Summary
Мы предоставляем наброски клинического протокола для неинвазивной оценки зрелости яйцеклеток человека с использованием поляризованной световой микроскопии.
Abstract
Оптимальное время инъекции интрацитоплазмической спермы (ICSI) вызывает серьезную озабоченность в отношении программ фертильности, поскольку несвоевременный ввод спермы уменьшает компетентность яйцеклетки в развитии. Наличие первого полярного тела (ПБ) вместе с мейотическим шпинделем указывает на завершение созревания яйцеклеток и готовность яйцеклетки к оплодотворению. В клинической практике принято считать, что все яйцеклетки, отображающие ПБ, являются зрелыми метафазными (МИИ) ооцитами. Тем не менее, экструзия ПБ предшествует образованию биполярного шпинделя MII. Это асинхронность делает простое присутствие ПБ ненадежным маркером зрелости яйцеклеток. Неинвазивная визуализация шпинделей с использованием поляризованной световой микроскопии (PLM) позволяет быстро и легко проверить, действительно ли ПБ-отображающий яйцеклетки собрал мейотический шпиндель до ICSI. Здесь мы представляем стандартный протокол для выполнения оценки зрелости яйцеклеток человека в клинической лаборатории. Мы также показываем, как оптимизировать время ИКСИ в отношении стадии развития яйцеклетки, чтобы предотвратить преждевременную инъекцию спермы поздне зрелых яйцеклеток. Используя этот подход, даже незрелые яйцеклетки экструдируют ПБ in vitro могут быть клинически использованы. Подтверждение того, что MII шпиндель присутствует до инъекции спермы и индивидуальной корректировки времени ИКСИ особенно важно в плохом прогнозе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) циклов с низким количеством яйцеклеток доступны для оплодотворения.
Introduction
Чтобы стать оплодотворенной гаплоидной яйцеклеткой, диплоидный ооцит должен выдыхать половину своей генетической информации в соседнюю клетку, называемую первым полярным телом (ПБ), и выровнять хромосомы на экваторе биполярного метафазы II (MII) шпинделя. В то время как ПБ можно четко наблюдать с помощью обычной световой микроскопии, обнаружение генетического материала и цитоскелетных структур обычно требует инвазивных подготовительных процедур, которые несовместимы с дальнейшим использованием яйцеклетки для лечения бесплодия. Следовательно, в клинической практике, наличие ПБ рассматривается как отличительная черта зрелости яйцеклеток. Тем не менее, живое изображение микротрубовечной и хромосомой динамики во время созревания яйцеклеток человека показало, что ПБ становится видимым за пару часов до того, как биполярный шпиндель MII собирается и хромосомы выровнены1. Тем не менее, в передаваемом свете, MII арестованных яиц неотличимы от яйцеклеток, которые только что вступили в процесс сегрегации хромосомы. Таким образом, когорта яйцеклеток, классифицируемых как ооциты MII, основанные только на присутствии ПБ, может содержать позднезрелые яйцеклетки, которые еще не завершили свое развитие и, таким образом, не готовы к оплодотворению.
Задержка созревания яйцеклеток, вероятно, повлияет на население бедных респондентов с низким числом Ооцитов MII и высокая доля незрелых яйцеклеток, собранных неожиданно в стимулированных циклов2. In vivo, только одно, самое лучшее качество яйцеклетки достигает зрелости и становится овуляцией. В циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) контролируемая гиперстимуляция яичников используется для набора нескольких яйцеклеток для созревания. Гонадотропин всплеск вызывает возобновление meiotic программы и яйцеклетки прародители должны достичь стадии ареста MII в течение 36 часов3. Тем не менее, яйцеклетки, извлеченные из предовулирующих фолликулов часто составляют ассортимент PBdisplaying MII яйцеклеток и незрелых яйцеклеток, либо на метафазе I (MI) или зародышевой стадии везики (GV) (Рисунок 1). Только ооциты MII подвергаются интрацитоплазматической инъекции спермы (ICSI), в то время как незрелые яйцеклетки, как правило, отбрасываются. Тем не менее, при выращивании в пробирке, MI ооцитов обычно наблюдается экструдировать ПБ в пробирке. Несмотря на их общую неполноценность, поздние созревания яйцеклеток, которые спонтанно завершили первое мейотическое деление во время ночной культуры были успешно использованы в качестве последних ооцитов ресурсов, и живые рождения были зарегистрированы4,5 ,6,7,8. Таким образом, несвоевременная инъекция спермы может быть основной причиной, лежащей в основе плохих исходов развития поздних созревания яйцеклеток сообщили в предыдущих исследованиях9,10,11.
Поляризованная световая микроскопия (ПЛМ) в сочетании с программным обеспечением обработки изображений позволяет неинвазивную визуализацию мейотического шпинделя в живом яйце. Двойное отражение генерируется взаимодействием поляризованного светового луча с высоко упорядоченной сборкой микротрубок, строящихся биполярным шпинделью. Так как поляризованный свет имеет нормальную интенсивность, метод можно смело использовать в клинических условиях для просмотра динамики аппарата деления11,12,13,14. Присутствие MII шпиндель birefringence в яйцеклетки была определена в качестве маркера развития компетенции яйца9,15,16,17,18, 19,20,21,22,23. Таким образом, было высказано предположение, что неинвазивные мейотической визуализации шпинделя могут быть использованы для контроля качества яйцеклеток в клинической практике11,14,20.
Так как шкала времени для микротрубочной динамики во времяооцита мейоза была решена 1, наблюдаемый шаблон PLM может быть лучше связан с течением времени MI к переходу MII. Вскоре после выброса ПБ, зарождающийся шпиндель MII становится обнаружить PLM. Однако, если яйцеклетки хранятся в культуре, сигнал birefringence может появиться позже, когда биполярное MII шпиндель сборки9,10,11. Таким образом, в яйцеклетки, выдающей ПБ in vitro, отсутствие шпинделя может быть лишь временным, соответствующим физиологическому переходу позднего созревания яйцеклетки от МИ к стадии MII. Если сигнал шпинделя MII необнаруживается, инъекция спермы может быть отложена на более поздний срок, обеспечивающий дополнительное время для формирования шпинделя MII. PLM-помощь оптимизации времени ИКСИ максимизирует вероятность позднего созревания яйцеклеток, которые будут клинически использованы и сделать разницу для бедных пациентов прогноз9.
Ниже мы предоставляем пошаговый протокол о том, как выполнять неинвазивную визуализацию шпинделя в ооцитах человека. Мы также демонстрируем, как PLM может быть использован, чтобы избежать риска преждевременного оплодотворения поздних созревания яйцеклеток.
Protocol
Этот протокол описывает клиническую процедуру, которая является «дополнением» к стандартному лечению ЭКО. Она должна быть выполнена опытным персоналом в соответствии с хорошей лабораторной практикой и клиническими рекомендациями24,25. Рекомендуется получить письменное информированное согласие пациентов, имеющих на это право. Этот протокол был одобрен институциональным комитетом по этике.
1. Извлечение и денонсация яиц
- Побудить стимуляцию яичников с помощью обычных протоколов стимуляции3. Отрегулируйте дозу к индивидуальному ответу. Когда два или более фолликулов, визуализированные с помощью ультразвукового сканирования, достигают диаметра 18 мм, вызывают созревание яйцеклеток с применением 250 мкг хорионического гонадотропина (ХГЧ). Расписание пикап айоцитов (OPU) на 35-36 ч после инъекции ХГЧ.
- Сбор извлеченных кутулус-ооцитных комплексов (COCs) в CO2- независимая среда обработки (Таблицаматериалов). После короткого инкубационного периода (10–15 мин) в CO 2-независимом инкубаторе, кратко (до 30 с) подвергнет собранные КОК раствору гиалуронидаза (Таблицаматериалов). Под стереомикроскопом, механически удалить кучевые корона клетки, мягко pipetting COCs с 200 Л фильтра наконечника.
- Используя микропипеты денудата с постепенно уменьшающимся диаметром (200 мкм, 180 мкм и 150 мкм), аккуратно снимите яйцеклетки с оставшихся фолликулярных клеток и вымойте ооциты 3x в среде обработки.
- Оцените количество и состояние развития огой в зависимости от наличия или отсутствия ядра и первого ПБ(рисунок1).
- Проверьте критерии включения для экзамена PLM. Провести оценку зрелости яйцеклетки, если есть (1) неожиданный плохой ответ на обычную стимуляцию с менее чем 6 МИИ яйцеклетки, собранные в OPU и (2) история предыдущего отказа оплодотворения или незрелости яйцеклеток.
- Поместите GV, MI и MII ооциты в отдельные скважины в блюдо ЭКО, каждый из которых содержит 500 л предварительно оцинкованных CO2-зависимой культуры среды (Таблица материалов) покрыты минерального масла (Таблица материалов).
- Инкубировать еще 3-4 ч при 37 градусах Цельсия в увлажненной атмосфере 5% O2 и 6% CO2.
2. Подготовка к обследованию ПЛМ и последующего ИКСИ
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, представленный здесь, описывает оценку PLM, проведенную с использованием системы OCTAX Polar AIDE(Таблица материалов). Кроме того, могут использоваться другие коммерчески доступные системы зрения шпинделя.
- Подготовьте пластины для выращивания эмбрионов.
- В зависимости от количества яйцеклеток, которые должны быть рассмотрены (всего MII ооцитов, и MI ооцитов экструдирования ПБ во время периода преинкубации), подготовить либо 4-колодец пластины или 12-колодской пластины, заполнить каждый колодец с 500 qL или 30 л культуры среды, соответственно , и покрыть ранее уравновеш— минеральным маслом.
- Убедитесь, что как культура среднего и минерального масла были уравновешты в ИНкубаторCO2 в одночасье. Держите приготовленное блюдов CO 2-зависимых инкубатор, по крайней мере 2 h. Номер скважин, если это необходимо для отслеживания развития судьбы отдельных яйцеклеток.
- Приготовьте блюдо ICSI.
- Используйте назначенное пластиковое блюдо и сделайте 5 капель l предварительно разогретой обработки среды для каждого ПБ-отображения яйцеклетки и одна дополнительная капля для мытья иглы. Сделать дополнительную капельку поливинилпирролидона (PVP) раствор(Таблица материалов) для иммобилизации спермы до ИКСИ (добавить сперму непосредственно перед ИКСИ) и наложения с предварительно разогретого минерального масла.
- Храните приготовленное блюдо ICSI в CO2-независимый инкубатор, по крайней мере 20 мин. Номер скважин, если это необходимо для отслеживания яйцеклеток после ИКСИ.
- Приготовьте блюдо для осмотра PLM.
- Используйте назначенное стеклянное дно блюдо и сделать 5 капель L предварительно йодиченной обработки среды для каждого PB-отображения яйцеклетки. Наложение с преднагреваемым минеральным маслом.
- Держите блюдо в CO2-независимый инкубатор, по крайней мере 20 мин. Номер капель при необходимости для отслеживания яйцеклеток после PLM экспертизы.
- Установите микроскоп готов к исследованию PLM.
- Заранее переключите на нагретую стадию на перевернутый микроскоп, чтобы добиться правильной температуры потепления. Убедитесь, что настройки точно скорректированы для поддержания 37 градусов по Цельсию при обработке средних капель в тарелке PLM/ICSI во время процедур микроманипуляции.
- Приготовь стерильное удержание и иглу ICSI в держатели микроинъекций и привлечь их внимание. Кроме того, используйте иглу для вылупления.
- Выберите подходящую цель (20x и 25x являются наиболее подходящими) и убедитесь, что конденсатор находится в ярком полевом положении.
- Вставьте зеленый интерференционный фильтр (свет становится зеленым) и установите слайдер анализа жидкокристаллических тона в рабочее положение.
- Установите затвор на 50% и отрегулируйте круговой поляризатор для уменьшения фонового шума.
- Установите компьютер готовым к plM-экспертизе.
- Запуск программного обеспечения для визуализации.
- Выберите Видео (ru) ВидеоИсточник polarAIDE в видео-меню в верхней панели меню.
- Переключитесь на живое видео, перейдя на страницу Видео и активируйте анализ шпинделя и зоны, нажав на значок (Дополнительнаярисунок 1) в панели инструментов видео.
- Выберите режим отображения для динамического масштабирования во время визуализации шпинделя: (1) красный (бирефринс)/зеленый (фон) комбинированный вид или (2) белый (birefringence)/и черный (фон) вид. Динамический режим скоринга используется для автоскоринга zona pellucida.
3. Рассмотрение зрелости яичка
- После периода преинкубации (3–4 ч) выполните PLM-обследование, показывающее состояние зрелости ооцита в стандартное время ИКСИ (39–40 ч после триггера ХГЧ).
- Перенесите все яйцеклетки в отдельные капли на блюдо PLM и поместите его под перевернутый микроскоп, подготовленный для визуализации шпинделя. Не забудьте снять пластиковую крышку со стеклянной нижней тарелки перед началом обследования.
- Принесите первый яйцеклетки в фокусе. Если трудно искать ячейку под зеленым светом, вытащите зеленый фильтр временно. Убедитесь, что зеленый фильтр вставляется перед анализом.
- Наблюдайте за обнаруженным изображением birefringence яйцеклеток (красный/оранжевый на зеленом фоне), так как он обрабатывается компьютером и отображается в режиме реального времени на экране компьютера. Помните, что сигнал не виден в окуляре.
- Если сообщение, объявляющее об облучении света, слишком низкое/высокое всплывающее, отрегулируйте яркость к подходящей интенсивности с помощью ручки интенсивности света микроскопа.
- Используйте удерживая и иглу ICSI для того чтобы повернуть oocyte поэтому PB находится в положении 12 часов и фокусе к PB.
- Если веретенообразный биренинснес не виден на первый взгляд в непосредственной близости от ПБ, аккуратно поверните ооцит вокруг каждой оси, слегка коснувшись zona pellucida, чтобы обеспечить выравнивание поляризованного света с массивом шпинделя волокон (Дополнительное видео ). Объявить об отсутствии шпинделя MII до тех пор, пока яйцеклетка не показывает сигнал шпинделя, несмотря на строгое вращение.
- Основываясь на наблюдаемой модели birefringence, классифицировать яйцеклетки в следующих категориях (Рисунок 2): (A) ооциты с ярким сигналом биполярного баррель формы MII шпиндель с четко очертил границ и даже распределение birefringence ; (B) ооциты с дисморфическим, аполярным и полупрозрачным шпиндельми MII с нерегулярными границами и неравномерным распределением сигнала; (C) яйцеклетки без каких-либо обнаруживаемых MII шпиндель бирефринессвев в ooplasm; (D) анафаза I/телофа I ооциты, показывая микротрубчатый мост (соединительная прядь между первым ПБ и яйцеклетки) вместо шпинделя MII.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ооцит с обнаруживаемым сигналом шпинделя MII (класс A или B) подходит для немедленного ИКСИ. - Сфотографать (F9) или записывать видео для отчета и/или последующего анализа изображений. Храните документацию шаблона изображения, чтобы уменьшить субъективность оператора.
- Перейдите в положение следующего оочного и повторите шаги 3.6'3.9.
4. Оптимизация времени ИСИ
- Перенесите все шпиндель-положительные яйцеклетки (класс А или В, шаг 3.8) в блюдо ИКСИ и подвергните их ICSI в соответствии со стандартными протоколами24,25.
- Если яйцеклетки не показывают обнаруживаемого сигнала шпинделя MII, поместите блюдо PLM в CO2- независимый инкубатор и переместите ИКСИ в более позднее время.
- Выполните переобследование PLM позже, после шагов 3.3-3.9. Если некоторые ооолеты (ы) по-прежнему не хватает шпинделя MII, дальнейшее задержки ICSI для дополнительных 1'2 h.
- Перенесите все яйцеклетки в блюдо ICSI и впрысните их в соответствии со стандартными протоколами24. Если блюдо PLM совместимо с углем изгиба иглы микроинъекции, выполните ИКСИ сразу же в тарелке PLM после перехода в яркий режим поля.
- После ИКСИ, передача яйцеклеток в подготовленные пластины для выращивания эмбрионов и культуры до стадии бластоциста.
Representative Results
Поляризованная световая микроскопия позволяет мгновенно проверить, завершено ли яичное созревание ядер и собрано МИИ до ИКСИ. Благодаря своему неинвазивный характер, он может быть использован для безопасной оценки готовности человека яйцеклетки для оплодотворения в клинических условиях11,12,13,14. Спинноледные яйцеклетки с большей вероятностью порождают жизнеспособныеэмбрионы, чем яйцеклетки без шпинделя 9,15,16,17,18,19, 20 , 21 год , 22 Г. , 23. Кроме того, ооциты с отличием биполярного шпинделя, как представляется, имеют более высокую компетентность в развитии, чем ооциты с дисморфическими шпинделями9,21,22. Взятые вместе, шпиндель изображения могут служить в качестве инструмента для выявления яйцеклеток с наибольшим потенциалом для успешного оплодотворения, пройти предимплантационное развитие и поддерживать полномасштабную беременность9,15, 16 Год , 17 Лет , 18 лет , 19 лет , 20 , 21 год , 22 Г. , 23.
Сообщаемые случаи веритевки варьируется (44–97%) отражающие разнообразие изученного населения9,15,16,17,18,19,20,21, 22 Г. , 23 , 26 , 27 , 28. In vivo созрели ооциты от нормальных респондентов, как правило, показывают биполярного МИИ шпиндель на 40 ч после HCG триггер9,18,27,29. Однако, в медленном реагировании, пул яйцеклеток, извлеченных из предовулирующих фолликулов зависит от задержки созревания9,27. Здесь, шпиндель изображения должны быть проведены для дискриминации яйцеклеток, арестованных на этапе MII от тех, кто проходит важный матурациональный переход(рисунок 3). Мы рекомендуем удаление фолликулярных клеток сразу после извлечения, а также инкубацию ооцитов MI и MII в отдельных скважинах, чтобы иметь возможность различать созрели ооциты In vivo и позднесозревающие ооциты, выдавливающие ПБ в пробирке, незадолго до ИКСИ. В случае, если денудация выполняется непосредственно перед ИКСИ, эти две популяции яйцеклеток неотличимы на основе внешнего вида ПБ.
Специфические фазовые изменения шаблона PLM следует интерпретировать в контексте знания динамики шпинделя во время мейотического созревания. Во время межкинеза аппарат деления претерпевает обширную структурнуюреорганизацию, а сигнал PLM временно исчезает 1,9,10,11. Таким образом, в развитии задержки ооцитов экструдирования ПБ in vitro, отсутствие сигнала шпинделя MII не обязательно отражает клеточное возмущение, но это может указывать на прогрессирование яйцеклетки от MI до стадии MII (Рисунок 3). Если сперма вводится в нефизиологическую точку времени, потенциал развития яйцеклетки скомпрометирован. Отсрочка ICSI обеспечивает поздних созревания яйцеклеток с большим временем, чтобы собрать СПИтель MII, чье присутствие связано с лучшими клиническими результатами9,10,11. В клиническом исследовании с участием медленных /плохих ответчиков, почти 60% первоначально шпиндель-отрицательных яйцеклеток разработали сигнал шпинделя до plM повторного обследования примерно 2 ч позже9. В зависимости от стадии развития и общей пригодности позднезрелых ооцитов, появление шпинделя MII после экструзии ПБ обычно занимает 2х6 ч (неопубликованное наблюдение). Ооциты, демонстрирующие мост микротрубочная (анафаза/телофаз, класс D) во время первого обследования PLM требуют более длительного времени для разработки сигнала шпинделя MII, чем ооциты без видимых шпинделей (новые шпиндель, класс C). Индивидуальная адаптация времени ИКСИ к стадии развития яйцеклетки предотвращает преждевременную активацию яйцеклеткии приводит к улучшению скорости оплодотворения и успешному развитию эмбриона 9.
Хотя поздние созревания яйцеклетки экструдируют PB in vitro, как правило, имеют более низкую компетенцию в развитии, чем In vivo созрели ооциты, скорость развития эмбриона является приемлемым, если им удается собрать обнаруживаемый шпиндель до задержки ICSI (взрывоизоляция 41,32%)9. Используя этот подход, даже незрелые яйцеклетки, которые обычно отвергаются для лечения бесплодия, могут быть клинически использованы, производят переносимые эмбрионы, и привести к полносрочным беременностям. Оценка матурационрной стадии каждого отдельного яйцеклетки особенно полезна в плохом прогнозе циклов, приносящих небольшое количество ооцитов MII и/или после выполнения спасательной операции в пробирке созревания незрелых яйцеклеток9.
Помимо оценки зрелости яйцеклеток, визуализация шпинделя также рекомендуется до биопсии ПБ, чтобы избежать разрушения шпинделя в анафазных яйцеклетках. В экспериментальной эмбриологии, визуализация мейотического шпинделя используется во время энуклеации яйцеклеток и / или процедуры переноса шпинделя13.
Рисунок 1: Созревание яйцеклеток человека. В vivo созрели яйцеклетки (MII) экспонат ПБ во время поиска. Незрелые яйцеклетки (GV, MI) могут спонтанно завершить созревание в пробирке. Шкала бар 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Классификация ооцитов на основе установленного PLM-обнаруженного шаблона. Репрезентативные примеры сортов яйцеклеток (A-D) на основе внешнего вида сигнала шпинделя. PLM-обнаруженный рисунок: (A) выдающийся сигнал биполярного шпинделя, (B) полупрозрачный аполярный спинондель MII, (C) нет обнаруживаемого шпинделя, и (( D) микротубульный мост. Шкала бар 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Этапы MI в MII перехода в созревании яйцеклеток. Показано появление яйцеклеток в ярком поле (верхний ряд) в сочетании с флуоресценционным сигналом хромосом (цианос) и микротрубочек (магента) (средний ряд) и в поляризованном свете (нижний ряд). Каждый яйцеклетка была сначала плом-обследована и немедленно исправлена. Фиксированные яоциты были (иммуно) помечены С Hoechst (ДНК) и анти-тубулина антитела (микротрубочки). желтая стрелка указывает на наличие ПБ, а белая стрелка подчеркивает положение микротрубчатых микротрубок. Шкала бар 20 мкм. Эта цифра была изменена с Holubcov и др., JARG 20199. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Корреляция организации хромосо-микротрубочек с узором бирефригенции, обнаруженной поляризованной световой микроскопией. Показано появление яйцеклеток в ярком поле в сочетании с флуоресцентным сигналом для хромосом (циана) и микротрубочек (магента) (верхний ряд), а также в поляризованном свете (нижний ряд). Каждый яйцеклетка была исправлена сразу после PLM-экспертизы. ДНК (Hoechst) и микротрубублии (я-тубулин) были окрашены. (A-C) ооциты с PLM-обнаруживаемый шпиндель еще несогласованные хромосомы (A, B) или слабо сфокусированный шпиндель полюсов (C); (D-F) ненормальные яйцеклетки без PLM-обнаруживаемый шпиндель MII показанный underdeveloped (D),apolar (E) или никакое шпиндель (F). Белая стрелка подчеркивает положение двухрефринтных микротрубок, а звездочка (яп. ) указывает на положение деконденсированного хроматина. Шкала бар 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Структуры Бирефинеса в ооцитах человека. Репрезентативные примеры(A-D) биредезантных структур, обнаруженных PLM в ооцитах человека. ЗП и зона пеллусида; ПМ - плазменная мембрана (олема); РБ - рефрактивые тела, вакуолы. Белая стрела, мейотический шпиндель на разных стадиях созревания. (E) MII шпиндель несоответствие с полярным телом (PB). (F) Отслоение спины от плазменной мембраны. Шкала бар 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная диаграмма 1: Настольная компоновка программного обеспечения для анализа изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительное видео: Процедура осмотра PLM. Вращение яйцеклетки требуется, чтобы исключить наличие шпинделя (стрелка). Шкала бар 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Ацентррозомальный мезотический шпиндель в ооцитах человека очень динамичный и деликатная структура1. В неоптимальных условиях, микротрубчатые волокна быстро деполимеризируют и мейотический шпиндель разбирает30,31,32,33. Поэтому крайне важно обеспечить, чтобы культура яйцеклеток и условия микроманипуляции, а именно температура и рН, были в оптимальном диапазоне. Чтобы свести к минимуму риск нарушения шпинделя, яйцеклетки должны храниться в контролируемой температурой среде, сохраняя 37 и 0,5 градусов по Цельсию в ооцитных носителях. Строго требуется использование микроскопов и микроинъекций, оснащенных подогревом. Все манипуляции с яйцеклетками за пределами инкубатора должны осуществляться в буферных носителях HEPES/MOPS, чтобы избежать рН-флюктов. Во избежание возможных побочных эффектов чрезмерной передачи яйцеклеток в окружающем состоянии, общее время обследования PLM не должно превышать 10 минут. Ооциты должны быть проанализированы на стеклянной нижней блюдо с пластиковой крышкой удалены, поскольку позиционирование стандартного пластика в луче путь ухудшает анализ изображения. Поскольку пластиковые и стеклянные донные посуды имеют различные тепловые характеристики, температуру следует проверять непосредственно в каплях обработки среды в экзаменационной тарелке.
Помимо лабораторных условий, на точность экзамена PLM могут повлиять процедурные различия и навыки оператора в области микроманипуляции. Только высокособранные биполярные шпиндели могут быть неинвазивно визуализированы. Наблюдаемый сигнал пропорциональн степени структурной организации шпинделя. Зарождающийся, аполярный, ослабленный или смягченный шпиндель дисплей только размытые birefringence или нет вообще(Рисунок 3 и Рисунок 4). Кроме того, несовершенное выравнивание поляризованного света с микротубульными массивами производит только полупрозрачный и плохо определенный бирефригенс, несмотря на фактическое наличие хорошо развитого биполярного шпинделя(рисунок 4). Если должным образом ориентированы, шпиндель сигнал может быть легко пропущен ы и яйцеклетки зрелости неправильно диагностируется (Дополнительное видео). Для оптимального изображения шпинделя, яйцеклетка должна быть правильно повернута вокруг каждой оси. Так как бирефинсинес не виден в окубах, оператор должен следить за экраном компьютера при выполнении вращения яйцеклетки. Предыдущий опыт работы с микроманипуляцией и обучениешетизображения шпинделя в избытке в пробирке созрели яйцеклетки желательно, прежде чем перейти к клиническому применению.
Помимо шпинделя, кучевые клетки, окружающие яйцеклетки, олиму, внутренний слой zona pellucida и некоторые цитоплазмические структуры (например, рефрактные тела, вакуолы) демонстрируют бирефринси(рисунок 5A-D). Если не тщательно удалены из яйцеклетки до визуализации, плотно прикрепленные фолликулярные клетки производят фоновый шум и компрометируют обнаружение мейотического шпинделя. Будьте осторожны, чтобы не ошибиться большой рефрактивы тела шпиндель. Многие цитоплазмические включения, проживающие в цитоплазме, демонстрируют высокую яркость, которая резко контрастирует с темным фоном. Мейотический шпиндель, с другой стороны, демонстрируют только умеренный сигнал, размытые границы и, как правило, прикрепляется к oolema под или рядом с первым ПБ. Иногда, PLM экспертиза показывает валовой отказ от шпинделя от своего стандартного положения(Рисунок 5E, F). Если есть основные несоответствия между аппаратом разделения и ПБ, PLM помогает сориентировать яйцеклетки, чтобы избежать риска травмы шпинделя во время микроинъекции. Относительное положение шпинделя в яйце, как представляется, не влияет на потенциал развития в результате эмбрионов17,34. Однако, когда шпиндель конкурировали отделяется от oolema, аномалии оплодотворения происходят. Интересно, что некоторые некачественные ооциты проходят оденденацию хроматина сразу после экструзии ПБ вместо начала микротубуляного ядра(рисунок 4F). Используя традиционную световую микроскопию и ПБ в качестве единственного маркера зрелости яйцеклеток, такие субкомпетентные яйцеклетки будут рассматриваться как удобрения. Таким образом, в добавке обычной морфологической оценки, визуализация шпинделя добавляет важную информацию о зрелости яйца и может служить косвенным маркером его качества.
На заболеваемость шпинированными ооцитами МИИ, вероятно, влияют характеристики исследуемой популяции (например, генетическое происхождение, состояние здоровья, материнский возраст). Кроме того, доля отсроченных в развитии ооцитов в когорте будет влиятьна фактическое количество обнаруженных шпиндель-отрицательных ооцитов 9,27. Мейотическая визуализация шпинделей позволяет четко определить оцветные яйцеклетки, арестованные на этапе MII. Кроме того, второй осмотр на более позднее время может выявить ли шпиндель-отрицательный яйцеклетки является ненормальным или только недавно прогрессировал через MI / MII переход9,10,11. Когда разрешено развивать шпиндель до ИКСИ, даже незрелые яйцеклетки, которые обычно отбрасываются, может производить жизнеспособные эмбрионы9. В циклах с очень немногими ооцитами, доступными для оплодотворения, мелко приуроченный IcSI ооцитов экструдирующих ПБ может служить стратегией спасения и альтернативой отмене цикла.
Тем не менее, продление времени преинкубации не следует обобщать для всех яйцеклеток. In vivo созрели яйцеклетки от нормальных ответчиков, как правило, демонстрируют MII шпиндель9,20,21,27. Здесь вероятность успешного изображения шпинделя уменьшается со временем в следствиепостного витростарения35. Если это возможно, ИКСИ должна быть выполнена в день поиска и не должна превышать 9 часов (45 часов после ХГЧ), период, связанный со снижением в результате качества эмбриона36,37. Ооциты, демонстрирующие различные биполярные шпиндели, должны быть подвергнуты ИКСИ без дальнейших промедлений. Таким образом, индивидуализированная оптимизация времени ИКСИ стоит у пациентов с плохим прогнозом, чтобы исключить любой риск преждевременной инъекции спермы. Тем не менее, это не нужно, слишком много времени и трудоемким, чтобы быть выполнены во всех циклах ЭКО.
Анализ PLM показывает, достиг ли яйцеклетки стадии MII. Однако неинвазивная визуализация мейотического шпинделя не дает никакой информации об организации хромосомы. Там может быть тяжелой хромосомы выравнивания и / или материнского возраста, связанных хроматид расщепления в яйцеклетки с изображением биполярного шпинделя(Рисунок 5). Различные другие факторы оказывают значительное влияние на успех воспроизводства (например, фактор спермы, митохондрии, активация эмбрионального генома, нерегулярное расщепление, эпигенетика, эндометрий, материнский иммунитет). Таким образом, обнаружение спинела МИИ как такового не гарантирует положительного клинического исхода процедуры ЭКО.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить эмбриологию лаборатории Reprofit International. Мы также признаем основной объект CELLIM CEITEC, поддерживаемый MEYS CR (LM2015062 Czech-Bioimaging) за их поддержку в получении представленных здесь данных иммунофлуоресценции.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 90164 | bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture |
| Denuding micropipette 150 µm | Microtech IVF | 005-150C | |
| Denuding micropipette 180 µm | Microtech IVF | 005-180B | suitable for oocyte transfer between dishes |
| Denuding micropipette 200 µm | Microtech IVF | 005-250-A | suitable for oocyte transfer between dishes |
| FluoroDish | World Precision Instruments | FD 5040-100 | glass-bottom dish |
| (alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells) | |||
| Holding micropipette | Microtech | 001-120-30 | sterile glass microneedles |
| Hyaluronidase solution | Irvine Scientific | 90101 | for oocyte denudation |
| ICSI micropipette | Microtech | 002-5-30 | sterile glass microneedles |
| Micro Droplet Culture Dish | Vitrolife | 16003 | 12-well plate for embryo culture |
| Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin | Irvine Scientific | 90163 | handling medium, MOPS/HEPES buffered |
| Nikon Eclipse TE 2000-U | Nikon | inverted microscope with heated stage | |
| Nunc IVF Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 150270 | plastic ICSI dish |
| Nunc non-treated 4-well IVF dish | Thermo Fisher Scientific | 179830 | 4-well plate for embryo culture |
| OCTAX polarAide | MTG | integrated PLM system | |
| Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | oil for overlay |
| Polyvinylpyrrolidone | Irvine Scientific | 90123 | for sperm immobilization prior to ICSI |
References
- Holubcova, Z., Blayney, M., Elder, K., Schuh, M. Human oocytes. Error-prone chromosome-mediated spindle assembly favors chromosome segregation defects in human oocytes. Science. 348 (6239), 1143-1147 (2015).
- Oudendijk, J. F., Yarde, F., Eijkemans, M. J., Broekmans, F. J., Broer, S. L. The poor responder in IVF: is the prognosis always poor?: a systematic review. Human Reproduction Update. 18 (1), 1-11 (2012).
- Gautam, N., Allahbadia, Y. M. Ovarian Stimulation Protocols. , Springer. India, Mumbai, India. (2016).
- Piqueras, P., et al. Live birth after replacement of an embryo obtained from a spontaneously in vitro matured metaphase-I oocyte. Systems Biology in Reproductive Medicine. 63 (3), 209-211 (2017).
- Liu, J., Lu, G., Qian, Y., Mao, Y., Ding, W. Pregnancies and births achieved from in vitro matured oocytes retrieved from poor responders undergoing stimulation in in vitro fertilization cycles. Fertility and Sterility. 80 (2), 447-449 (2003).
- Shu, Y., et al. Fertilization, embryo development, and clinical outcome of immature oocytes from stimulated intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertility and Sterility. 87 (5), 1022-1027 (2007).
- Sachdev, N. M., Grifo, J. A., Licciardi, F. Delayed intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with trophectoderm biopsy and preimplantation genetic screening (PGS) show increased aneuploidy rates but can lead to live births with single thawed euploid embryo transfer (STEET). Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (11), 1501-1505 (2016).
- De Vos, A., Van de Velde, H., Joris, H., Van Steirteghem, A. In-vitro matured metaphase-I oocytes have a lower fertilization rate but similar embryo quality as mature metaphase-II oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 14 (7), 1859-1863 (1999).
- Holubcova, Z., et al. Egg maturity assessment prior to ICSI prevents premature fertilization of late-maturing oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 36 (3), 445-452 (2019).
- Montag, M., Schimming, T., van der Ven, H. Spindle imaging in human oocytes: the impact of the meiotic cell cycle. Reproductive BioMedicine Online. 12 (4), 442-446 (2006).
- Montag, M., van der Ven, H. Symposium: innovative techniques in human embryo viability assessment. Oocyte assessment and embryo viability prediction: birefringence imaging. Reproductive BioMedicine Online. 17 (4), 454-460 (2008).
- Keefe, D., Liu, L., Wang, W., Silva, C. Imaging meiotic spindles by polarization light microscopy: principles and applications to IVF. Reproductive BioMedicine Online. 7 (1), 24-29 (2003).
- Caamano, J. N., Munoz, M., Diez, C., Gomez, E. Polarized light microscopy in mammalian oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 45, 49-56 (2010).
- Eichenlaub-Ritter, U., Shen, Y., Tinneberg, H. R. Manipulation of the oocyte: possible damage to the spindle apparatus. Reproductive BioMedicine Online. 5 (2), 117-124 (2002).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. The spindle observation and its relationship with fertilization after intracytoplasmic sperm injection in living human oocytes. Fertility and Sterility. 75 (2), 348-353 (2001).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Keefe, D. L. Developmental ability of human oocytes with or without birefringent spindles imaged by Polscope before insemination. Human Reproduction. 16 (7), 1464-1468 (2001).
- Moon, J. H., et al. Visualization of the metaphase II meiotic spindle in living human oocytes using the Polscope enables the prediction of embryonic developmental competence after ICSI. Human Reproduction. 18 (4), 817-820 (2003).
- Cohen, Y., et al. Spindle imaging: a new marker for optimal timing of ICSI? Human Reproduction. 19 (3), 649-654 (2004).
- Rama Raju, G. A., Prakash, G. J., Krishna, K. M., Madan, K. Meiotic spindle and zona pellucida characteristics as predictors of embryonic development: a preliminary study using PolScope imaging. Reproductive BioMedicine Online. 14 (2), 166-174 (2007).
- Heindryckx, B., De Gheselle, S., Lierman, S., Gerris, J., De Sutter, P. Efficiency of polarized microscopy as a predictive tool for human oocyte quality. Human Reproduction. 26 (3), 535-544 (2011).
- Kilani, S., Cooke, S., Tilia, L., Chapman, M. Does meiotic spindle normality predict improved blastocyst development, implantation and live birth rates? Fertility and Sterility. 96 (2), 389-393 (2011).
- Kilani, S., Chapman, M. G. Meiotic spindle normality predicts live birth in patients with recurrent in vitro fertilization failure. Fertility and Sterility. 101 (2), 403-406 (2014).
- Tilia, L., Venetis, C., Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Is oocyte meiotic spindle morphology associated with embryo ploidy? A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 105 (4), 1085-1092 (2016).
- ESHRE Guideline Group on Good Practice in IVF Labs, De los Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Human Reproduction. 31 (4), 685-686 (2016).
- Principles of IVF Laboratory Practice: Optimizing Performance and Outcomes. Montag, M., Morbeck, D. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2017).
- Chamayou, S., et al. Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos. Reproductive BioMedicine Online. 13 (5), 661-667 (2006).
- Rienzi, L., et al. Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar body position and oocyte developmental potential after ICSI. Human Reproduction. 18 (6), 1289-1293 (2003).
- Woodward, B. J., Montgomery, S. J., Hartshorne, G. M., Campbell, K. H., Kennedy, R. Spindle position assessment prior to ICSI does not benefit fertilization or early embryo quality. Reproductive BioMedicine Online. 16 (2), 232-238 (2008).
- Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Time course of meiotic spindle development in MII oocytes. Zygote. 19 (1), 55-62 (2011).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Human Reproduction. 16 (11), 2374-2378 (2001).
- Sun, X. F., Wang, W. H., Keefe, D. L. Overheating is detrimental to meiotic spindles within in vitro matured human oocytes. Zygote. 12 (1), 65-70 (2004).
- Mullen, S. F., et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of human oocytes, and the relevance to cryopreservation. Human Reproduction. 19 (5), 1148-1154 (2004).
- Swearman, H., et al. pH: the silent variable significantly impacting meiotic spindle assembly in mouse oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 37 (3), 279-290 (2018).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human Reproduction Update. 17 (1), 34-45 (2011).
- Miao, Y. L., Kikuchi, K., Sun, Q. Y., Schatten, H. Oocyte aging: cellular and molecular changes, developmental potential and reversal possibility. Human Reproduction Update. 15 (5), 573-585 (2009).
- Pujol, A., Garcia, D., Obradors, A., Rodriguez, A., Vassena, R. Is there a relation between the time to ICSI and the reproductive outcomes? Human Reproduction. 33 (5), 797-806 (2018).
- Yanagida, K., et al. Influence of oocyte preincubation time on fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (8), 2223-2226 (1998).
