Summary
우리는 편광광 현미경 검사법을 사용하여 인간 계란 성숙도의 비침범성 평가를 위한 임상 프로토콜의 개요를 제공합니다.
Abstract
intracytoplasmic 정자 주입의 최적 타이밍 (ICSI) 불시의 정자 항목은 계란의 발달 능력을 감소하기 때문에 불임 프로그램에 대한 심각한 관심사입니다. meiotic 스핀들과 함께 첫 번째 극지 체 (PB)의 존재는 난모세포 성숙의 완료와 수정을위한 계란의 준비를 나타냅니다. 임상 사례에서, PB를 표시하는 모든 난모세포가 성숙한 중이성(MII) 난모세포라고 가정하는 것이 관례이다. 그러나, PB 압출은 양극성 MII 스핀들의 형성을 선행한다. 이 비동기는 PB의 단순한 존재가 난모세포 성숙의 신뢰할 수없는 마커를 만든다. 편광 광 현미경 검사법 (PLM)를 사용하여 비 침습적 스핀들 화상 진찰은 PB 표시 oocyte가 ICSI 이전에 meiotic 스핀들을 실제로 재조립하는지 여부를 빠르고 쉽게 검사할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 임상 실험실에서 인간 계란 성숙도 평가를 수행하기 위한 표준 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한 늦은 성숙 난모세포의 조기 정자 주입을 방지하기 위해 난모세포의 발달 단계에 대하여 ICSI의 시간을 최적화하는 방법을 보여줍니다. 이러한 접근법을 사용하여, 시험관 내에서 PB를 압출하는 미성숙한 난모세포조차도 임상적으로 활용될 수 있다. MII 스핀들이 정자 주입 이전에 존재한다는 것을 확증하고 ICSI의 시간의 개별 조정은 풍부하게 함을 위해 유효한 난모세포의 낮은 수를 가진 나쁜 예후 체외 풍부하게 함 (IVF) 주기에서 특히 중요합니다.
Introduction
만연한 haploid 계란이 되기 위하여는, diploid oocyte는 인접한 세포로 그것의 유전 정보의 반을 돌출하고, 첫번째 극체에게 불린 (PB), 양극성 형이상 II (MII) 스핀들의 적도에 있는 염색체를 정렬합니다. PB는 전통적인 가벼운 현미경 검사법에 의해 명확하게 관찰될 수 있는 동안, 유전 물자 및 세포골격 구조물의 검출은 전형적으로 불임 처리를 위한 난모세포의 추가 사용과 양립할 수 없는 침략적인 준비 절차를 요구합니다. 따라서, 임상 사례에서, PB의 존재는 난모세포 성숙의 특징으로 여겨진다. 그러나, 인간 난모세포 성숙 동안 미세소관 및 염색체 역학의 실시간 이미징은 양극성 MII 스핀들이 조립되고 염색체가 정렬되기 2시간전에 PB가 눈에 띄게 된다는 것을 밝혔다 1. 그럼에도 불구하고, 투과된 빛에서, MII 체포 된 계란은 염색체 분리 과정에 들어간 난모세포와 구별할 수 없다. 따라서, PB 존재에 근거를 둔 MII 난모세포로 분류된 난모세포의 코호트는 아직 발달을 완료하지 않았고 따라서 풍부하게 할 준비가 되지 않은 늦기 난모세포가 포함될 수 있다.
난모세포 성숙의 지연은 자극된 사이클에서 예기치 않게 수집된 MII 난모세포의 수가 적고 미성숙한 난모세포의 비율이 높은 가난한 응답자의 인구에 영향을 미칠 가능성이2. 생체 내에서, 단 하나의, 최고 품질의 계란은 성숙을 달성하고 배란된다. 체외 수정 (IVF) 주기에서, 통제된 난소 과자극은 성숙을 위한 다중 난모세포를 모집하기 위하여 이용됩니다. 생식샘 자극 호르몬 서지는 meiotic 프로그램의 재개를 트리거하고 계란 선조는 36 시간안에MII 체포 단계에 도달하기 위하여 예정됩니다 3. 그러나, 전경 여포로부터 회수된 난모세포는 종종 중형 I(MI) 또는 발아 소포 단계(GV)에서 MII 난모세포 및 미성숙 난모세포PB디스플레이의 구색을 구성한다(그림 1). 만 MII 난모 세포는 미성숙한 난모세포가 전형적으로 폐기되는 동안 intracytoplasmic 정액 주입 (ICSI)를 복종됩니다. 그러나, 시험관 내에서 경작될 때, MI 난모세포는 일반적으로 시험관내에서 PB를 돌출시도록 관찰된다. 그들의 일반적인 열등에도 불구하고, 하룻밤 배양 도중 첫번째 meiotic 분할을 자발적으로 완료한 늦게 성숙한 난모세포는 성공적으로 마지막 자원 oocytes로 이용되고, 살아있는 출생은보고된4,5 ,6,7,8. 따라서, 정자의 불시의 주입은 이전연구9,10,11에서보고된 늦은 성숙 oocytes의 근본적인 발달 결과 근본적인 이유일지도 모릅니다.
이미지 처리 소프트웨어와 결합된 편광 광 현미경 검사법(PLM)을 통해 라이브 난모세포에서 의 meiotic 스핀들의 비침습적 시각화를 가능하게 합니다. 이중 반사는 양극성 스핀들을 구축하는 미세소관의 고도로 정렬된 조립체와 편광 광선의 상호 작용에 의해 생성됩니다. 편광광은 정상 강도이기 때문에, 이 기술은 임상 설정에서 안전하게 분할 장치11,12,13,14의역학을 볼 수 있었다. 난모세포 내의 MII 스핀들 버블러링의 존재는 난자의 발달 능력9,15,16,17,18의마커로 확인되었습니다. 19,20,21,22,23. 따라서, 비침습적 용이성 스핀들 이미징이 임상 실습11,14,20에서난자 품질 관리를 위해 사용될 수 있다고 제안되었다.
난모세포 인후구 동안의 미세관 역학에 대한 타임라인이1로 해결되었기 때문에, 관찰된 PLM 패턴은 MII 전이에 대한 MI의 시간 과정과 더 잘 관련될 수 있다. PB 방출 직후, 초기 MII 스핀들은 PLM에 의해 탐지되지 않게 된다. 그러나, 난모세포가 배양물에서 유지되는 경우, 바이폴라 MII 스핀들이9,10,11을재조립할 때 나중에 비배양 신호가 나타날 수 있다. 따라서, 시험관 내에서 PB를 압출하는 난모세포에서, 스핀들의 부재는 MI에서 MII 단계로의 후기 성숙 난모세포의 생리적 전이에 대응하는 일시적일 수 있다. MII 스핀들 신호가 탐지되지 않는 경우, 정자 주입은 MII 스핀들 형성을 위한 추가 시간을 제공하는 나중 시점까지 연기될 수 있다. ICSI 시간의 PLM 지원 최적화는 임상적으로 활용될 후기 성숙 난모세포의 기회를 극대화하고 가난한 예후 환자에 대한 차이를만들 9.
아래에서, 우리는 인간 난모세포에서 비침습적 스핀들 이미징을 수행하는 방법의 단계별 프로토콜을 제공한다. 우리는 또한 PLM이 늦은 성숙 oocytes의 조기 풍부하게 함의 리스크를 피하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 보여줍니다.
Protocol
이 프로토콜은 표준 IVF 치료에 '추가 기능'인 임상 절차를 설명합니다. 그것은 좋은 실험실 사례 및 임상 지침24,25를준수하여 숙련 된 인력에 의해 수행되어야한다. 적격 한 환자로부터 서면 으로 통보 된 동의를 얻는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 기관 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 계란 회수 및 폐기
- 종래의 자극 프로토콜을 사용하여 난소자극을 유도3. 개별 반응에 복용량을 조정합니다. 초음파 스캔으로 시각화 된 두 개 이상의 여포가 직경 18mm에 도달하면 250 μg의 인간 융모성 생식샘 자극 호르몬 (hCG)을 적용하여 난모 세포 성숙을 유도합니다. 35−36 h 포스트 hCG 주입에서 oocyte 픽업 (OPU)을 예약하십시오.
- CO2-독립 처리 매체(재료표)에서회수된적혈구 복합체(COC)를 수집합니다. CO2-독립 인큐베이터에서 짧은 잠복기(10-15분)를 후, 간략하게(최대 30초) 수집된 COCs를 히알루로니다제 용액(재료표)에 노출시다. 입체 현미경으로, 기계적으로 200 μL 필터 팁으로 COCs를 부드럽게 피펫팅하여 적운-코로나 세포를 제거합니다.
- 점차적으로 감소하는 직경 (200 μm, 180 μm 및 150 μm)을 가진 다분화 마이크로 파이펫을 사용하여, 나머지 여포 세포에서 난모세포를 부드럽게 제거하고 처리 매체에서 난모세포를 3x 세척합니다.
- 핵 및 제1 PB의 존재 또는 부재에 따라 비누드 난모세포의 수 및발달 상태를 평가한다(도 1).
- PLM 검사에 대한 포함 기준을 확인합니다. (1) OPU에서 수집된 6MII oocytes 미만의 종래의 자극에 대한 예기치 않은 불량 반응이 있는 경우 난자 성숙도 평가를 수행하고 (2) 이전 수정 실패 또는 난모체 미성숙의 병력을 수행한다.
- GV, MI 및 MII 난모세포를 IVF 접시에 별도의 우물에 넣고, 각각 500μL의 선균형 CO2-의존배양 배지(표)를 미네랄 오일로 덮은(재료표)을함유한다.
- 5% O2 및 6% CO2의 가습 된 분위기에서 37 °C에서추가3-4 시간 동안 배양한다.
2. PLM 검사 및 후속 ICSI 준비
참고: 여기에 제공된 프로토콜은 OCTAX 폴라 AIDE 시스템(자료표)을 사용하여 수행된 PLM 평가를 설명합니다. 또는 시판되는 다른 스핀들 뷰 시스템을 사용할 수 있습니다.
- 배아 재배를 위한 접시를 준비합니다.
- 검사할 난모세포의 수(예비 기간 동안 PB를 압출하는 MII oocytes 및 MI 난모세포의 총)에 따라, 4웰 플레이트 또는 12웰 플레이트를 준비하고, 각각 500 μL 또는 30 μL의 배양 배지로 각각 잘 채웁니다. , 이전에 평형 미네랄 오일로 커버.
- 배양 배지와 미네랄 오일이 밤새CO2 인큐베이터에서 평형화되었는지 확인하십시오. 준비된 접시를 CO2-의존적 인큐베이터에 적어도 2 시간 동안 보관하십시오. 개별 난모세포의 발달 운명을 추적하기 위해 필요한 경우 웰을 번호를 매다.
- ICSI 접시를 준비합니다.
- 지정된 플라스틱 접시를 사용하고 각 PB 표시 oocyte에 대해 미리 따뜻하게 처리 매체의 5 μL 방울과 바늘 세척을위한 여분의 물방울 1 개를 만듭니다. ICSI (ICSI 바로 전에 정자 추가) 전에 정자 고정을위한 폴리 비닐 피롤리돈 (PVP) 용액(재료의표)의 추가 방울을 확인하고 미리 온난화 된 미네랄 오일과 오버레이.
- 준비된 ICSI 접시를CO2-독립 인큐베이터에 적어도 20분 동안 보관하십시오.
- PLM 시험 접시를 준비합니다.
- 지정된 유리 바닥 접시를 사용하고 각 PB 표시 oocyte에 대해 미리 따뜻해진 처리 매체의 5 μL 방울을 만듭니다. 미리 따뜻해진 미네랄 오일로 오버레이.
- 적어도 20 분동안 CO2 -독립적 인 인큐베이터에 접시를 유지. PLM 검사 후 난모구를 추적하기 위해 필요한 경우 물방울을 번호.
- PLM 검사를 위해 현미경을 준비합니다.
- 올바른 온난화 온도를 달성하기 위해 사전에 잘 반전 된 현미경의 가열 단계를 전환합니다. 미세 조작 절차 중에 PLM/ICSI 접시의 처리 매체 액적에서 37°C를 유지하도록 설정이 정확하게 조정되었는지 확인합니다.
- 멸균 홀딩 및 ICSI 바늘을 미세 사출 홀더에 넣고 초점을 맞춥니다. 또는 부화 바늘을 사용하십시오.
- 적절한 목표(20x 및 25x가 가장 적합)를 선택하고 응축기가 밝은 필드 위치에 있는지 확인합니다.
- 녹색 간섭 필터(표시등이 녹색으로 바뀝니다)를 삽입하고 액정 분석 슬라이더를 작동 위치로 설정합니다.
- 셔터를 ~50%로 설정하고 원형 편광판을 조정하여 배경 소음을 줄입니다.
- 컴퓨터를 PLM 검사에 사용할 준비가 된 것으로 설정합니다.
- 이미징 소프트웨어를 시작합니다.
- 비디오 선택 | 비디오 소스 | 상단 메뉴 모음의 비디오 메뉴에서 폴라AIDE를 클릭합니다.
- 비디오 페이지로 이동하여 라이브 비디오로 전환하고 비디오 도구 모음의 아이콘(추가그림1)을 누르면 스핀들 및 조나 분석을 활성화합니다.
- 스핀들 이미징 중에 동적 배율 조정을 위해 표시 모드를 선택합니다: (1) 빨간색(버프링)/녹색(배경) 결합된 보기 또는 (2) 흰색(버프링)/및 검은색(배경) 보기) 동적 채점 모드는 조나 펠루시다의 자동 채점에 사용됩니다.
3. 계란 성숙도 검사
- 예복 기간(3−4 h) 후, ICSI의 표준 시간(hCG 트리거 후 39-40시간)에서 난모체 성숙 상태를 드러내는 PLM 검사를 수행한다.
- 모든 oocytes를 PLM 접시에 개별 물방울로 옮기고 스핀들 이미징을 위해 준비된 반전된 현미경 아래에 놓습니다. 검사를 시작하기 전에 유리 바닥 접시에서 플라스틱 뚜껑을 제거하십시오.
- 첫 번째 난모세포에 초점을 맞춥니다. 녹색 표시등 아래에서 셀을 검색하기 어려운 경우 녹색 필터를 일시적으로 꺼냅니다. 분석 전에 녹색 필터가 삽입되었는지 확인합니다.
- 컴퓨터 로 처리되고 컴퓨터 화면에 실시간으로 표시되는 감지 된 oocyte birefringence 이미지 (녹색 배경에 빨간색 / 주황색)를 관찰하십시오. 접안 렌즈에는 신호가 표시되지 않습니다.
- 빛 노출을 알리는 메시지가 너무 낮음/높으면 현미경의 광 강도 노브를 사용하여 밝기를 적절한 강도로 조정합니다.
- PB가 12시 위치에 있고 PB에 초점을 맞출 수 있도록 유지 및 ICSI 바늘을 사용하여 oocyte를 돌립니다.
- PB 부근에서 스핀들 버블러링이 눈에 띄지 않는 경우, 조나 펠루시다를 살짝 만져 각 축 주위로 난모세포를 부드럽게 돌리면 배열 스핀들 섬유와 편광된 빛의 정렬을 보장한다(보조비디오 ). OOCyte가 엄격한 회전에도 불구하고 스핀들 신호를 표시하지 못하는 한 MII 스핀들의 부재를 선언합니다.
- 관찰 된 birefringence 패턴에 따라, 다음과 같은 범주로oocytes를 분류 (그림 2): (A) 명확하게 묘사 된 경계와 birefringence의 균일 한 분포와 양극성 배럴 모양의 MII 스핀들의 밝은 신호와 난모 세포 ; (b) 난모세포이형성, 비정형 및 반투명 MII 스핀들 및 불규칙한 경계 및 불균일한 신호 분포; (c) 난모에서 검출 가능한 MII 스핀들 버플레링전이 없는 난모세포; (D) ANaphase I/텔로페이즈 I 난모세포, MII 스핀들 대신 미세관 교량(첫 번째 PB와 난모세포 사이의 결합 가닥)을 나타낸다.
참고: 검출 가능한 MII 스핀들 신호(등급 A 또는 B)가 있는 Oocyte는 즉각적인 ICSI에 적합합니다. - 보고서 및/또는 후속 이미지 분석을 위해 스냅샷(F9)을 찍거나 비디오를 녹화합니다. 작업자의 주관성을 줄이기 위해 이미지 패턴에 대한 문서를 보관하십시오.
- 다음 난모세포의 위치로 이동하고 3.6−3.9 단계를 반복합니다.
4. ICSI 타이밍 최적화
- 모든 스핀들 양성 난모세포(등급 A 또는 B, 3.8단계)를 ICSI 접시에 옮기고 표준 프로토콜24,25에따라 ICSI를 적용합니다.
- 난모세포가 검출 가능한 MII 스핀들 신호를 보이지 않는 경우,PLM 접시를 CO2- 독립적인 인큐베이터에 넣고 ICSI를 나중에 이동시다.
- PLM 재검사를 수행 ~2−3 시간 후 단계 3.3−3.9. 일부 oocyte (들) 여전히 MII 스핀들이 없는 경우, 추가 1−2 시간 ICSI를 지연.
- ICSI 접시에 모든 oocytes를 전송하고 표준 프로토콜24에따라 주입. PLM 접시가 미세 사출 바늘의 굽힘 각도와 호환되는 경우 밝은 필드 모드로 전환한 후 PLM 접시에서 즉시 ICSI를 수행합니다.
- ICSI에 따라, 배아 재배 및 배양을 위한 준비된 판에 난모세포가 배반포 단계까지 옮겨.
Representative Results
편광 광 현미경 검사법은 난모세포가 ICSI 이전에 핵 성숙을 완료하고 MII 스핀들을 조립했는지 즉시 검사할 수 있게 합니다. 비침습적 특성으로 인해 임상 설정11,12,13,14에서수정에 대한 인간 난자의 준비 상태를 안전하게 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 스핀들 난모세포는 스핀들9,15, 16,17,18,19,등 난모세포보다 생존 가능한 배아를 발생시킬 가능성이 더 높습니다. 20개 , 21세 , 22세 , 23. 또한, 뚜렷한 양극성 스핀들을 특징으로하는 난모세포는 이형성 스핀들 9,21,22를가진 난모세포보다 더 높은 발달 능력을 가진 것으로 보인다. 종합하면, 스핀들 이미징은 성공적으로 수정될 가능성이 가장 큰 난모세포를 식별하고, 착상 전 발달을 거치며, 전임 임신 9,15, 16세 , 17세 , 18세 , 19세 , 20개 , 21세 , 22세 , 23.
스핀들의 보고된 부각은 변화합니다 (44−97%) 연구 인구의 다양성을 반영9,15,16,17,18,19,20,21, 22세 , 23세 , 26세 , 27세 , 28. 생체 내에서 정상 응답자로부터 난모세포는 일반적으로 hCG 트리거9,18,27,29후 40 시간에서 양극성 MII 스핀들을 보여줍니다. 그러나, 느린 응답자에서, preovulatory 여포에서 회수된 난모세포의 풀은 성숙지연 9,27에의해 영향을 받습니다. 여기서, 스핀들 이미징은 MII 단계에서 체포된 난모체를 중요한 성기 전이를 겪고 있는사람들로부터 차별하기 위해 수행되어야 한다(그림 3). 우리는 회수 즉시 여포 세포의 제거를 권장하고, 별도의 우물에서 MI 및 MII oocytes의 배양은 생체 외에서 PB압출 후 성숙 oocytesIns, ICSI 직전에. ICSI 직전에 변색이 수행되는 경우, 이 두 집단의 난모세포는 PB 외관에 따라 구별할 수 없다.
PLM 패턴의 위상별 변화는 meiotic 성숙 동안 스핀들 역학에 대한 지식의 맥락에서 해석되어야 합니다. 인터키네시스 동안, 분열 장치는 광범위한 구조 개편을 거치고 PLM신호는 일시적으로 1,9,10,11이사라진다. 따라서, 시험관 내에서 PB를 압출하는 난모세포가 발달적으로 지연되고, MII 스핀들 신호의 부재는 반드시 세포 장애를 반영하지 않을 수 있지만MII 단계로의 난모세포의 진행을 나타낼 수 있다(도 3). 정자가 생리학적 시점에서 주입되는 경우, 계란의 발달 잠재력이 손상됩니다. 연기 ICSI는 그의 존재가 더 나은 임상 결과와 연관되는 MII 스핀들을 조립하는 더많은 시간을 늦게 성숙 한 oocytes를 제공합니다 9,10,11. 느리고 가난한 응답자를 관련시키는 임상 연구에서, PLM 재검사 약 2 시간 후에9전에 처음 스핀들 음성 oocytes의 거의 60%는 스핀들 신호를 개발했습니다. 발달 단계 및 후기 성숙 oocytes의 전반적인 적합성에 따라, PB 압출 후 MII 스핀들 외관은 전형적으로 2-6 시간 (미공개 관찰)이 걸립니다. 첫 번째 PLM 검사 동안 미세소관 교량 (anaphase /telophase, 등급 D)을 나타내는 난모세포는 눈에 보이는 스핀들 (신흥 스핀들, 등급 C)이없는 oocytes보다 MII 스핀들 신호를 개발하는 데 더 오랜 시간이 필요합니다. ICSI의 발병 시간을 난자의 발달 단계에 대한 개별적인 조정은 난모세포의 조기 활성화를 방지하고 개선된수정률 및 성공적인 배아 발달을 초래한다 9.
시험관내에서 PB를 압출하는 후기 성숙 난모세포는 일반적으로 생체내 성숙난모세포에 비하여 발달 능력이 낮지만, ICSI 지연(blastulation) 이전에 검출 가능한 스핀들을 조립하는 경우 배아 발달 속도가 허용됩니다. 비율 41.32%)9. 이 접근을 사용하여, 불임 처리를 위해 일반적으로 거절되는 미성숙한 난모세포조차도, 임상으로 이용되고, 양도가능한 태아를 생성하고, 가득 차있는 임신을 초래할 수 있습니다. 각 개별 난모세포의 성숙단계의 평가는 미성숙한 난모세포의 체외 성숙을 수행한 후 소수의 MII 난모세포 및/또는 구조 된 난모세포를 산출하는 불량한 예후 사이클에 특히 유리하다.
난자 성숙도 평가 외에도, 스핀들 이미징은 아나페이즈 I/텔로페이즈 난모세포에서 스핀들 파괴를 피하기 위해 PB 생검 이전에도 권장됩니다. 실험적 발생학에서, meiotic 스핀들의 가시화는 난자 핵형성 및/또는 스핀들 전달 절차13동안 사용된다.
그림 1: 인간 난모세포 성숙. 생체내에서 성숙난난모세포(MII)는 검색시에 PB를 나타낸다. 미성숙 난모세포(GV, MI)는 시험관 내에서 자발적으로 성숙을 완료할 수 있다. 배율 표시줄 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: PLM 검출 패턴에 기초한 우모세포 분류. 스핀들 신호의 외관에 기초한 oocyte 등급(A-D)의 대표적인 예. PLM 검출 패턴:(A) 양극성 스핀들,(B) 반투명 극성 MII 스핀들 스핀들, (C) 검출 가능한 스핀들 없음 및 (D) 미세 투병 브리지의 눈에 띄는 신호. 배율 표시줄 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 난모세포 성숙에서 MII 전이에 대한 MI의 단계. 밝은 필드 (상단 행)에서 난모세포의 출현은 염색체 (시안) 및 미세 소관 (마젠타)의 형광 신호와 결합되고 편광 광 (아래쪽 행)이 표시됩니다. 각 난모세포는 먼저 PLM-검사하고 즉시 고정되었다. 고정 난모세포는 (면역) 호흐트트(DNA) 및 항α-tubulin 항체(microtubules)로 표지되었다. 노란색 화살표는 PB의 존재를 나타내고 흰색 화살표는 이중 관상 미세 소관의 위치를 강조 표시합니다. 배율 막대 = 20 μm. 이 수치는 Holubcová 외, JARG 20199에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 편광 광 현미경 검사법에 의해 검출된 탈모패턴과 염색체-미세소관 조직의 상관관계. 염색체 (시안) 및 미세 소관 (마젠타)에 대한 형광 신호와 결합 된 밝은 분야에서 난모세포의 출현 (맨 위 행) 및 편광 광 (맨 아래 행)이 표시됩니다. 각 난모세포는 PLM 검사 직후에 고정되었다. DNA(Hoechst) 및 미세투관(α-tubulin)을 염색하였다. (A-C)PLM 검출 가능한 스핀들 아직 잘못 정렬 된 염색체(A, B)또는 느슨하게 초점을 맞춘 스핀들 극 (C)를 가진 난모세포; (D-F)PLM 검출 가능한 MII 스핀들 없이 비정상적인 난모세포가 저개발(D), 극성(E) 또는 스핀들 없음(F)을 나타냈다. 흰색 화살표는 이중 관제 미세소관의 위치를 강조하고 별표 (*)는 데콘덴서드 염색체의 위치를 나타냅니다. 배율 표시줄 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 인간 난모세포에서의 비병구조. 대표적인예로(A-D)인간 난모세포에서 PLM에 의해 검출된 이중골구성구조. ZP = 조나 펠루시다; PM = 혈장 막 (난모); RB = 굴광체, 액쿨레. 흰색 화살표, 성숙의 다른 단계에서 meiotic 스핀들. (E) MII 스핀들 극체(PB)와의 정렬 불량. (F) 플라즈마 막에서 스핀들 분리. 배율 표시줄 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 1: 이미지 분석 소프트웨어의 데스크톱 레이아웃입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 : PLM 검사 절차. 난모세포의 회전은 스핀들(화살표)의 존재를 배제하는 데 필요하다. 배율 표시줄 = 20 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
인간의 난모세포에서 의 한중심 간 meiotic 스핀들은 매우 역동적이고 섬세한 구조1. 최적이 아닌 조건에서 미세 소관 섬유는 신속하게 중합되고 meiotic 스핀들은30,31,32,33을분해합니다. 따라서, 난모세포 배양 및 미세 조작 조건, 즉 온도 및 pH가 최적의 범위에 있는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 스핀들 중단의 위험을 최소화하기 위해, 난모세포는 난모세포 매질에서 37±0.5°C를 유지하는 온도 제어 환경에 보관되어야 한다. 가열 된 단계가 장착 된 현미경 및 미세 주입 설정의 사용은 엄격히 필요합니다. 인큐베이터 외부의 난모세포로의 모든 조작은 pH 플루트화를 피하기 위해 HEPES/MOPS 완충매체에서 수행되어야 합니다. 주변 조건에서 과도한 난모세포 전달의 잠재적 인 부작용을 피하기 위해, PLM 검사의 총 시간은 10 분을 초과해서는 안된다. 난모세포는 빔 경로에 표준 플라스틱의 위치가 이미지 분석을 손상하기 때문에 제거 플라스틱 뚜껑과 유리 바닥 접시에 분석되어야한다. 플라스틱 과 유리 바닥 접시는 열 특성이 다르기 때문에 시험 접시의 취급 매체에서 온도를 직접 확인해야합니다.
실험실 조건 외에도 절차상의 차이와 작업자의 미세 조작 기술이 PLM 검사 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다. 고도로 조립된 양극성 스핀들만이 비침습적으로 시각화할 수 있습니다. 관찰된 신호는 스핀들의 구조 조직 정도에 비례한다. 초기, 극성, 느슨해지거나 혼란스럽게 된 스핀들만 흐린 버블러링 또는 전혀 표시되지 않습니다(그림3 및 그림4). 게다가, 미세 투과 어레이와 편광 빛의 불완전한 정렬은 잘 발달 된 양극성 스핀들의 실제 존재에도 불구하고 반투명하고 잘못 정의 된 버프링만 생성합니다(그림4). 제대로 지향하지 않는 한, 스핀들 신호는 쉽게 놓칠 수 있고난모세포 성숙도가 잘못 진단될 수 있습니다(보충 비디오). 최적의 스핀들 이미징을 위해 난모세포는 각 축을 적절히 돌려야 합니다. 비배림은 안구에 표시되지 않기 때문에 작업자는 oocyte의 회전을 수행하는 동안 컴퓨터 화면을 보아야 합니다. 시험관 내 성숙 난모세포에서 미세 조작 및 스핀들 이미징 훈련에 대한 이전의 경험은 임상 응용 프로그램으로 전환하기 전에 바람직하다.
스핀들 외에, 난모, 난모, 조나 펠루시다 및 일부 세포질 구조의 내층(예를 들어, 굴절체, 액포)을 둘러싸는 적혈구 세포는 birefringence(도 5A-D)를 나타낸다. 화상 진찰의 앞에 난모세포에서 철저하게 제거하지 않는 한, 단단히 붙어 있는 여포 세포는 배경 잡음을 일으키고 meiotic 스핀들 검출을 손상합니다. 큰 굴착식 바디를 스핀들로 착수하지 않도록 주의하십시오. 세포질에 거주하는 많은 세포질 개재부는 어두운 배경과 극명하게 대조되는 높은 밝기를 표시합니다. Meiotic 스핀들, 다른 한편으로는, 단지 적당한 신호, 흐린 경계를 전시하고 전형적으로 첫번째 PB의 밑에 또는 인접한 oolema에 붙습니다. 때때로, PLM 시험은 표준 위치로부터의 총 스핀들 편차를 드러낸다(도5E,F). 분할 장치와 PB 사이에 큰 오정렬이있는 경우, PLM은 미세 주입 중 스핀들 부상의 위험을 피하기 위해 난모 세포방향을 지정하는 데 도움이됩니다. 난모세포 내스핀들의 상대적 위치는 생성된 배아(17,34)의발달 잠재력에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 그러나 스핀들이 난모에서 경쟁적으로 분리되면 수정 이상이 발생합니다. 흥미롭게도, 일부 품질 난모세포는 미세관 핵 형성을 시작하는 대신 PB 압출 직후크로마틴 데톤을 겪습니다(그림4F). 종래의 경검사법과 PB를 난모세포 성숙의 유일한 마커로서 사용하는, 이러한 하위 유능한 난모세포는 만개할 수 있는 것으로 간주될 것이다. 따라서, 일상적인 형태학적 평가의 상단에, 스핀들 화상 진찰은 계란의 성숙도에 관하여 중요한 정보를 추가하고 그것의 질의 간접적인 마커로 봉사할 수 있습니다.
스핀드 MII 난모세포의 발생률은 연구 집단의 특성(예를 들어, 유전적 배경, 건강 상태, 모성 연령)에 의해 영향을 받을 가능성이 높다. 또한, 코호트 내의 발달 지연 된 난모세포의 비율은 검출 된 스핀들 음성 난모세포의실제 수에 영향을 미칠 것이다 9,27. Meiotic 스핀들 시각화를 통해 MII 단계에서 체포된 잔인성 난모를 명확하게 식별할 수 있습니다. 더욱이, 후일의 제2 검사는 스핀들 음성 oocyte가 비정상적인지 또는 MI/MII 전이를통해 최근에 진행되었는지 여부를 밝힐 수 있다 9,10,11. ICSI 이전에 스핀들을 개발할 수 있게 되면, 일상적으로 버려지고 있는 미성숙한 난모세포조차도생존 가능한 배아 9를 생성할 수 있다. 수정에 사용할 수 있는 난모세포가 거의 없는 사이클에서, 미세하게 시간제한된 ICSI의 난모세포 압출 PB는 주기 취소에 대한 구조 전략 및 대안으로 작용할 수 있다.
그럼에도 불구하고, 예인양 시간을 연장하는 것은 모든 난모세포로 일반화되어서는 안된다. 생체 내에서 정상 반응자로부터 성숙한 난모세포는 전형적으로MII 스핀들 9,20,21,27을나타낸다. 여기에서, 성공적인 스핀들 화상 진찰의 기회는 시험관 내 노화35의결과로 시간에 따라 감소합니다. 가능하면, ICSI는 검색 당일에 수행되어야 하며 9시간(45시간 포스트 hCG)을 초과해서는 안 되며, 그 결과 배아 품질 이 저하와 관련된 기간(36,37)을초과해서는 안 된다. 뚜렷한 양극성 스핀들을 표시하는 난모세포는 더 이상 지체없이 ICSI를 받아야합니다. 요약하면, ICSI 타이밍의 개별화 최적화는 조기 정자 주입의 어떤 리스크든지 제외하기 위하여 가난한 예후 환자에서 가치가 있습니다. 그러나, 모든 IVF 주기에서 수행될 불필요하고, 너무 많은 시간이 걸리고 힘들다.
PLM 분석은 난모세포가 MII 단계에 도달했는지 여부를 밝혀냅니다. 그러나, meiotic 스핀들의 비침습적 시각화는 염색체 조직에 관하여 아무 정보도 제공하지 않습니다. 양극성 스핀들을 특징으로 하는 난모세포에서 가혹한 염색체 부합 및/또는 모계 나이 관련염색질 분할이 있을지도 모릅니다 (그림 5). 다양한 다른 요인은 생식 성공 (예를 들어, 정자 인자, 미토콘드리아, 배아 게놈 활성화, 불규칙한 분열, 후성 유전학, 자궁 내막, 모계 면역)에 상당한 영향을 미친다. 따라서, MII 스핀들의 검출은 그 당, IVF 절차의 양성 임상 결과를 보장하지 않는다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 Reprofit 인터내셔널의 배아학 실험실에 감사드립니다. 우리는 또한 MEYS CR (LM2015062 체코 바이오 이미징)에 의해 지원되는 CEITEC의 핵심 시설 CELLIM이 여기에 제시된 면역 형광 이미징 데이터를 획득하는 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 90164 | bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture |
| Denuding micropipette 150 µm | Microtech IVF | 005-150C | |
| Denuding micropipette 180 µm | Microtech IVF | 005-180B | suitable for oocyte transfer between dishes |
| Denuding micropipette 200 µm | Microtech IVF | 005-250-A | suitable for oocyte transfer between dishes |
| FluoroDish | World Precision Instruments | FD 5040-100 | glass-bottom dish |
| (alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells) | |||
| Holding micropipette | Microtech | 001-120-30 | sterile glass microneedles |
| Hyaluronidase solution | Irvine Scientific | 90101 | for oocyte denudation |
| ICSI micropipette | Microtech | 002-5-30 | sterile glass microneedles |
| Micro Droplet Culture Dish | Vitrolife | 16003 | 12-well plate for embryo culture |
| Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin | Irvine Scientific | 90163 | handling medium, MOPS/HEPES buffered |
| Nikon Eclipse TE 2000-U | Nikon | inverted microscope with heated stage | |
| Nunc IVF Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 150270 | plastic ICSI dish |
| Nunc non-treated 4-well IVF dish | Thermo Fisher Scientific | 179830 | 4-well plate for embryo culture |
| OCTAX polarAide | MTG | integrated PLM system | |
| Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | oil for overlay |
| Polyvinylpyrrolidone | Irvine Scientific | 90123 | for sperm immobilization prior to ICSI |
References
- Holubcova, Z., Blayney, M., Elder, K., Schuh, M. Human oocytes. Error-prone chromosome-mediated spindle assembly favors chromosome segregation defects in human oocytes. Science. 348 (6239), 1143-1147 (2015).
- Oudendijk, J. F., Yarde, F., Eijkemans, M. J., Broekmans, F. J., Broer, S. L. The poor responder in IVF: is the prognosis always poor?: a systematic review. Human Reproduction Update. 18 (1), 1-11 (2012).
- Gautam, N., Allahbadia, Y. M. Ovarian Stimulation Protocols. , Springer. India, Mumbai, India. (2016).
- Piqueras, P., et al. Live birth after replacement of an embryo obtained from a spontaneously in vitro matured metaphase-I oocyte. Systems Biology in Reproductive Medicine. 63 (3), 209-211 (2017).
- Liu, J., Lu, G., Qian, Y., Mao, Y., Ding, W. Pregnancies and births achieved from in vitro matured oocytes retrieved from poor responders undergoing stimulation in in vitro fertilization cycles. Fertility and Sterility. 80 (2), 447-449 (2003).
- Shu, Y., et al. Fertilization, embryo development, and clinical outcome of immature oocytes from stimulated intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertility and Sterility. 87 (5), 1022-1027 (2007).
- Sachdev, N. M., Grifo, J. A., Licciardi, F. Delayed intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with trophectoderm biopsy and preimplantation genetic screening (PGS) show increased aneuploidy rates but can lead to live births with single thawed euploid embryo transfer (STEET). Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (11), 1501-1505 (2016).
- De Vos, A., Van de Velde, H., Joris, H., Van Steirteghem, A. In-vitro matured metaphase-I oocytes have a lower fertilization rate but similar embryo quality as mature metaphase-II oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 14 (7), 1859-1863 (1999).
- Holubcova, Z., et al. Egg maturity assessment prior to ICSI prevents premature fertilization of late-maturing oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 36 (3), 445-452 (2019).
- Montag, M., Schimming, T., van der Ven, H. Spindle imaging in human oocytes: the impact of the meiotic cell cycle. Reproductive BioMedicine Online. 12 (4), 442-446 (2006).
- Montag, M., van der Ven, H. Symposium: innovative techniques in human embryo viability assessment. Oocyte assessment and embryo viability prediction: birefringence imaging. Reproductive BioMedicine Online. 17 (4), 454-460 (2008).
- Keefe, D., Liu, L., Wang, W., Silva, C. Imaging meiotic spindles by polarization light microscopy: principles and applications to IVF. Reproductive BioMedicine Online. 7 (1), 24-29 (2003).
- Caamano, J. N., Munoz, M., Diez, C., Gomez, E. Polarized light microscopy in mammalian oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 45, 49-56 (2010).
- Eichenlaub-Ritter, U., Shen, Y., Tinneberg, H. R. Manipulation of the oocyte: possible damage to the spindle apparatus. Reproductive BioMedicine Online. 5 (2), 117-124 (2002).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. The spindle observation and its relationship with fertilization after intracytoplasmic sperm injection in living human oocytes. Fertility and Sterility. 75 (2), 348-353 (2001).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Keefe, D. L. Developmental ability of human oocytes with or without birefringent spindles imaged by Polscope before insemination. Human Reproduction. 16 (7), 1464-1468 (2001).
- Moon, J. H., et al. Visualization of the metaphase II meiotic spindle in living human oocytes using the Polscope enables the prediction of embryonic developmental competence after ICSI. Human Reproduction. 18 (4), 817-820 (2003).
- Cohen, Y., et al. Spindle imaging: a new marker for optimal timing of ICSI? Human Reproduction. 19 (3), 649-654 (2004).
- Rama Raju, G. A., Prakash, G. J., Krishna, K. M., Madan, K. Meiotic spindle and zona pellucida characteristics as predictors of embryonic development: a preliminary study using PolScope imaging. Reproductive BioMedicine Online. 14 (2), 166-174 (2007).
- Heindryckx, B., De Gheselle, S., Lierman, S., Gerris, J., De Sutter, P. Efficiency of polarized microscopy as a predictive tool for human oocyte quality. Human Reproduction. 26 (3), 535-544 (2011).
- Kilani, S., Cooke, S., Tilia, L., Chapman, M. Does meiotic spindle normality predict improved blastocyst development, implantation and live birth rates? Fertility and Sterility. 96 (2), 389-393 (2011).
- Kilani, S., Chapman, M. G. Meiotic spindle normality predicts live birth in patients with recurrent in vitro fertilization failure. Fertility and Sterility. 101 (2), 403-406 (2014).
- Tilia, L., Venetis, C., Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Is oocyte meiotic spindle morphology associated with embryo ploidy? A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 105 (4), 1085-1092 (2016).
- ESHRE Guideline Group on Good Practice in IVF Labs, De los Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Human Reproduction. 31 (4), 685-686 (2016).
- Principles of IVF Laboratory Practice: Optimizing Performance and Outcomes. Montag, M., Morbeck, D. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2017).
- Chamayou, S., et al. Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos. Reproductive BioMedicine Online. 13 (5), 661-667 (2006).
- Rienzi, L., et al. Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar body position and oocyte developmental potential after ICSI. Human Reproduction. 18 (6), 1289-1293 (2003).
- Woodward, B. J., Montgomery, S. J., Hartshorne, G. M., Campbell, K. H., Kennedy, R. Spindle position assessment prior to ICSI does not benefit fertilization or early embryo quality. Reproductive BioMedicine Online. 16 (2), 232-238 (2008).
- Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Time course of meiotic spindle development in MII oocytes. Zygote. 19 (1), 55-62 (2011).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Human Reproduction. 16 (11), 2374-2378 (2001).
- Sun, X. F., Wang, W. H., Keefe, D. L. Overheating is detrimental to meiotic spindles within in vitro matured human oocytes. Zygote. 12 (1), 65-70 (2004).
- Mullen, S. F., et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of human oocytes, and the relevance to cryopreservation. Human Reproduction. 19 (5), 1148-1154 (2004).
- Swearman, H., et al. pH: the silent variable significantly impacting meiotic spindle assembly in mouse oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 37 (3), 279-290 (2018).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human Reproduction Update. 17 (1), 34-45 (2011).
- Miao, Y. L., Kikuchi, K., Sun, Q. Y., Schatten, H. Oocyte aging: cellular and molecular changes, developmental potential and reversal possibility. Human Reproduction Update. 15 (5), 573-585 (2009).
- Pujol, A., Garcia, D., Obradors, A., Rodriguez, A., Vassena, R. Is there a relation between the time to ICSI and the reproductive outcomes? Human Reproduction. 33 (5), 797-806 (2018).
- Yanagida, K., et al. Influence of oocyte preincubation time on fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (8), 2223-2226 (1998).
