Vi ger en översikt av det kliniska protokollet för icke-invasiv bedömning av mänskliga ägg mognad med hjälp av polariserad ljusmikroskopi.
Den optimala tidpunkten för intracytoplasmisk spermie injektion (ICSI) är av en allvarlig oro för fertilitets program eftersom förtida spermier inträde minskar ägget kompetensutveckling. Närvaron av den första Polar kroppen (PB) tillsammans med meiotiska metafaserna spindel indikerar slutförandet av äggcell mognad och ägget beredskap för befruktning. I klinisk praxis är det brukligt att anta att alla oocyter som uppvisar en PB är mogna metafase (MII) oocyter. Men PB extrudering föregår bildandet av bipolär MII spindel. Detta communityn hos gör blotta närvaron av PB en opålitlig markör för äggcell mognad. Noninvasiv spindel avbildning med hjälp av polariserad ljusmikroskopi (PLM) möjliggör snabb och enkel inspektion av huruvida PB-visar äggcell faktiskt återmonteras en meiotiska metafaserna spindel före ICSI. Här presenterar vi ett standardprotokoll för att utföra Human Egg mognadbedömning i det kliniska laboratoriet. Vi visar också hur man optimerar tiden för ICSI med avseende på äggcell utvecklingsstadiet för att förhindra för tidig spermie injektion av sena förfallande oocyter. Med hjälp av denna metod, även omogen oocyter extrudera PB in vitro kan kliniskt utnyttjas. Affirmation att MII spindel är närvarande före sperma injektion och individuell justering av tiden för ICSI är särskilt viktigt i dålig prognos in-vitro fertilisering (IVF) cykler med ett lågt antal oocyter tillgängliga för befruktning.
För att bli ett fruktbart haploida ägg, diploida äggcell har att pressa hälften av sin genetiska information i en angränsande cell, kallas den första Polar kroppen (PB), och justera kromosomer i ekvatorn av bipolär metafase II (MII) spindel. Medan PB tydligt kan observeras med konventionell ljusmikroskopi, kräver detektion av genetiskt material och cytoskeletala strukturer vanligtvis invasiva förberedande procedurer som är oförenliga med äggocyten ytterligare användning för fertilitetsbehandling. I klinisk praxis betraktas därför förekomsten av PB som ett kännetecken för äggcell mognad. Emellertid, levande bild av mikrotubule och kromosom dynamik under Human äggcell mognad visade att PB blir synlig ett par timmar innan bipolär Mii spindel monteras och kromosomer är inriktade1. Ändå, i det överförda ljuset, den MII arresterade ägg är omöjlig att skilja från oocyter som just gått in i processen för kromosom segregering. Sålunda, en kohort av oocyter, klassificeras som MII oocyter baserat endast på PB närvaro, kan innehålla latematuring oocyter som ännu inte har avslutat sin utveckling och därmed inte är redo för befruktning.
Fördröjningen av äggcell mognad kommer sannolikt att påverka populationen av fattiga responders med ett lågt antal Mii oocyter och en hög andel omogna oocyter samlas oväntat i stimulerade cykler2. In vivo, bara en enda, bästa kvalitet ägg uppnår mognad och blir ovulated. I in vitro-fertilisering (IVF) cykler, kontrollerad ovariell hyperstimulering används för att rekrytera flera oocyter för mognad. Gonadotropin Surge utlöser ett återupptagande av meiotiska program och ägg stamceller är tänkta att nå MII gripande skede inom 36 timmar3. Emellertid, oocyter som hämtats från preovulatoriska folliklar utgör ofta ett sortiment av pbvisa Mii oocyter och omogna oocyter, antingen I metafas I (mi) eller avelsmaterial vesikel skede (GV) (figur 1). Endast MII oocyter utsätts för intracytoplasmisk spermie injektion (ICSI) medan omogna oocyter vanligtvis kasseras. Men, när odlas in vitro, MI oocyter är vanligen observeras att extrudera PB in vitro-. Trots deras allmänna underlägsenhet, sena mognar oocyter som spontant avslutat den första meiotiska metafaserna division under natten kultur har framgångsrikt använts som sista resurs oocyter, och levande födda har rapporterats4,5 ,6,7,8. Därför, den förtida injektion av spermier kan vara en primär orsak underliggande dåliga utvecklingsresultat av sena förfallande oocyter rapporterade i tidigare studier9,10,11.
Polariserad ljusmikroskopi (PLM) kombinerat med ett bildbehandlings program möjliggör icke-invasiv visualisering av den meiotiska spindeln i den levande äggocyten. Den dubbla reflektion genereras av samspelet mellan polariserad ljusstråle med mycket beställda montering av mikrotubuli bygga bipolär spindel. Eftersom det polariserade ljuset är av normal intensitet, kan tekniken säkert användas i kliniska inställningar för att Visa dynamiken i divisionens apparat11,12,13,14. Närvaron av MII spindel Dubbelbrytning inom äggcell har identifierats som en markör för ett ägg utveckling kompetens9,15,16,17,18, 19,20,21,22,23. Sålunda, det har föreslagits att noninvasiv meiotiska metafaserna spindel avbildning kan användas för ägg kvalitetskontroll i klinisk praxis11,14,20.
Eftersom tidslinjen för mikrotubulär dynamik under äggcell meios har lösts1, kan den observerade PLM-mönstret vara bättre relaterade till tiden loppet av mi till Mii Transition. Strax efter PB emission, den begynnande MII spindeln blir omöjlig att upptäcka genom PLM. Men om oocyterna hålls i kulturen, kan den Dubbelbrytning signalen dyka upp senare när bipolär Mii spindel återmonteras9,10,11. I oocyter som extruderar en PB in vitro kan därför frånvaron av spindeln endast tillfälligt motsvara den fysiologiska övergången av den sena mognads-oocyten från MI till MII-stadiet. Om MII spindel signalen är omöjlig att upptäcka, sperma injektion kan skjutas upp till en senare tidpunkt som ger extra tid för MII spindel bildning. PLM-stödd optimering av ICSI tid maximerar risken för sena förfallande oocyter att vara kliniskt utnyttjad och göra skillnad för fattiga prognos patienter9.
Nedan ger vi ett steg-för-steg-protokoll om hur man utför noninvasiv spindel avbildning i humana oocyter. Vi visar också hur PLM kan användas för att undvika risken för för tidig befruktning av sena förfallande oocyter.
Den acentrosomal meiotiska metafaserna spindel i mänskliga oocyter är mycket dynamisk och en delikat struktur1. Under suboptimala förhållanden, den mikrotubuli fibrer snabbt depolymerize och meiotiska metafaserna spindel Disassemblerar30,31,32,33. Därför är det ytterst viktigt att se till att äggcell kulturen och mikromanipuleringförhållandena, nämligen temperatur och pH, är i optimalt omfång. För att minimera risken för spindel störningar bör oocyterna förvaras i en temperaturkontrollerad miljö som upprätthåller 37 ± 0,5 ° c i äggcell mediet. Användning av Mikroskop och görs setup utrustad med en uppvärmd scen är strikt krävs. All manipulation med oocyter utanför inkubatorn måste utföras i HEPES/MOPS buffrade medier för att undvika pH-fluktueringar. För att undvika potentiellt skadliga effekter av överdriven oocyt överlämnande i omgivnings tillstånd, bör den totala tiden för PLM-undersökning inte överstiga 10 minuter. Oocyterna måste analyseras på glaset botten skålen med plastlocket bort eftersom positionering av en standard plast i strålen vägen försämrar bildanalys. Eftersom plast och glasbotten rätter har olika termiska egenskaper, bör temperaturen kontrolleras direkt i droppar av hantering medium i undersökningen skålen.
Förutom laboratorieförhållanden kan förfarandemässiga skillnader och operatörens mikromanipulering ha en inverkan på PLM: s noggrannhet. Endast Högmonterade bipolär spindlar kan vara noninvasivt visualiseras. Observerade signalen är proportionell mot graden av strukturell organisering av spindeln. Begynnande, apolaris, lossade eller disarrayed spindlar visar endast suddig Dubbelbrytning eller ingen alls (figur 3 och figur 4). Dessutom, ofullständig anpassning av polariserat ljus med mikrotubuli arrayer producerar bara en genomskinlig och dåligt definierade Dubbelbrytning trots den faktiska närvaron av välutvecklad bipolär spindel (figur 4). Om inte korrekt orienterad, kan spindel signalen lätt missas och äggcell mognad fel diagnos (kompletterande video). För optimal spindel avbildning måste äggocyten vändas på rätt sätt runt varje axel. Eftersom Dubbelbrytning inte syns i okularen, operatören har att titta på datorskärmen när du utför rotation av äggcell. Tidigare erfarenhet av mikromanipulering och utbildning av spindel avbildning i överskott in vitro-mognade oocyter är önskvärt innan man övergår till klinisk applicering.
Förutom spindeln, de Cumulus-celler som omger äggcell, oolema, det inre skiktet av zona pellucida och vissa cytoplasmiska strukturer (t. ex. refraktila organ, vakuoler) uppvisar Dubbelbrytning (figur 5a-D). Om inte grundligt avlägsnas från äggcell före avbildning, tätt bifogade follikulära celler producerar bakgrundsljud och kompromiss meiotiska metafaserna spindel detektering. Var noga med att inte förväxla en stor refractile kropp för spindeln. Många cytoplasmiska inneslutningar bosatta i cytoplasman visar hög ljusstyrka som skarpt kontrasterar mot den mörka bakgrunden. Meiotic spindel, å andra sidan, uppvisar endast måttlig signal, suddiga gränser och vanligtvis fäster till oolema under eller intill den första PB. Ibland avslöjar PLM-undersökning en grov spindel avvikelse från sin standardposition (figur 5E, F). Om det finns en stor förskjutning mellan divisionens apparat och PB, hjälper PLM till att orientera äggocyten för att undvika risken för spindel skada vid mikroinjektion. Spindelns relativa position i oocyten förefaller inte påverka utvecklingspotentialen hos de resulterande embryona17,34. Men när spindeln competely lossnar från oolema, fertilisering avvikelser förekommer. Intressant, vissa dålig kvalitet oocyter genomgå kromatin dekondensation omedelbart efter PB extrudering istället för att starta mikrotubuli nukleation (figur 4F). Med konventionell ljusmikroskopi och PB som enda markör för oocytmognad, skulle sådana underkompetenta oocyter betraktas som fruktbara. Således, ovanpå den rutinmässiga morfologiska bedömningen, spindel avbildning tillför viktig information om äggets mognad och kan fungera som en indirekt markör för dess kvalitet.
Incidensen av spindledda MII oocyter kommer sannolikt att påverkas av egenskaperna hos studiepopulationen (t. ex. genetisk bakgrund, medicinskt tillstånd, moderns ålder). Dessutom kommer andelen av utvecklingsstörda fördröjda oocyter inom kohorten att påverka det faktiska antalet upptäckta spindel negativa oocyter9,27. Meiotic spindel visualisering gör det möjligt att tydligt identifiera fertiliserbara oocyter greps i MII skede. Dessutom kan den andra inspektionen vid ett senare tillfälle avslöja om den spindel-negativa äggocyten är onormal eller har bara nyligen framskridit genom mi/Mii Transition9,10,11. När det tillåts att utveckla en spindel före ICSI, även omogna oocyter, som rutinmässigt kasseras, kan producera livskraftiga embryon9. I cykler med mycket få oocyter tillgängliga för befruktning, fint tidsinställda ICSI av oocyter extruderande PB kan fungera som en räddnings strategi och alternativ till cykel avbokning.
Icke desto mindre bör förlänga preinkubations tiden inte generaliseras till alla oocyter. In vivo mognade oocyter från normal responders uppvisar typiskt en MII-spindel9,20,21,27. Här minskar risken för framgångsrik spindel avbildning med tiden som en följd av post-ovulatoriska in vitro-åldrande35. Om möjligt bör ICSI utföras på dagen för hämtning och bör inte överstiga 9 timmar (45 timmar efter hCG), perioden i samband med en minskning av resulterande embryo kvalitet36,37. Oocyter som uppvisar distinkta bipolära spindlar bör genomgå ICSI utan ytterligare dröjsmål. Sammanfattnings, individualiserad optimering av ICSI timing är värdefullt i fattiga prognos patienter att utesluta någon risk för förtida sperma injektion. Det är dock onödigt, alltför tidskrävande och mödosam att utföras i alla IVF cykler.
PLM-analys avslöjar om äggocyten nådde MII-stadiet. Men noninvasiv visualisering av den meiotiska spindeln ger ingen information om kromosom organisation. Det kan finnas allvarlig kromosom förskjutning och/eller moderns åldersrelaterade kromatiddelning i oocyter med en bipolär spindel (figur 5). Flera andra faktorer har stor inverkan på fortplantnings framgången (t. ex. spermie faktorn, mitokonskerna, embryonal genom aktivering, oregelbunden klyvning, epigenetik, endometrium, moderns immunitet). Därför, detektering av MII-spindeln i sig, garanterar inte ett positivt kliniskt resultat av IVF-förfarandet.
The authors have nothing to disclose.
Vi skulle vilja tacka embryologi laboratorium Reprofit International. Vi erkänner också kärnan anläggning CELLIM av CEITEC stöds av MEYS CR (LM2015062 Czech-bioimaging) för deras stöd med att få immunofluorescenografi data som presenteras här.
Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 90164 | bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture |
Denuding micropipette 150 µm | Microtech IVF | 005-150C | |
Denuding micropipette 180 µm | Microtech IVF | 005-180B | suitable for oocyte transfer between dishes |
Denuding micropipette 200 µm | Microtech IVF | 005-250-A | suitable for oocyte transfer between dishes |
FluoroDish | World Precision Instruments | FD 5040-100 | glass-bottom dish |
(alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells) | |||
Holding micropipette | Microtech | 001-120-30 | sterile glass microneedles |
Hyaluronidase solution | Irvine Scientific | 90101 | for oocyte denudation |
ICSI micropipette | Microtech | 002-5-30 | sterile glass microneedles |
Micro Droplet Culture Dish | Vitrolife | 16003 | 12-well plate for embryo culture |
Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin | Irvine Scientific | 90163 | handling medium, MOPS/HEPES buffered |
Nikon Eclipse TE 2000-U | Nikon | inverted microscope with heated stage | |
Nunc IVF Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 150270 | plastic ICSI dish |
Nunc non-treated 4-well IVF dish | Thermo Fisher Scientific | 179830 | 4-well plate for embryo culture |
OCTAX polarAide | MTG | integrated PLM system | |
Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | oil for overlay |
Polyvinylpyrrolidone | Irvine Scientific | 90123 | for sperm immobilization prior to ICSI |