Emission wird die entstehende MII-Spindel durch PLM nicht mehr nachweisbar. Wenn die Eizellen jedoch in der Kultur gehalten werden, kann das Birefrefringence-Signal später auftreten, wenn die bipolare MII-Spindel9,10,11wieder zusammensetzt. So könnte das Fehlen der Spindel bei Oozyten, die einen PB in vitro extrudieren, nur vorübergehend dem physiologischen Übergang der spätreifenden Oozyte vom MI- in die MII-Stufe entsprechen. Wenn das MII-Spindelsignal nicht nachweisbar ist, kann die Spermieninjektion auf einen späteren Zeitpunkt verschoben werden, der zusätzliche Zeit für die MII-Spindelbildung bietet. Die PLM-unterstützte Optimierung der ICSI-Zeit maximiert die Wahrscheinlichkeit, dass spät reifende Eizellen klinisch genutzt werden und einen Unterschied für schlechte Prognosepatienten machen9.
Im Folgenden stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung nicht-invasiver Spindelaufnahmen in menschlichen Eizellen bereit. Wir zeigen auch, wie PLM eingesetzt werden kann, um das Risiko einer vorzeitigen Befruchtung von spät reifenden Eizellen zu vermeiden.
Protocol
Dieses Protokoll beschreibt das klinische Verfahren, das ein "Add-on" zur Standard-IVF-Behandlung ist. Es sollte von erfahrenem Personal in Übereinstimmung mit guten Laborpraxis und klinischen Richtlinien24,25durchgeführt werden. Es wird empfohlen, die schriftliche Zustimmung der berechtigten Patienten in Kenntnis der Sachlage einzuholen. Dieses Protokoll wurde von der institutionellen Ethikkommission gebilligt.
1. Eierrückgewinnung und Denudation
- Induzieren Sie die Stimulation der Eierstöcke mit herkömmlichen Stimulationsprotokollen3. Passen Sie die Dosis an die individuelle Reaktion an. Wenn zwei oder mehr Follikel, die durch Ultraschall-Scan visualisiert werden, einen Durchmesser von 18 mm erreichen, induzieren Sie die Oozytenreifung mit der Anwendung von 250 g humanem Choriongonadotropin (hCG). Planen Sie Dieoozyten-Pick-up (OPU) bei 35-36 h nach hCG-Injektion.
- Sammeln Sie abgerufene Cumulus-Oozyten-Komplexe(COCs) in CO2 -unabhängigem Handhabungsmedium (Materialtabelle). Nach einer kurzen Inkubationszeit (10-15 min) in einem CO2-unabhängigen Inkubator setzen kurz (bis zu 30 s) gesammelte COCs der Hyaluronidase-Lösung (Tabelle derMaterialien) aus. Entfernen Sie unter einem Stereomikroskop mechanisch Cumulus-Corona-Zellen, indem Sie COCs mit einer 200-L-Filterspitze sanft pipetieren.
- Mit Denudationsmikropipetten mit einem allmählich abnehmenden Durchmesser (200 m, 180 m und 150 m) entfernen Sie die Eizellen vorsichtig von den verbleibenden Follikelzellen und waschen Sie die Eizellen im Handlingmedium 3x.
- Bewerten Sie die Anzahl und den Entwicklungsstatus der denudierten Eizellen entsprechend dem Vorhandensein oder Fehlen des Kerns und des ersten PB (Abbildung 1).
- Überprüfen Sie die Aufnahmekriterien für die PLM-Prüfung. Führen Sie eine Eireifebewertung durch, wenn (1) eine unerwartete schlechte Reaktion auf konventionelle Stimulation mit weniger als 6 MII-Oozyten bei OPU und (2) einer Vorgeschichte früherer Befruchtungsfehler oder Oozytenunreife besteht.
- Legen Sie GV,MI und MII-Oozyten in separate Brunnen in einer IVF-Schale, diejeweils 500 l vorequilibriertes CO2-abhängiges Kulturmedium (Materialtabelle) enthalten, das mit Mineralöl bedeckt ist (Materialtabelle).
- Inkubationszeit für zusätzliche 3x4 h bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% O2 und 6% CO2 .
2. Vorbereitung auf die PLM-Prüfung und anschließendes ICSI
HINWEIS: Das hier bereitgestellte Protokoll beschreibt die PLM-Bewertung, die mit dem OCTAX Polar AIDE-System (Materialtabelle )durchgeführt wurde. Alternativ können auch andere handelsübliche Spindelsichtsysteme verwendet werden.
- Bereiten Sie Platten für die Embryonenkultivierung vor.
- Je nach Anzahl der zu untersuchenden Eizellen (Gesamtanzahl der MII-Oozyten und MI-Oozyten, die während der Vorinkubationszeit einen PB extrudieren), bereiten Sie entweder eine 4-Well-Platte oder eine 12-Well-Platte vor, füllen Sie jeden Brunnen mit 500 l bzw. 30 l Kulturmedium und decken Sie mit zuvor ausgeglichenem Mineralöl ab.
- Stellen Sie sicher, dass sowohl Kulturmedium als auch Mineralöl über Nacht im CO2-Inkubator ausgeglichen wurden. Bewahren Sie die vorbereitete Schale im CO2-abhängigen Inkubator mindestens 2 h auf. Nummerieren Sie bei Bedarf die Brunnen, um das Entwicklungsschicksal einzelner Eizellen zu verfolgen.
- Bereiten Sie das ICSI-Gericht vor.
- Verwenden Sie zugewiesene Kunststoffschale und machen Sie 5 L Tröpfchen vorgewärmt es handhabungsmedium für jede PB-Anzeige Oozyte und ein zusätzliches Tröpfchen für das Nadelwaschen. Machen Sie ein zusätzliches Tröpfchen Polyvinylpyrrolidon (PVP) Lösung (Tabelle der Materialien) für Spermien Immobilisierung vor ICSI (Sperma kurz vor ICSI hinzufügen) und Überlagerung mit vorgewärmten Mineralöl.
- Bewahren Sie die vorbereiteteICSI-Schale im CO2-unabhängigen Inkubator mindestens 20 min auf. Nummerieren Sie die Brunnen bei Bedarf, um die Eizellen nach ICSI zu verfolgen.
- Bereiten Sie die PLM-Untersuchungsschale vor.
- Verwenden Sie die zugewiesene Glasbodenschale und machen Sie 5 L Tröpfchen vorgewärmten Handhabungsmedium für jede PB-Anzeige Oozyte. Overlay mit vorgewärmtem Mineralöl.
- Bewahren Sie dieSchale im CO2-unabhängigen Inkubator mindestens 20 min auf. Nummerieren Sie die Tröpfchen bei Bedarf, um die Eizellen nach der PLM-Untersuchung zu verfolgen.
- Stellen Sie das Mikroskop für die PLM-Untersuchung bereit.
- Schalten Sie die beheizte Stufe auf dem invertierten Mikroskop rechtzeitig ein, um eine korrekte Erwärmungstemperatur zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen genau angepasst sind, um 37 °C in den Handhabungsmediumtröpfchen in der PLM/ICSI-Schale während der Mikromanipulationsverfahren beizubehalten.
- Montieren Sie die sterile Halte- und ICSI-Nadel in Mikroinjektionshalter und bringen Sie sie in den Fokus. Alternativ können Sie eine Schraffurnadel verwenden.
- Wählen Sie das entsprechende Objektiv (20x und 25x sind am besten geeignet) und stellen Sie sicher, dass sich der Kondensator in heller Feldposition befindet.
- Setzen Sie einen grünen Interferenzfilter ein (das Licht leuchtet grün) und stellen Sie den Regler für die Flüssigkristallanalyse in die Arbeitsposition ein.
- Stellen Sie den Verschluss auf 50 % ein, und passen Sie den kreisförmigen Polarisator an, um Hintergrundgeräusche zu verringern.
- Stellen Sie den Computer bereit für die PLM-Untersuchung.
- Starten Sie die Imaging-Software.
- Wählen Sie Video | Videoquelle | polarAIDE im Videomenü in der oberen Menüleiste.
- Wechseln Sie zu Live-Videos, indem Sie zur Videoseite wechseln und die Spindel- und Zonaanalyse aktivieren, indem Sie auf das Symbol (Ergänzende Abbildung 1) in der Videosymbolleiste klicken.
- Wählen Sie den Anzeigemodus für die dynamische Skalierung während der Spindelbildgebung aus: (1) rot (Birefringence)/grün (Hintergrund) kombinierte Ansicht oder (2) weiß (Birefringence)/und schwarz (Hintergrund) Ansicht. Der dynamische Scoring-Modus wird für die automatische Bewertung von Zona pellucida verwendet.
3. Prüfung der Eireife
- Führen Sie nach der Vorinkubationszeit (3-4 h) eine PLM-Untersuchung durch, die den Oozytenreifestatus zur Standardzeit von ICSI (39-40 h nach hCG-Trigger) aufzeigt.
- Übertragen Sie alle Eizellen in einzelne Tröpfchen auf der PLM-Schale und legen Sie sie unter das invertierte Mikroskop, das für die Spindelbildgebung vorbereitet ist. Denken Sie daran, den Kunststoffdeckel aus der Glasbodenschale zu entfernen, bevor Sie mit der Untersuchung beginnen.
- Bringen Sie die erste Oozyte in den Fokus. Wenn es schwierig ist, die Zelle unter grünem Licht zu suchen, ziehen Sie den grünen Filter vorübergehend heraus. Stellen Sie sicher, dass der grüne Filter vor der Analyse eingefügt wird.
- Beobachten Sie das erkannte Eizellen-Birefabenzbild (rot/orange auf grünem Hintergrund), da es computerverarbeitet und in Echtzeit auf dem Computerbildschirm angezeigt wird. Denken Sie daran, dass das Signal im Okular nicht sichtbar ist.
- Wenn die Meldung, die die Lichtbelichtung ankündigt, zu niedrig/hoch ist, stellen Sie die Helligkeit mithilfe des Lichtintensitätsknopfs des Mikroskops auf die geeignete Intensität ein.
- Verwenden Sie eine Halte- und ICSI-Nadel, um die Oozyte zu drehen, so dass sich der PB in der 12-Uhr-Position befindet und sich auf den PB konzentriert.
- Wenn die Spindel-Birefreringen in der Nähe von PB auf den ersten Blick nicht sichtbar sind, drehen Sie vorsichtig die Oozyte um jede Achse, indem Sie die Zona pellucida leicht berühren, um die Ausrichtung des polarisierten Lichts mit den Arrayspindelfasern zu gewährleisten( ). Erklären Sie das Fehlen der MII-Spindel, solange die Oozyte das Spindelsignal trotz rigoroser Rotation nicht anzeigt.
- Ordnen Sie die Eizellen auf der Grundlage des beobachteten Birefreringionsmusters in die folgenden Kategorien ein (Abbildung 2): (A) Oozyten mit hellem Signal einer bipolaren, tonnenförmigen MII-Spindel mit klar abgegrenzten Grenzen und gleichmäßiger Verteilung der Birefreringence ; (B) Eizellen mit dysmorpher, apolarer und transluzenter MII-Spindel mit unregelmäßigen Grenzen und ungleichmäßiger Verteilung des Signals; (C) Eizellen ohne nachweisbare MII-Spindelbirefreringe im Ooplasma; (D) Anaphase I/Telophase I Oozyten, die eine mikrotubulare Brücke (einen Bindestrang zwischen dem ersten PB und der Oozyte) anstelle der MII-Spindel zeigt.
HINWEIS: Oozyten mit nachweisbarem MII-Spindelsignal (Grad A oder B) eignen sich für sofortiges ICSI. - Erstellen Sie einen Snapshot (F9) oder zeichnen Sie Videos für einen Bericht und/oder eine nachfolgende Bildanalyse auf. Bewahren Sie die Dokumentation des Bildmusters auf, um die Subjektivität des Bedieners zu reduzieren.
- Wechseln Sie zur Position einer nächsten Oozyte, und wiederholen Sie die Schritte 3.6-3.9.
4. Optimierung des ICSI-Timings
- Alle spindelpositiven Eizellen (Grad A oder B, Schritt 3.8) in die ICSI-Schale übertragen und ICSI nach den Standardprotokollen24,25unterwerfen.
- Wenn die Eizellen kein nachweisbares MII-Spindelsignal aufweisen,legen Sie die PLM-Schale in den CO 2-unabhängigen Inkubator und verschieben Sie den ICSI in eine spätere Zeit.
- Führen Sie die PLM-Neuuntersuchung nach den Schritten 3.3-3.9 durch. Wenn einigen Oozyten noch eine MII-Spindel fehlt, verzögern Sie ICSI weiter um zusätzliche 1 x 2 h.
- Übertragen Sie alle Eizellen in die ICSI-Schale und injizieren Sie sie nach den Standardprotokollen24. Wenn die PLM-Schale mit dem Biegewinkel der Mikroinjektionsnadel kompatibel ist, führen Sie ICSI sofort in der PLM-Schale aus, nachdem Sie in einen hellen Feldmodus gewechselt sind.
- Übertragen Sie nach ICSI Dieoozyten auf vorbereitete Platten für die Embryokultivierung und -kultur bis zum Blastozystenstadium.
Representative Results
Die polarisierte Lichtmikroskopie ermöglicht es, sofort zu prüfen, ob die Eizelle die Kernreifung abgeschlossen und die MII-Spindel vor ICSI montiert hat. Aufgrund seines nicht-invasiven Charakters kann es verwendet werden, um die Befruchtungsbereitschaft des menschlichen Eis in klinischen Umgebungen sicher zu beurteilen11,12,13,14. Spindel-Oozyten führen eher zu lebensfähigen Embryonen als Eizellen ohne Spindel9,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23. Auch Oozyten mit einer ausgeprägten bipolaren Spindel scheinen eine höhere Entwicklungskompetenz zu haben als Eizellen mit dysmorphen Spindeln9,21,22. Zusammengenommen kann Spindel-Bildgebung als Werkzeug dienen, um die Eizellen mit dem größten Potenzial zu identifizieren, erfolgreich befruchtet zu werden, sich der Präimplantationsentwicklung zu unterziehen und eine Vollschwangerschaft zu unterstützen9,15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23.
Die gemeldete Inzidenz der Spindel variiert (44-97%) Berücksichtigung der Vielfalt der untersuchten Bevölkerung9,15,16,17,18,19,20,21, 22 , 23 , 26 , 27 , 28. In vivo gereifte Eizellen von normalen Respondern zeigen typischerweise bipolare MII-Spindel bei 40 h nach hCG-Trigger9,18,27,29. Bei langsamen Respondern wird jedoch der Pool von Eizellen, der aus präovarischen Follikel gewonnen wird, durch Diereifungsverzögerung9,27beeinflusst. Hier sollte die Spindelbildgebung durchgeführt werden, um die im MII-Stadium verhafteten Eizellen von denjenigen zu unterscheiden, die sich einem wichtigen maturationalen Übergang unterziehen (Abbildung 3). Wir empfehlen die Entfernung von Follikelzellen sofort nach dem Abruf und die Inkubation von MI- und MII-Oozyten in separaten Brunnen, um die in vivo gereiften Eizellen und spät reifenden Eizellen zu unterscheiden, die PB in vitro extrudieren, kurz vor ICSI. Falls die Denudation kurz vor ICSI durchgeführt wird, sind diese beiden Populationen von Eizellen aufgrund des PB-Erscheinungsbildes nicht zu unterscheiden.
Die phasenspezifischen Veränderungen des PLM-Musters sollten im Kontext des Wissens über die Spindeldynamik während der meiotischen Reifung interpretiert werden. Während der Interkinese erfährt der Divisionsapparat eine umfangreiche strukturelle Reorganisation und das PLM-Signal verschwindet vorübergehend1,9,10,11. So kann das Fehlen des MII-Spindelsignals bei entwicklungsverzögerten Oozyten, die PB in vitro extrudieren, nicht unbedingt zelluläre Störungen widerspiegeln, aber es könnte auf die Progression der Eizelle von MI zum MII-Stadium hinweisen (Abbildung 3). Wenn das Sperma zu einem unphysiologischen Zeitpunkt injiziert wird, wird das Entwicklungspotenzial der Eie beeinträchtigt. Das Aufschieben von ICSI bietet spät reifenden Eizellen mehr Zeit, um eine MII-Spindel zu montieren, deren Anwesenheit mit besseren klinischenErgebnissen9,10,11verbunden ist. In der klinischen Studie mit langsamen/armen Respondern entwickelten fast 60% der anfangs spindelnegativen Eizellen ein Spindelsignal, bevor PLM etwa 2 h später9erneut untersucht wurde. Abhängig von der Entwicklungsstufe und der Gesamtfitness der spätreifenden Oozyten dauert das MiI-Spindelbild nach PB-Extrusion in der Regel 2 bis 6 h (unveröffentlichte Beobachtung). Die Eizellen, die während der ersten PLM-Untersuchung eine Mikrotubuli-Brücke (Anaphase/Telophase, Grad D) aufweisen, benötigen eine längere Zeit, um ein MII-Spindelsignal zu entwickeln, als Eizellen ohne sichtbare Spindel (aufkommende Spindeln, Grad C). Die individuelle Anpassung der Zeit von ICSI an die Entwicklungsstufe des Eis verhindert eine vorzeitige Aktivierung der Eizelle und führt zu einer verbesserten Befruchtungsrate und einer erfolgreichen Embryoentwicklung9.
Obwohl spät reifende Eizellen, die PB in vitro extrudieren, im Allgemeinen eine geringere Entwicklungskompetenz haben als in vivo gereifte Eizellen, ist die Rate der Embryoentwicklung akzeptabel, wenn sie es schaffen, eine nachweisbare Spindel vor dem verzögerten ICSI (Blastulation) zu montieren. 41,32%)9. Mit diesem Ansatz können selbst unreife Eizellen, die normalerweise für die Fruchtbarkeitsbehandlung abgelehnt werden, klinisch genutzt werden, übertragbare Embryonen produzieren und zu Vollzeitschwangerschaften führen. Die Bewertung des Maturationalen Stadiums jeder einzelnen Oozyte ist besonders vorteilhaft bei schlechten Prognosezyklen, die eine kleine Anzahl von MII-Oozyten ergeben und/oder nach durchführung einer Rettungs-In-vitro-Reifung von unreifen Eizellen9.
Neben der Bewertung der Eireife wird auch die Spindelbildgebung vor der PB-Biopsie empfohlen, um eine Spindelzerstörung in Anaphase I/Telophase-Oozyten zu vermeiden. In der experimentellen Embryologie wird die Visualisierung der meiotischen Spindel während der Eienukleation und/oder Spindeltransferprozedur13verwendet.
Abbildung 1: Menschliche Eizellenreifung. In vivo gereifte Eizellen (MII) zeigen PB zum Zeitpunkt des Abrufs. Unreife Eizellen (GV, MI) können die Reifung spontan in vitro abschließen. Maßstabsleiste = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Oozytenklassifizierung basierend auf PLM-detected Muster. Repräsentative Beispiele für Oozytengrade (A-D) basierend auf dem Auftreten des Spindelsignals. PLM-detektiertes Muster: (A) prominentes Signal der bipolaren Spindel, (B) transluzente apolare MII-Spindel, (C) keine nachweisbare Spindel und (D) Mikrotubuli-Brücke. Maßstabsleiste = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Stufen des MI-ZU-MII-Übergangs in der Oozytenreifung. Das Auftreten von Eizellen im hellen Feld (obere Reihe), kombiniert mit einem Fluoreszenzsignal von Chromosomen (Cyan) und Mikrotubuli (Magenta) (mittlere Reihe), und in polarisiertem Licht (untere Reihe) wird angezeigt. Jede Eizelle wurde zuerst PLM-geprüft und sofort behoben. Feste Eizellen wurden (immuno)beschriftet mit Hoechst (DNA) und Anti-Tubulin-Antikörper (Mikrotubuli). Der gelbe Pfeil zeigt das Vorhandensein von PB an und der weiße Pfeil hebt die Position der birefringent Mikrotubuli hervor. Skalenbalken = 20 m. Diese Zahl wurde von Holubcové et al., JARG 20199geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Korrelation der Chromosomen-Mikrotubuli-Organisation mit dem birefreringen Zäummuster, das durch polarisierte Lichtmikroskopie erkannt wird. Das Auftreten von Eizellen im hellen Feld kombiniert mit einem fluoreszierenden Signal für Chromosomen (Cyan) und Mikrotubuli (Magenta) (obere Reihe) und in polarisiertem Licht (untere Reihe) wird angezeigt. Jede Eizelle wurde unmittelbar nach der PLM-Untersuchung behoben. DNA (Hoechst) und Microtubule ('-Tubulin') wurden gefärbt. (A-C) Oozyten mit PLM-detektierbarer Spindel, aber falsch ausgerichteten Chromosomen (A, B) oder lose fokussierten Spindelstangen (C); (D-F) abnormale Eizellen ohne PLM-detekierbare MII-Spindel mit unterentwickelter (D), apolarer (E) oder keiner Spindel (F). Der weiße Pfeil hebt die Position von birefringent Mikrotubuli hervor, und Sternchen (*) zeigt die Position des dekondensierten Chromatins an. Maßstabsleiste = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Birefringenzstrukturen in menschlichen Eizellen. Repräsentative Beispiele für (A-D) birefringent Strukturen, die von PLM in menschlichen Eizellen nachgewiesen wurden. ZP = zona pellucida; PM = Plasmamembran (Oolema); RB = refraktile Körper, Vakuolen. Weißer Pfeil, meiotische Spindel in verschiedenen Stufen der Reifung. (E) MII-Spindelfehlausrichtung mit Polarkörper (PB). (F) Spindelablösung von plasmamembran. Maßstabsleiste = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Desktop-Layout der Bildanalyse-Software. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzendes Video: PLM-Prüfungsverfahren. Die Rotation der Oozyte ist erforderlich, um das Vorhandensein der Spindel (Pfeil) auszuschließen. Maßstabsleiste = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Die acentrosomale meiotische Spindel in menschlichen Eizellen ist hochdynamisch und eine empfindliche Struktur1. Unter suboptimalen Bedingungen depolymerisieren sich die Mikrotubulifasern schnell und die meiotische Spindel zerlegt30,31,32,33. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, sicherzustellen, dass die Oozytenkultur und Mikromanipulationsbedingungen, nämlich Temperatur und pH-Wert, im optimalen Bereich liegen. Um das Risiko von Spindelstörungen zu minimieren, sollten die Eizellen in einer temperaturgeregelten Umgebung aufbewahrt werden, in der 37 x 0,5 °C in den Eizellenmedien gehalten werden. Die Verwendung von Mikroskopen und Mikroinjektionseinstellungen mit beheizter Stufe ist unbedingt erforderlich. Alle Manipulationen mit Eizellen außerhalb des Inkubators müssen in HEPES/MOPS gepufferten Medien durchgeführt werden, um pH-Fluktulationen zu vermeiden. Um mögliche nachteilige Auswirkungen einer übermäßigen Eizellenübergabe im Umgebungszustand zu vermeiden, sollte die Gesamtzeit der PLM-Untersuchung 10 Minuten nicht überschreiten. Die Eizellen müssen auf der Glasbodenschale analysiert werden, wobei der Kunststoffdeckel entfernt wird, da die Positionierung eines Standardkunststoffs im Strahlweg die Bildanalyse beeinträchtigt. Da Kunststoff- und Glasbodenschalen unterschiedliche thermische Eigenschaften aufweisen, sollte die Temperatur direkt in den Tröpfchen des Handhabungsmediums in der Untersuchungsschale überprüft werden.
Zusätzlich zu den Laborbedingungen könnten verfahrenstechnische Unterschiede und die Mikromanipulationsfähigkeiten des Bedieners Auswirkungen auf die Genauigkeit der PLM-Untersuchung haben. Nur hochmontierte bipolare Spindeln können nichtinvasiv visualisiert werden. Das beobachtete Signal ist proportional zum Grad der strukturellen Organisation der Spindel. Nascent, apolare, gelockerte oder verwirrte Spindeln zeigen nur verschwommene Birefreringence oder gar keine an (Abbildung3 und Abbildung 4). Außerdem erzeugt die unvollkommene Ausrichtung des polarisierten Lichts mit Mikrotubuli-Arrays trotz des tatsächlichen Vorhandenseins einer gut entwickelten bipolaren Spindel nur eine transluzente und schlecht definierte Birefreringität (Abbildung 4). Wenn nicht richtig ausgerichtet, könnte das Spindelsignal leicht verpasst werden und Oozytenreife falsch diagnostiziert werden (Supplemental Video). Für eine optimale Spindelbildgebung muss die Eizelle richtig um jede Achse gedreht werden. Da die Birefrefringnz in Okularen nicht sichtbar ist, muss der Bediener den Computerbildschirm beobachten, während er die Oozyte rotiert. Vorherige Erfahrungen mit Mikromanipulation und Training der Spindelbildgebung in überschüssigen in vitro gereiften Eizellen sind wünschenswert, bevor sie auf klinische Anwendung umgestellt werden.
Neben der Spindel weisen die Cumuluszellen, die die Oozyte, Oolema, die innere Schicht der Zona pellucida und einige zytoplasmatische Strukturen (z.B. refraktile Körper, Vakuole) umgeben, eine Birefreringence (Abbildung 5A-D). Sofern vor der Bildgebung nicht gründlich aus der Eizelle entfernt, erzeugen eng befestigte Follikelzellen Hintergrundgeräusche und beeinträchtigen die meiotische Spindelerkennung. Achten Sie darauf, nicht einen großen refraktilen Körper für die Spindel zu verwechseln. Viele zytoplasmatische Einschlüsse, die sich im Zytoplasma befinden, weisen eine hohe Helligkeit auf, die stark mit dem dunklen Hintergrund kontrastiert. Meiotische Spindel hingegen weist nur moderates Signal, verschwommene Grenzen auf und heftet sich typischerweise an die Oolema unter oder neben dem ersten PB. Gelegentlich zeigt die PLM-Untersuchung eine grobe Spindelabweichung von ihrer Standardposition (Abbildung 5E,F). Bei einer größeren Fehlausrichtung zwischen dem Divisionsapparat und dem PB hilft PLM, die Eizelle zu orientieren, um das Risiko einer Spindelverletzung während der Mikroinjektion zu vermeiden. Die relative Position der Spindel innerhalb der Oozyte scheint das Entwicklungspotenzial der resultierenden Embryonen17,34nicht zu beeinflussen. Wenn sich die Spindel jedoch konkurrenzfähig von der Oolema löst, treten Befruchtungsanomalien auf. Interessanterweise werden einige minderwertige Eizellen unmittelbar nach der PB-Extrusion chromatin dekondensiert, anstatt mit der Mikrotubuli-Kernbildung zu beginnen (Abbildung 4F). Mit Hilfe der konventionellen Lichtmikroskopie und des PB als einzigem Marker der Oozytenreife würden solche subkompetenten Eizellen als befruchtbar angesehen. So fügt die Spindelbildgebung zusätzlich zur routinemäßigen morphologischen Bewertung wichtige Informationen über die Reife des Eis hinzu und kann als indirekter Marker seiner Qualität dienen.
Die Inzidenz von gespindelten MII-Oozyten wird wahrscheinlich durch Merkmale der Studienpopulation beeinflusst (z. B. genetischer Hintergrund, Gesundheitszustand, mütterliches Alter). Darüber hinaus beeinflusst der Anteil der entwicklungsverzögerten Eizellen innerhalb der Kohorte die tatsächliche Anzahl der erkannten spindelnegativen Eizellen9,27. Die meiotische Spindelvisualisierung ermöglicht es, befruchtbare Eizellen, die in der MII-Phase verhaftet wurden, eindeutig zu identifizieren. Darüber hinaus kann die zweite Inspektion zu einem späteren Zeitpunkt zeigen, ob die spindelnegative Oozyte abnormal ist oder erst vor kurzem durch MI/MII-Übergang9,10,11vorangekommen ist. Wenn es erlaubt ist, eine Spindel vor ICSI zu entwickeln, können selbst unreife Eizellen, die routinemäßig entsorgt werden,lebensfähigeEmbryonen 9 produzieren. In Zyklen mit sehr wenigen Eizellen, die für die Befruchtung zur Verfügung stehen, kann fein getimtes ICSI von Oozyten, die PB extrudieren, als Rettungsstrategie und Alternative zur Zyklusabsage dienen.
Dennoch sollte die Verlängerung der Vorinkubationszeit nicht auf alle Eizellen verallgemeinert werden. In vivo gereifte Eizellen von normalen Respondern weisen typischerweise eine MII-Spindel9,20,21,27aus. Hier sinkt die Chance auf eine erfolgreiche Spindelbildgebung mit der Zeit als Folge der post-ovulatorischen In-vitro-Alterung35. Wenn möglich, sollte ICSI am Tag der Bergung durchgeführt werden und sollte 9 Stunden (45 Stunden nach hCG), den Zeitraum mit einem Rückgang der resultierenden Embryoqualität36,37verbunden nicht überschreiten. Oozyten, die unterschiedliche bipolare Spindeln aufweisen, sollten ohne weitere Verzögerung ICSI unterworfen werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die individuelle Optimierung des ICSI-Timings bei Patienten mit schlechter Prognose lohnt, um jedes Risiko einer vorzeitigen Spermieninjektion auszuschließen. Es ist jedoch unnötig, zu zeitaufwändig und mühsam, um in allen IVF-Zyklen durchgeführt zu werden.
Die PLM-Analyse zeigt, ob die Oozyte das MII-Stadium erreicht hat. Die nichtinvasive Visualisierung der meiotischen Spindel liefert jedoch keine Informationen über die Chromosomenorganisation. Es kann zu einer schweren Chromosomenfehlstellung und/oder einer mütterlichen altersbedingten Chromatidspaltung in Eizellen mit einer bipolaren Spindel (Abbildung5) führen. Verschiedene andere Faktoren haben einen signifikanten Einfluss auf den Fortpflanzungserfolg (z. B. Spermienfaktor, Mitochondrien, embryonale Genomaktivierung, unregelmäßige Spaltung, Epigenetik, Endometrium, mütterliche Immunität). Daher garantiert der Nachweis der MII-Spindel an sich kein positives klinisches Ergebnis des IVF-Verfahrens.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken dem Embryologielabor von Reprofit International. Wir würdigen auch die Kerneinrichtung CELLIM von CEITEC, die von MEYS CR (LM2015062 Czech-Bioimaging) unterstützt wird, für ihre Unterstützung bei der Beschaffung von Immunfluoreszenz-Bildgebungsdaten, die hier vorgestellt werden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 90164 | bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture |
| Denuding micropipette 150 µm | Microtech IVF | 005-150C | |
| Denuding micropipette 180 µm | Microtech IVF | 005-180B | suitable for oocyte transfer between dishes |
| Denuding micropipette 200 µm | Microtech IVF | 005-250-A | suitable for oocyte transfer between dishes |
| FluoroDish | World Precision Instruments | FD 5040-100 | glass-bottom dish |
| (alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells) | |||
| Holding micropipette | Microtech | 001-120-30 | sterile glass microneedles |
| Hyaluronidase solution | Irvine Scientific | 90101 | for oocyte denudation |
| ICSI micropipette | Microtech | 002-5-30 | sterile glass microneedles |
| Micro Droplet Culture Dish | Vitrolife | 16003 | 12-well plate for embryo culture |
| Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin | Irvine Scientific | 90163 | handling medium, MOPS/HEPES buffered |
| Nikon Eclipse TE 2000-U | Nikon | inverted microscope with heated stage | |
| Nunc IVF Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 150270 | plastic ICSI dish |
| Nunc non-treated 4-well IVF dish | Thermo Fisher Scientific | 179830 | 4-well plate for embryo culture |
| OCTAX polarAide | MTG | integrated PLM system | |
| Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | oil for overlay |
| Polyvinylpyrrolidone | Irvine Scientific | 90123 | for sperm immobilization prior to ICSI |
References
- Holubcova, Z., Blayney, M., Elder, K., Schuh, M. Human oocytes. Error-prone chromosome-mediated spindle assembly favors chromosome segregation defects in human oocytes. Science. 348 (6239), 1143-1147 (2015).
- Oudendijk, J. F., Yarde, F., Eijkemans, M. J., Broekmans, F. J., Broer, S. L. The poor responder in IVF: is the prognosis always poor?: a systematic review. Human Reproduction Update. 18 (1), 1-11 (2012).
- Gautam, N., Allahbadia, Y. M. Ovarian Stimulation Protocols. , Springer. India, Mumbai, India. (2016).
- Piqueras, P., et al. Live birth after replacement of an embryo obtained from a spontaneously in vitro matured metaphase-I oocyte. Systems Biology in Reproductive Medicine. 63 (3), 209-211 (2017).
- Liu, J., Lu, G., Qian, Y., Mao, Y., Ding, W. Pregnancies and births achieved from in vitro matured oocytes retrieved from poor responders undergoing stimulation in in vitro fertilization cycles. Fertility and Sterility. 80 (2), 447-449 (2003).
- Shu, Y., et al. Fertilization, embryo development, and clinical outcome of immature oocytes from stimulated intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertility and Sterility. 87 (5), 1022-1027 (2007).
- Sachdev, N. M., Grifo, J. A., Licciardi, F. Delayed intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with trophectoderm biopsy and preimplantation genetic screening (PGS) show increased aneuploidy rates but can lead to live births with single thawed euploid embryo transfer (STEET). Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (11), 1501-1505 (2016).
- De Vos, A., Van de Velde, H., Joris, H., Van Steirteghem, A. In-vitro matured metaphase-I oocytes have a lower fertilization rate but similar embryo quality as mature metaphase-II oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 14 (7), 1859-1863 (1999).
- Holubcova, Z., et al. Egg maturity assessment prior to ICSI prevents premature fertilization of late-maturing oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 36 (3), 445-452 (2019).
- Montag, M., Schimming, T., van der Ven, H. Spindle imaging in human oocytes: the impact of the meiotic cell cycle. Reproductive BioMedicine Online. 12 (4), 442-446 (2006).
- Montag, M., van der Ven, H. Symposium: innovative techniques in human embryo viability assessment. Oocyte assessment and embryo viability prediction: birefringence imaging. Reproductive BioMedicine Online. 17 (4), 454-460 (2008).
- Keefe, D., Liu, L., Wang, W., Silva, C. Imaging meiotic spindles by polarization light microscopy: principles and applications to IVF. Reproductive BioMedicine Online. 7 (1), 24-29 (2003).
- Caamano, J. N., Munoz, M., Diez, C., Gomez, E. Polarized light microscopy in mammalian oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 45, 49-56 (2010).
- Eichenlaub-Ritter, U., Shen, Y., Tinneberg, H. R. Manipulation of the oocyte: possible damage to the spindle apparatus. Reproductive BioMedicine Online. 5 (2), 117-124 (2002).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. The spindle observation and its relationship with fertilization after intracytoplasmic sperm injection in living human oocytes. Fertility and Sterility. 75 (2), 348-353 (2001).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Keefe, D. L. Developmental ability of human oocytes with or without birefringent spindles imaged by Polscope before insemination. Human Reproduction. 16 (7), 1464-1468 (2001).
- Moon, J. H., et al. Visualization of the metaphase II meiotic spindle in living human oocytes using the Polscope enables the prediction of embryonic developmental competence after ICSI. Human Reproduction. 18 (4), 817-820 (2003).
- Cohen, Y., et al. Spindle imaging: a new marker for optimal timing of ICSI? Human Reproduction. 19 (3), 649-654 (2004).
- Rama Raju, G. A., Prakash, G. J., Krishna, K. M., Madan, K. Meiotic spindle and zona pellucida characteristics as predictors of embryonic development: a preliminary study using PolScope imaging. Reproductive BioMedicine Online. 14 (2), 166-174 (2007).
- Heindryckx, B., De Gheselle, S., Lierman, S., Gerris, J., De Sutter, P. Efficiency of polarized microscopy as a predictive tool for human oocyte quality. Human Reproduction. 26 (3), 535-544 (2011).
- Kilani, S., Cooke, S., Tilia, L., Chapman, M. Does meiotic spindle normality predict improved blastocyst development, implantation and live birth rates? Fertility and Sterility. 96 (2), 389-393 (2011).
- Kilani, S., Chapman, M. G. Meiotic spindle normality predicts live birth in patients with recurrent in vitro fertilization failure. Fertility and Sterility. 101 (2), 403-406 (2014).
- Tilia, L., Venetis, C., Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Is oocyte meiotic spindle morphology associated with embryo ploidy? A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 105 (4), 1085-1092 (2016).
- ESHRE Guideline Group on Good Practice in IVF Labs, De los Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Human Reproduction. 31 (4), 685-686 (2016).
- Principles of IVF Laboratory Practice: Optimizing Performance and Outcomes. Montag, M., Morbeck, D. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2017).
- Chamayou, S., et al. Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos. Reproductive BioMedicine Online. 13 (5), 661-667 (2006).
- Rienzi, L., et al. Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar body position and oocyte developmental potential after ICSI. Human Reproduction. 18 (6), 1289-1293 (2003).
- Woodward, B. J., Montgomery, S. J., Hartshorne, G. M., Campbell, K. H., Kennedy, R. Spindle position assessment prior to ICSI does not benefit fertilization or early embryo quality. Reproductive BioMedicine Online. 16 (2), 232-238 (2008).
- Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Time course of meiotic spindle development in MII oocytes. Zygote. 19 (1), 55-62 (2011).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Human Reproduction. 16 (11), 2374-2378 (2001).
- Sun, X. F., Wang, W. H., Keefe, D. L. Overheating is detrimental to meiotic spindles within in vitro matured human oocytes. Zygote. 12 (1), 65-70 (2004).
- Mullen, S. F., et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of human oocytes, and the relevance to cryopreservation. Human Reproduction. 19 (5), 1148-1154 (2004).
- Swearman, H., et al. pH: the silent variable significantly impacting meiotic spindle assembly in mouse oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 37 (3), 279-290 (2018).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human Reproduction Update. 17 (1), 34-45 (2011).
- Miao, Y. L., Kikuchi, K., Sun, Q. Y., Schatten, H. Oocyte aging: cellular and molecular changes, developmental potential and reversal possibility. Human Reproduction Update. 15 (5), 573-585 (2009).
- Pujol, A., Garcia, D., Obradors, A., Rodriguez, A., Vassena, R. Is there a relation between the time to ICSI and the reproductive outcomes? Human Reproduction. 33 (5), 797-806 (2018).
- Yanagida, K., et al. Influence of oocyte preincubation time on fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (8), 2223-2226 (1998).
