Summary
Polarize ışık mikroskobu kullanarak insan yumurtası olgunluğunun non-invaziv değerlendirilmesi için klinik protokolün ana hatlarını salıyoruz.
Abstract
Zamansız sperm girişi yumurtanın gelişimsel yetkinliğini azalttığı için intrasitoplazmik sperm enjeksiyonunun (ICSI) optimal zamanlaması doğurganlık programları için ciddi bir endişe kaynağıdır. İlk kutup cismi (PB) meiyotik iğ ile birlikte yumurta olgunlaşmasının tamamlanıp yumurtanın döllenmeye hazır olduğunu gösterir. Klinik uygulamada, PB gösteren tüm yumurtaların olgun metafaz (MII) yumurtaolduğunu varsaymak adettir. Ancak, PB ekstrüzyon bipolar MII mili oluşumuöncesinde. Bu eşzamanlılık, PB'nin varlığını yumurta olgunluğunun güvenilmez bir belirteci haline getirir. Polarize ışık mikroskobu (PLM) kullanılarak noninvaziv mil görüntüleme pb görüntüleme oosit aslında ICSI önce bir meiyotik mil yeniden monte olup olmadığını hızlı ve kolay bir inceleme sağlar. Burada, klinik laboratuvarda insan yumurtası olgunluk değerlendirmesi gerçekleştirmek için standart bir protokol sıyoruz. Ayrıca geç olgunlaşan yumurtaların erken sperm enjeksiyonu önlemek için yumurtanın gelişim evresi ile ilgili olarak ICSI'nin süresini nasıl optimize edebileceğimizi de gösteriyoruz. Bu yaklaşım kullanılarak, pb in vitro ekstrüzyon bile olgunlaşmamış oositler klinik olarak kullanılabilir. MII milinin sperm enjeksiyonu öncesinde mevcut olduğunun doğrulanması ve ICSI zamanının bireysel ayarı, döllenme için düşük sayıda oosit bulunan kötü prognoz in-vitro fertilizasyon (IVF) döngülerinde özellikle önemlidir.
Introduction
Döllenebilir bir haploid yumurta olmak için, diploid oosit bitişik bir hücreiçine genetik bilginin yarısını ekstrüzyon vardır, ilk kutup cisim denir (PB), ve bipolar metafaz II ekvatorkromozomları hizalamak II (MII) mili. PB konvansiyonel ışık mikroskobu ile açıkça gözlemlenebilir iken, genetik malzeme ve sitoskeletal yapıların tespiti genellikle doğurganlık tedavisi için yumurta daha fazla kullanımı ile uyumsuz invaziv hazırlık prosedürleri gerektirir. Bu nedenle, klinik uygulamada, PB varlığı oosit olgunluğunun bir özelliği olarak kabul edilir. Ancak, insan yumurtası olgunlaşması sırasında mikrotübül ve kromozom dinamiğinin canlı görüntülemesi, bipolar MII mili biraraya gelmeden ve kromozomlar1hizaya girmeden birkaç saat önce PB'nin görünür hale geldiğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, iletilen ışıkta, MII tutuklanan yumurtalar kromozom ayrıştırma işlemine yeni giren yumurtalardan ayırt edilemez. Bu nedenle, sadece PB varlığına göre MII oosit olarak sınıflandırılan bir yumurta kohort, henüz gelişimini tamamlamamış ve bu nedenle döllenmeye hazır olmayan geç maturing oositler içerebilir.
Yumurta olgunlaşmasının gecikmemi mii oositsayısı düşük ve uyarılmış döngülerde beklenmedik toplanan olgunlaşmamış oositlerin yüksek oranda ile yoksul yanıtlayıcıların nüfusunu etkilemesi muhtemeldir2. In vivo, sadece tek, en kaliteli yumurta olgunluk elde ve ovülasyon olur. In-vitro fertilizasyon (IVF) döngülerinde, kontrollü yumurtalık hiperstimülasyon olgunlaşma için birden fazla oosit işe kullanılır. Gonadotropin dalgalanma meiotik programın bir devamı tetikler ve yumurta ataları içinde MII tutuklama aşamasına ulaşmak gerekiyordu3 3. Ancak preovulatory foliküllerden alınan oositler genellikle metafaz I (MI) veya germinal vezikül evresinde (GV) PBdisplaying MII oositleri ve olgunlaşmamış oositlerin bir çeşidini oluştururlar (Şekil1). Sadece MII oositler intrasitoplazmik sperm enjeksiyonuna (ICSI) maruz kalırken, olgunlaşmamış oositler genellikle atılır. Ancak, in vitro ekili zaman, MI oositler yaygın in vitro PB ekstrüzyon gözlenir. Genel aşağılıklarına rağmen, gece kültürü sırasında ilk meyotik bölümü kendiliğinden tamamlayan geç olgunlaşan oositler son kaynak oositleri olarak başarıyla kullanılmıştır ve canlı doğumlar bildirilmiştir4,5 ,6,7,8. Bu nedenle, sperm zamansız enjeksiyon önceki çalışmalarda bildirilen geç olgunlaşan oositlerin kötü gelişimsel sonuçları altında yatan birincil nedeni olabilir9,10,11.
Polarize ışık mikroskobu (PLM) bir görüntü işleme yazılımı ile birlikte canlı yumurta meiyotik mil non-invaziv görselleştirme sağlar. Çift yansıma bipolar mil bina mikrotübüllerin yüksek sıralı montaj ile polarize ışık ışını etkileşimi tarafından oluşturulur. Polarize ışık normal yoğunlukta olduğundan, teknik klinik ortamlarda bölüm aparatı11,12,13,14dinamiklerini görüntülemek için güvenle kullanılabilir. MiI mili kuşun yumurta içinde varlığı bir yumurtanın gelişimsel yeterliliğinin bir göstergesi olarak tanımlanmıştır9,15,16,17,18, 19,20,21,22,23. Böylece klinik uygulamada yumurta kalite kontrolü için non-invaziv meyotik mil görüntülemenin kullanılabildiği ileri sürülmüştur11,14,20.
Oosit meyozisi sırasında mikrotübüler dinamiğin zaman çizelgesi1çözüldüğünden, gözlenen PLM deseni MII geçişine mi zaman seyri ile daha iyi ilişkili olabilir. PB salınımından kısa bir süre sonra, yeni ortaya çıkan MII mili PLM tarafından tespit edilemez hale gelir. Ancak, yumurtakültür tutulursa, birefringence sinyal daha sonra zaman bipolar MII mili reassemblesortayaçıkabilir 9,10,11. Bu nedenle, bir PB in vitro ekstrüzyon oositler, mil yokluğu sadece geçici MI MIi aşamasına geç olgunlaşan oosit fizyolojik geçiş karşılık olabilir. MII mili sinyali tespit edilemezise, sperm enjeksiyonu mii mili oluşumu için ekstra zaman sağlayan daha sonraki bir zaman noktasına ertelenebilir. ICSI zaman PLM destekli optimizasyon klinik olarak kullanılmak üzere geç olgunlaşan oositler şansını en üst düzeye çıkarır ve kötü prognoz hastaları için bir fark yaratmak9.
Aşağıda, insan yumurtalarında non-invaziv mil görüntülemenin nasıl yapılacağınıadım adım protokolle savuruyoruz. Ayrıca, geç olgunlaşan yumurtaların erken döllenme riskini önlemek için PLM'nin nasıl istihdam edilebildiğini de gösteriyoruz.
Protocol
Bu protokol, standart tüp bebek tedavisine 'eklenti' olan klinik prosedürü açıklamaktadır. Bu iyi laboratuvar uygulama ve klinik kurallara uygun olarak deneyimli personel tarafından yapılmalıdır24,25. Uygun hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınması önerilir. Bu protokol kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Yumurta alma ve denudasyon
- Konvansiyonel stimülasyon protokolleri kullanılarak yumurtalık stimülasyonu neden3. Tek tek yanıt için dozu ayarlayın. Ultrason taraması ile görselleştirilen iki veya daha fazla folikül 18 mm çapa ulaştığında, 250 g insan koryonik gonadotropin (hCG) uygulaması ile yumurta olgunlaşması neden olur. Program oosit pick-up (OPU) 35−36 hCG sonrası enjeksiyon.
- Toplanan kümülüs komplekslerini (CO)'ları CO2-bağımsız taşımaortamında (Malzeme Tablosu) toplayın. Co2bağımsız bir kuluçka makinesinde kısa bir kuluçka süresinin (10−15 dk) ardından, toplanan COC'leri hyaluronidase çözeltisine (MalzemeTablosu)kısaca (30 s'ye kadar) maruz bırakır. Stereomikroskop altında, 200 μL filtre ucuyla COC'leri hafifçe borulayarak kümülüs-korona hücrelerini mekanik olarak çıkarın.
- Yavaş yavaş azalan çapı (200 μm, 180 μm ve 150 m) ile denudation mikropipetler kullanarak, yavaşça kalan foliküler hücrelerden yumurta şerit ve işleme orta 3x yumurtaları yıkayın.
- Denuded oositlerin sayısını ve gelişimsel durumunu çekirdeğin ve ilk PB'nin varlığına veya yokluğuna göre değerlendirin (Şekil 1).
- PLM incelemesi için dahil etme kriterlerini kontrol edin. (1) OPU'da toplanan 6'dan az MII oositi ve (2) önceki döllenme başarısızlığı veya oosit olgunlaşma geçmişi ile konvansiyonel stimülasyona beklenmedik bir kötü tepki varsa yumurta olgunluk değerlendirmesi gerçekleştirin.
- GV, MI ve MII yumurtalarını, her biri 500 μL önceden belirlenmiştir CO2-bağımlı kültür ortamı (MalzemeTablosu)içeren bir IVF kabında ayrı kuyulara yerleştirin (MalzemeTablosu).
- %5 O2 ve %6 CO2nemli bir atmosferde 37 °C'de ek bir 3−4 saat için kuluçka.
2. PLM muayenesi ve sonraki ICSI için hazırlık
NOT: Burada sağlanan protokol, OCTAX Polar AIDE sistemi (Malzeme Tablosu) kullanılarak yapılan PLMdeğerlendirmesiniaçıklamaktadır. Alternatif olarak, diğer ticari mil görüntüleme sistemleri kullanılabilir.
- Embriyo yetiştiriciliği için plakalar hazırlayın.
- İncelenecek yumurta sayısına bağlı olarak (preinkübatasyon döneminde PB ekstrüzyon muoositlerinin toplamı ve MI oositleri), 4 kuyulu bir tabak veya 12 kuyulu bir plaka hazırlayın, her kuyuyu sırasıyla 500 μL veya 30 μL kültür ortamı ile doldurun ve daha önce dengede olan mineral yağ ile kaplayın.
- Hem kültür orta sıhem de mineral yağın bir gecede CO2 kuluçka makinesinde dengelendiğini sağlayın. Hazırlanan kabı EN az2 saat boyunca CO 2'ye bağlı kuvözde saklayın.
- ICSI yemeğini hazırlayın.
- Atanmış plastik çanak kullanın ve her PB görüntüleme yumurtası ve iğne yıkama için bir ekstra damlacık için önceden ısıtılmış işleme ortamı 5 μL damlacık olun. ICSI önce sperm immobilizasyon için polivinilpyrrolidone ek bir damlacık olun (PVP) çözeltisi (Tablo) (ICSI hemen önce sperm ekleyin) ve önceden ısıtılmış mineral yağ ile kaplama.
- Hazırlanan ICSI kabını EN az 20 dk. ICSI'den sonra yumurtaları takip etmek için gerekirse kuyuları numaralandırmak için CO2bağımsız kuvözde saklayın.
- PLM muayene yemeğini hazırlayın.
- Atanmış cam alt çanak kullanın ve her PB görüntüleme yumurtası için önceden ısıtılmış işleme ortamı 5 μL damlacıkları olun. Önceden Isınmış mineral yağ ile bindirme.
- Çanak co2-bağımsız kuluçka en az 20 dakika. PlM muayenesi nden sonra yumurtaları izlemek için gerekirse damlacıkları numara tutun.
- Mikroskobu PLM incelemesine hazırlayın.
- Doğru ısınma sıcaklığına ulaşmak için ters mikroskobun ısıtılmış sahnesini önceden değiştirin. Mikromanipülasyon işlemleri sırasında PLM/ICSI kabındaki orta damlacıkların taşınmasında 37 °C'yi koruyacak şekilde ayarların doğru şekilde ayarlandığından emin olun.
- Steril tutma ve ICSI iğnesini mikroenjeksiyon tutuculara sığdırın ve odak haline getirin. Alternatif olarak, bir kuluçka iğnesi kullanın.
- Uygun hedefi seçin (20x ve 25x en uygun) ve kondansatör parlak alan konumunda olduğundan emin olun.
- Yeşil girişim filtresi takın (ışık yeşile döner) ve sıvı kristal analiz kaydırıcısını çalışma konumuna getirin.
- Deklanşörü ~%50'ye ayarlayın ve arka plan gürültüsünü azaltmak için dairesel polarize yi ayarlayın.
- Bilgisayarı PLM incelemesine hazırlayın.
- Görüntüleme yazılımını başlatın.
- Video Seçin | Video Kaynağı | üst menü çubuğunda video menüsünde polarAIDE.
- Video sayfasına giderek canlı videoya geçin ve video araç çubuğundaki simgeye (EkŞekil1) basarak mil ve zona analizini etkinleştirin.
- Mil görüntüleme sırasında dinamik ölçekleme için ekran modunu seçin: (1) kırmızı (birefringence)/yeşil (arka plan) birleşik görünüm veya (2) beyaz (birefringence)/ve siyah (arka plan) görünümü. Dinamik puanlama modu zona pellucida otomatik puanlama için kullanılır.
3. Yumurta olgunluğunun incelenmesi
- Preinküsasyon döneminden sonra (3−4 saat), ICSI'nin standart zamanında (hCG tetikleyicisi 39−40 saat) oosit olgunluk durumunu ortaya koyan bir PLM incelemesi yapın.
- Tüm yumurtaları PLM çanak üzerinde tek tek damlacıklara aktarın ve mil görüntüleme için hazırlanan ters mikroskobun altına yerleştirin. Muayeneye başlamadan önce cam alt çanak plastik kapağı kaldırmak için unutmayın.
- İlk yumurtayı odak haline getirin. Hücreyi yeşil ışık altında aramak zorsa, yeşil filtreyi geçici olarak çekin. Yeşil filtrenin analizden önce takıldıktan emin olun.
- Bilgisayarla işlenen ve bilgisayar ekranında gerçek zamanlı olarak görüntülenen algılanan oosit birefringence görüntüsünü (yeşil arka planda kırmızı/turuncu) gözlemleyin. Sinyalin mercek te görünmediğini unutmayın.
- Işığa maruz kalma nın çok düşük/yüksek olduğunu bildiren ileti açılırsa, mikroskobun ışık yoğunluğu tonmasını kullanarak parlaklığı uygun yoğunluğa ayarlayın.
- PB saat 12'de pozisyonda olması ve PB'ye odaklanması için yumurtayı çevirmek için bir tutma ve ICSI iğnesi kullanın.
- Mil kuşu PB çevresinde ilk bakışta görülmüyorsa, polarize ışığın dizi lidle lifleri ile hizalanmasını sağlamak için zona pellucida'ya hafifçe dokunarak yumurtayı her eksen etrafında hafifçe çevirin (Ek Video ). Yumurta, sıkı dönüşe rağmen mil sinyalini gösteremediği sürece MII milinin yokluğunu bildirin.
- Gözlenen kuşlenme desenine dayanarak, yumurtaları aşağıdaki kategorilere göre sınıflandırın (Şekil2): (A) oositleri, bipolar varil şeklindeki MII milinin parlak sinyali ile açıkça açık lanmış sınırları ve hatta kuşalık dağılımı ile sınıflandırır ; (B) düzensiz sınırları ve sinyalin düzensiz dağılımı ile dismorfik, apolar ve yarı saydam MII mili ile oositler; (C) ooplazmda tespit edilebilir MII mili birefringence ile oositler; (D) anafaz I/telofaz I oositler, bir mikrotübüler köprü gösteren (ilk PB ve yumurta arasında bir bağ iplikçik) MII mili yerine.
NOT: Tespit edilebilir MII mil sinyaline sahip yumurta (A veya B sınıfı) acil ICSI için uygundur. - Bir anlık görüntü (F9) alın veya bir rapor ve/veya sonraki görüntü analizi için video kaydedin. Operatörün öznelliğini azaltmak için görüntü deseninin belgelerini saklayın.
- Bir sonraki yumurta konumuna geçin ve 3.6−3.9 adımlarını tekrarlayın.
4. ICSI zamanlaması optimize etme
- Tüm mil pozitif yumurtaları (A veya B sınıfı, adım 3.8) ICSI kabına aktarın ve standart protokollere göre ICSI'ye tabi taşırınız24,25.
- Yumurtalar tespit edilebilir MII mili sinyali göstermiyorsa, PLM kabınıCO 2'ye yerleştirin - bağımsız kuluçka makinesine yerleştirin ve ICSI'yi daha sonraki bir zamana kaydırın.
- 3.3−3.9 adımlarını takiben PLM yeniden incelemesini ~2−3 h sonra gerçekleştirin. Bazı oosit(ler) hala bir MII mili yoksa, ek 1−2 saat için ICSI'yi daha fazla geciktirin.
- Tüm yumurtaları ICSI yemeğine aktarın ve standart protokollere göre enjekte edin24. PLM çanak mikroenjeksiyon iğne bükme açısı ile uyumlu ise, parlak bir alan moduna geçtikten sonra PLM çanak hemen ICSI gerçekleştirin.
- ICSI üzerine, blastosist aşamasına kadar embriyo ekimi ve kültürü için hazırlanan plakalar için yumurta transferi.
Representative Results
Polarize ışık mikroskobu, yumurtanın nükleer olgunlaşmayı tamamlayıp tamamlamadığını ve ICSI'den önce MII mili nin monte edilip edilip edilemediğini anında incelemeyi mümkün kılar. Non-invaziv karakteri nedeniyle, güvenli klinik ortamlarda döllenme için insan yumurtasının hazır lığını değerlendirmek için kullanılabilir11,12,13,14. Spindled oositler bir mil9olmadan oositler daha canlı embriyolar neden olma olasılığı daha yüksektir9 ,15,16,17,18,19, 20.000 , 21.000 , 22.000 , 23. Ayrıca, farklı bir bipolar iğ içeren oositler dismorfik iğ 9 ,21,22ile oositler daha yüksek bir gelişimsel yeterliliğe sahip gibi görünüyor. Birlikte ele alındığında, mil görüntüleme başarıyla döllenme potansiyeline sahip yumurtaları tanımlamak için bir araç olarak hizmet verebilir, preimplantasyon geliştirme geçmesi ve tam dönem gebelik 9 ,15 , 16.02.20 , 17.000 , 18.000 , 19.09.20 , 20.000 , 21.000 , 22.000 , 23. yıl.
İğin bildirilen insidansı (%44−97) incelenen popülasyonun çeşitliliğini yansıtan9,15,16,17,18,19,20,21, 22.000 , 23.000 , 26.000 , 27.000 , 28. In vivo normal yanıtlayıcılardan yumurta olgunlaşmış genellikle hCG tetik9sonra 40 saat bipolar MII mili göstermek9 ,18,27,29. Ancak, yavaş yanıtlayıcılarda, preovulatory foliküllerden alınan yumurta havuzu olgunlaşma gecikmesi9,27'denetkilenir. Burada, mii aşamasında tutuklanan yumurtaları önemli maturasyonel geçişten geçirenlerden ayırt etmek için milgörüntüleme yapılmalıdır (Şekil 3). ICSI'den kısa bir süre önce Foliküler hücrelerin alınmasından hemen sonra foliküler hücrelerin çıkarılmasını ve IN vivo olgunlaşmış yumurtaları ve geç olgunlaşan yumurtaları iCSI'den kısa bir süre önce, in vivo olgunlaşmış yumurtaları ayırt edebilmek için ayrı kuyularda MI ve MII oositlerinin kuluçkaya yatmasını öneriyoruz. DenudasyonIII'den hemen önce yapılması durumunda, bu iki yumurta popülasyonu PB görünümüne göre ayırt edilemez.
PLM deseninin faza özgü değişiklikleri, meyotik olgunlaşma sırasında mil dinamiği bilgisi bağlamında yorumlanmalıdır. Interkinesis sırasında, bölünme aparatı kapsamlı yapısal yeniden yapılanma uğrar ve PLM sinyali geçici olarak kaybolur1,9,10,11. Bu nedenle, pb in vitro ekstrüzyon gelişimsel olarak gecikmiş oositlerde, MII mili sinyalinin yokluğu hücresel bozulmayı yansıtmayabilir, ancak yumurtanın MII evresinden MII aşamasına doğru ilerlemesini gösterebilir (Şekil3). Eğer sperm fizyolojik olmayan bir zaman noktasında enjekte edilirse, yumurtanın gelişim potansiyeli tehlikeye girer. ICSI ertelenmesi varlığı daha iyi klinik sonuçlar9,10,11ile ilişkili bir MII mili monte etmek için daha fazla zaman ile geç olgunlaşan oositler sağlar. Yavaş/zayıf yanıtlayıcıları içeren klinik çalışmada, başlangıçta mil-negatif oositlerin yaklaşık %60'ı PLM yeniden muayenesinden önce mil sinyali geliştirdi yaklaşık 2 saat sonra9. Geç olgunlaşan yumurtaların gelişim evrelerine ve genel uygunluğuna bağlı olarak, PB ekstrüzyonu sonrası MII mili görünümü genellikle 2−6 saat (yayınlanmamış gözlem) alır. İlk PLM incelemesi sırasında mikrotübül köprüsü (anafaz/telosphase, Grade D) sergileyen yumurtalar, görünür mili olmayan yumurtalardan (yükselen iğler, C notu) daha mii mili sinyali geliştirmek için daha uzun bir süre gerektirir. Yumurtanın gelişim evresine ICSI zamanının bireysel ayarlanması yumurtanın erken aktivasyonunu önler ve döllenme oranının iyileştirilmesi ve başarılı embriyo gelişimi ile sonuçlanır9.
PB ekstrüzyonda geç olgunlaşan yumurtalar genellikle In vivo olgunlaşmış oositlere göre daha düşük gelişimsel yeterliliğe sahip olsalar da, geciken ICSI'den önce tespit edilebilir bir mili monte etmeyi başarırlarsa embriyo gelişim oranı kabul edilebilir (blastulation oranı %41,32'dir. Bu yaklaşımı kullanarak, normalde doğurganlık tedavisi için reddedilen olgunlaşmamış oositler bile klinik olarak kullanılabilir, transfer edilebilir embriyolar üretebilir ve tam süreli gebeliklere yol açabilir. Her bir yumurtanın maturational evresinin değerlendirilmesi, az sayıda MII oosit imal eden ve/veya olgunlaşmamış yumurtaların vitro olgunlaşmasını yaptıktan sonra zayıf prognoz döngülerinde özellikle faydalıdır9.
Yumurta olgunluk değerlendirmesi dışında, anafaz I/telofaz oositlerde mil yıkımının önlenmesi için PB biyopsisi öncesinde iğ görüntülemesi de önerilir. Deneysel embriyolojide, meyotik milin görselleştirilmesi yumurta enükleasyonu ve/veya mil transferi işlemi sırasında kullanılır13.
Şekil 1: İnsan yumurta olgunlaşması. In vivo olgunlaşmış oositler (MII) alma sırasında PB sergiler. Olgunlaşmamış yumurtalar (GV, MI) kendiliğinden in vitro olgunlaşma tamamlayabilirsiniz. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PLM tarafından saptanan desene göre oosit sınıflandırması. Mil sinyalinin görünümüne göre oosit sınıflarının (A-D) temsili örnekleri. PLM ile saptanan desen: (A) belirgin bipolar mil sinyali, (B) yarı saydam apolar MII mili mili, (C) saptanabilir mil ve (D) mikrotübül köprüsü. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yumurta olgunlaşmasında MI-MII geçiş aşamaları. Parlak alanda (üst sıra) yumurtaların görünümü, kromozomlar (camgöbeği) ve mikrotübüllerin floresan sinyali (macenta) (orta sıra) ve polarize ışıkta (alt sıra) gösterilir. Her yumurta ilk PLM-incelenmiş ve hemen sabit. Sabit oositler (immüno) Hoechst (DNA) ve anti-α-tubulin antikor (mikrotübüller) ile etiketlendi. Sarı ok PB varlığını gösterir ve beyaz ok birefringent mikrotübüllerin konumunu vurgular. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakam Holubcová ve ark., JARG 2019 9'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kromozom-mikrotübül organizasyonunun polarize ışık mikroskobu ile saptanan kuşafringence paterni ile korelasyonu. Parlak alanda oositlerin kromozomlar (camgöbeği) ve mikrotübüller (macenta) (üst sıra) ve polarize ışıkta (alt sıra) floresan sinyali ile birleştiğinde görünümü gösterilir. Her yumurta PLM incelemesinden hemen sonra düzeltildi. DNA (Hoechst) ve mikrotübül (α-tubulin) lekeliidi. (A-C) PLM saptanabilir mili ile yumurtalar henüz yanlış hizalanmış kromozomlar (A , B) veya gevşek odaklanmış mil kutupları (C); (D-F) PLM-saptanabilir MII mili olmadan anormal oositler az gelişmiş gösteren (D), apolar (E) veya hiçbir mil (F). Beyaz ok birefringent mikrotübüllerin konumunu vurgular ve yıldız (*) decondensed kromatin konumunu gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İnsan yumurtalarında birefringence yapıları. (A-D) insan yumurtalarında PLM tarafından saptanan birefringent yapıların temsili örnekleri. ZP = zona pellucida; PM = plazma membranı (oolema); RB = refractile cisimler, vakuoller. Beyaz ok, olgunlaşmanın farklı aşamalarında meiotik iğ. (E) MII mili polar cisim (PB) ile uyumsuzluk. (F) Plazma zarından mil ayrılması. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Görüntü analiz yazılımının masaüstü düzeni. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Video: PLM muayene prosedürü. Yumurtanın döndürülmesi, milin (ok) varlığını dışlamak için gereklidir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
İnsan yumurtalarında acentozomal meyotik mil son derece dinamik ve hassas bir yapı1. Suboptimal koşullar altında, mikrotübül lifleri hızla depolimerize ve meyotik mil demonte30,31,32,33. Bu nedenle, oosit kültürü ve mikromanipülasyon koşulları, yani sıcaklık ve pH en uygun aralıkta olduğundan emin olmak için kritik öneme sahiptir. Milin bozulması riskini en aza indirmek için, yumurtalar sıcaklık kontrollü bir ortamda tutulmalıdır 37 ± 0.5 °C'lik bir sıcaklık ortamında saklanmalıdır. Isıtmalı bir evre ile donatılmış mikroskoplar ve mikroenjeksiyon kurulumu kesinlikle gereklidir. PH fluctulations önlemek için HEPES / MOPS tamponlu ortamda kuluçka dışında oositler ile tüm manipülasyon yapılmalıdır. Ortam koşullarında aşırı yumurta tesliminin olası yan etkilerinden kaçınmak için, PLM muayenesinin toplam süresi 10 dakikayı geçmemelidir. Yumurtalar, ışık yolunda standart bir plastiğin konumlandırılması görüntü analizini bozduğu için, plastik kapak çıkarılmış cam alt çanak üzerinde analiz edilmelidir. Plastik ve cam alt tabaklar farklı termal özelliklere sahip olduğundan, sıcaklık muayene kabında taşıma ortamı damlacıkları doğrudan kontrol edilmelidir.
Laboratuvar koşullarına ek olarak, prosedür farklılıkları ve operatörün mikromanipülasyon becerileri PLM muayene doğruluğu üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Sadece yüksek oranda monte edilmiş bipolar iğler noninvaziv olarak görselleştirilebilir. Gözlenen sinyal, milin yapısal organizasyon derecesi ile orantılıdır. Yeni doğan, apolar, gevşetilmiş veya düzensiz iğler sadece bulanık birefringence veya hiç görüntülemek (Şekil 3 ve Şekil 4). Ayrıca polarize ışığın mikrotübül dizileriyle kusurlu hizalanması, iyi gelişmiş bipolar milin gerçek varlığına rağmen sadece yarı saydam ve kötü tanımlanmış birefringence üretir (Şekil 4). Düzgün yönlendirilmiş sürece, iğ sinyali kolayca cevapsız olabilir ve oosit olgunluk yanlış teşhis (EkVideo). En iyi mil görüntülemesi için yumurtanın her eksen etrafında düzgün bir şekilde döndürülmesi gerekir. Birefringence gözlük görünür olmadığından, operatör yumurta döndürme yaparken bilgisayar ekranı izlemek zorundadır. Klinik uygulamaya geçmeden önce fazla in vitro olgunlaşmış oositlerde mikromanipülasyon ve mil görüntüleme eğitimi ile ilgili önceki deneyimler arzu edilir.
Iğ yanı sıra, yumurta, oolema, zona pellucida'nın iç tabakası ve bazı sitoplazmik yapılar (örn. refractile cisimleri, vakuoller) çevreleyen kümülüs hücreleri birefringence sergilerler (Şekil 5A-D). Görüntülemeden önce yumurtadan iyice çıkarılmadığı sürece, sıkıca bağlanmış foliküler hücreler arka plan gürültüsü nezsesi üretir ve meyotik mil algılamasını tehlikeye attırır. Iğ için büyük bir kırılma gövdesi hata değil dikkatli olun. Sitoplazmada bulunan birçok sitoplazmik dahil etme, koyu arka planla keskin bir tezat oluşturan yüksek parlaklık gösterir. Meiyotik mil, diğer taraftan, sadece orta sinyal, bulanık sınırları sergiler ve genellikle ilk PB altında veya bitişik oolema bağlanır. Bazen, PLM incelemesi standart konumundan brüt mil sapması ortaya koymaktadır (Şekil5E,F). Bölme aparatı ve PB arasında büyük bir uyumsuzluk varsa, PLM mikroenjeksiyon sırasında mil yaralanması riskini önlemek için yumurta yönlendirmek için yardımcı olur. Yumurta içindeki milin göreceli konumu, elde edilen embriyoların gelişimpotansiyelini etkilemez17,34. Ancak, iğ lezin lemden ayrılırken, döllenme anormallikleri ortaya çıkar. İlginçtir ki, bazı düşük kaliteli oositler mikrotübül nükleasyonu başlatmak yerine PB ekstrüzyondan hemen sonra kromatin dekonsidensasyonuna uğrarlar (Şekil4F). Geleneksel ışık mikroskobu ve pb yumurta olgunluğunun tek belirteci olarak kullanılması, bu tür alt-yetkili oositler döllenebilir olarak kabul edilecektir. Böylece, rutin morfolojik değerlendirme üstüne, mil görüntüleme yumurtanın olgunluk hakkında önemli bilgiler ekler ve kalitesinin dolaylı bir belirteç olarak hizmet verebilir.
İğlenmiş MII oositlerinin insidansı çalışma popülasyonunun özelliklerinden (örn. genetik arka plan, tıbbi durum, anne yaşı) etkilenebilir. Buna ek olarak, kohort içinde gelişimsel olarak gecikmiş yumurtaların oranı tespit edilen mil-negatif yumurtaların gerçek sayısını etkileyecektir9,27. Meiyotik mil görselleştirmesi, MII aşamasında yakalanan döllenebilir yumurtaların açıkça tanımlanmasını mümkün kılar. Ayrıca, daha sonra ikinci muayene mil-negatif oosit anormal olup olmadığını ortaya çıkarabilir ya da sadece son zamanlarda MI / MIIgeçiş9 ile ilerlemiştir,10,11. ICSI'den önce bir iğ geliştirilmesine izin verildiğinde, rutin olarak atılarak bile olgunlaşmamış yumurtalar, canlı embriyolar üretebilir9. Döllenme için çok az oosit bulunan döngülerde, PB ekstrüzyon oositlerin ince zamanlı ICSI'si bir kurtarma stratejisi ve döngü iptaline alternatif olarak hizmet edebilir.
Bununla birlikte, preinküsasyon süresini uzatmak tüm yumurtalara genelleştirilmemelidir. In vivo normal yanıtlayıcılardan yumurta olgunlaşmış genellikle bir MII mili 9,20,21,27sergiler . Burada, başarılı mil görüntüleme şansı zaman içinde in vitro yaşlanma 35 yumurtalıksonrası bir sonucu olarak azalır. Mümkünse, ICSI alma gününde yapılmalıdır ve 9 saati (hCG sonrası 45 saat) geçmemelidir, embriyo kalitesinde bir düşüş ile ilişkili dönem36,37. Farklı bipolar iğler gösteren oositler daha fazla gecikmeden ICSI'ye tabi tutulmalıdır. Özetle, Erken sperm enjeksiyonu riskini dışlamak için kötü prognozlu hastalarda ICSI zamanlamasının bireyselleştirilmiş optimizasyonu faydalıdır. Ancak, gereksiz, çok zaman alıcı ve zahmetli tüm IVF döngüleri yapılacak.
PLM analizi yumurtanın MII aşamasına ulaşıp ulaşmadığını ortaya koymaktadır. Ancak, meyiyotik milin noninvaziv görselizasyonu kromozom organizasyonu hakkında bilgi sağlamaz. Bipolar iğ içeren yumurtalarda şiddetli kromozom uyumsuzluğu ve/veya anne yaşına bağlı kromatit bölünmesi olabilir (Şekil5). Üreme başarısı üzerinde diğer çeşitli faktörlerin (örneğin, sperm faktörü, mitokondri, embriyonik genom aktivasyonu, düzensiz bölünme, epigenetik, endometrium, maternal bağışıklık) önemli bir etkisi vardır. Bu nedenle, MII milinin tek başına saptanması, IVF prosedürünün olumlu bir klinik sonucunu garanti etmez.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Reprofit International'ın embriyoloji laboratuvarına teşekkür ederiz. Ayrıca MEYS CR (LM2015062 Çek-Biyogörüntüleme) tarafından desteklenen CEITEC'in çekirdek tesis CELLIM'ini, burada sunulan immünoffloresans görüntüleme verilerini elde etme konusundaki desteklerinden dolayı kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 90164 | bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture |
| Denuding micropipette 150 µm | Microtech IVF | 005-150C | |
| Denuding micropipette 180 µm | Microtech IVF | 005-180B | suitable for oocyte transfer between dishes |
| Denuding micropipette 200 µm | Microtech IVF | 005-250-A | suitable for oocyte transfer between dishes |
| FluoroDish | World Precision Instruments | FD 5040-100 | glass-bottom dish |
| (alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells) | |||
| Holding micropipette | Microtech | 001-120-30 | sterile glass microneedles |
| Hyaluronidase solution | Irvine Scientific | 90101 | for oocyte denudation |
| ICSI micropipette | Microtech | 002-5-30 | sterile glass microneedles |
| Micro Droplet Culture Dish | Vitrolife | 16003 | 12-well plate for embryo culture |
| Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin | Irvine Scientific | 90163 | handling medium, MOPS/HEPES buffered |
| Nikon Eclipse TE 2000-U | Nikon | inverted microscope with heated stage | |
| Nunc IVF Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 150270 | plastic ICSI dish |
| Nunc non-treated 4-well IVF dish | Thermo Fisher Scientific | 179830 | 4-well plate for embryo culture |
| OCTAX polarAide | MTG | integrated PLM system | |
| Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | oil for overlay |
| Polyvinylpyrrolidone | Irvine Scientific | 90123 | for sperm immobilization prior to ICSI |
References
- Holubcova, Z., Blayney, M., Elder, K., Schuh, M. Human oocytes. Error-prone chromosome-mediated spindle assembly favors chromosome segregation defects in human oocytes. Science. 348 (6239), 1143-1147 (2015).
- Oudendijk, J. F., Yarde, F., Eijkemans, M. J., Broekmans, F. J., Broer, S. L. The poor responder in IVF: is the prognosis always poor?: a systematic review. Human Reproduction Update. 18 (1), 1-11 (2012).
- Gautam, N., Allahbadia, Y. M. Ovarian Stimulation Protocols. , Springer. India, Mumbai, India. (2016).
- Piqueras, P., et al. Live birth after replacement of an embryo obtained from a spontaneously in vitro matured metaphase-I oocyte. Systems Biology in Reproductive Medicine. 63 (3), 209-211 (2017).
- Liu, J., Lu, G., Qian, Y., Mao, Y., Ding, W. Pregnancies and births achieved from in vitro matured oocytes retrieved from poor responders undergoing stimulation in in vitro fertilization cycles. Fertility and Sterility. 80 (2), 447-449 (2003).
- Shu, Y., et al. Fertilization, embryo development, and clinical outcome of immature oocytes from stimulated intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertility and Sterility. 87 (5), 1022-1027 (2007).
- Sachdev, N. M., Grifo, J. A., Licciardi, F. Delayed intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with trophectoderm biopsy and preimplantation genetic screening (PGS) show increased aneuploidy rates but can lead to live births with single thawed euploid embryo transfer (STEET). Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (11), 1501-1505 (2016).
- De Vos, A., Van de Velde, H., Joris, H., Van Steirteghem, A. In-vitro matured metaphase-I oocytes have a lower fertilization rate but similar embryo quality as mature metaphase-II oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 14 (7), 1859-1863 (1999).
- Holubcova, Z., et al. Egg maturity assessment prior to ICSI prevents premature fertilization of late-maturing oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 36 (3), 445-452 (2019).
- Montag, M., Schimming, T., van der Ven, H. Spindle imaging in human oocytes: the impact of the meiotic cell cycle. Reproductive BioMedicine Online. 12 (4), 442-446 (2006).
- Montag, M., van der Ven, H. Symposium: innovative techniques in human embryo viability assessment. Oocyte assessment and embryo viability prediction: birefringence imaging. Reproductive BioMedicine Online. 17 (4), 454-460 (2008).
- Keefe, D., Liu, L., Wang, W., Silva, C. Imaging meiotic spindles by polarization light microscopy: principles and applications to IVF. Reproductive BioMedicine Online. 7 (1), 24-29 (2003).
- Caamano, J. N., Munoz, M., Diez, C., Gomez, E. Polarized light microscopy in mammalian oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 45, 49-56 (2010).
- Eichenlaub-Ritter, U., Shen, Y., Tinneberg, H. R. Manipulation of the oocyte: possible damage to the spindle apparatus. Reproductive BioMedicine Online. 5 (2), 117-124 (2002).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. The spindle observation and its relationship with fertilization after intracytoplasmic sperm injection in living human oocytes. Fertility and Sterility. 75 (2), 348-353 (2001).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Keefe, D. L. Developmental ability of human oocytes with or without birefringent spindles imaged by Polscope before insemination. Human Reproduction. 16 (7), 1464-1468 (2001).
- Moon, J. H., et al. Visualization of the metaphase II meiotic spindle in living human oocytes using the Polscope enables the prediction of embryonic developmental competence after ICSI. Human Reproduction. 18 (4), 817-820 (2003).
- Cohen, Y., et al. Spindle imaging: a new marker for optimal timing of ICSI? Human Reproduction. 19 (3), 649-654 (2004).
- Rama Raju, G. A., Prakash, G. J., Krishna, K. M., Madan, K. Meiotic spindle and zona pellucida characteristics as predictors of embryonic development: a preliminary study using PolScope imaging. Reproductive BioMedicine Online. 14 (2), 166-174 (2007).
- Heindryckx, B., De Gheselle, S., Lierman, S., Gerris, J., De Sutter, P. Efficiency of polarized microscopy as a predictive tool for human oocyte quality. Human Reproduction. 26 (3), 535-544 (2011).
- Kilani, S., Cooke, S., Tilia, L., Chapman, M. Does meiotic spindle normality predict improved blastocyst development, implantation and live birth rates? Fertility and Sterility. 96 (2), 389-393 (2011).
- Kilani, S., Chapman, M. G. Meiotic spindle normality predicts live birth in patients with recurrent in vitro fertilization failure. Fertility and Sterility. 101 (2), 403-406 (2014).
- Tilia, L., Venetis, C., Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Is oocyte meiotic spindle morphology associated with embryo ploidy? A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 105 (4), 1085-1092 (2016).
- ESHRE Guideline Group on Good Practice in IVF Labs, De los Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Human Reproduction. 31 (4), 685-686 (2016).
- Principles of IVF Laboratory Practice: Optimizing Performance and Outcomes. Montag, M., Morbeck, D. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2017).
- Chamayou, S., et al. Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos. Reproductive BioMedicine Online. 13 (5), 661-667 (2006).
- Rienzi, L., et al. Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar body position and oocyte developmental potential after ICSI. Human Reproduction. 18 (6), 1289-1293 (2003).
- Woodward, B. J., Montgomery, S. J., Hartshorne, G. M., Campbell, K. H., Kennedy, R. Spindle position assessment prior to ICSI does not benefit fertilization or early embryo quality. Reproductive BioMedicine Online. 16 (2), 232-238 (2008).
- Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Time course of meiotic spindle development in MII oocytes. Zygote. 19 (1), 55-62 (2011).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Human Reproduction. 16 (11), 2374-2378 (2001).
- Sun, X. F., Wang, W. H., Keefe, D. L. Overheating is detrimental to meiotic spindles within in vitro matured human oocytes. Zygote. 12 (1), 65-70 (2004).
- Mullen, S. F., et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of human oocytes, and the relevance to cryopreservation. Human Reproduction. 19 (5), 1148-1154 (2004).
- Swearman, H., et al. pH: the silent variable significantly impacting meiotic spindle assembly in mouse oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 37 (3), 279-290 (2018).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human Reproduction Update. 17 (1), 34-45 (2011).
- Miao, Y. L., Kikuchi, K., Sun, Q. Y., Schatten, H. Oocyte aging: cellular and molecular changes, developmental potential and reversal possibility. Human Reproduction Update. 15 (5), 573-585 (2009).
- Pujol, A., Garcia, D., Obradors, A., Rodriguez, A., Vassena, R. Is there a relation between the time to ICSI and the reproductive outcomes? Human Reproduction. 33 (5), 797-806 (2018).
- Yanagida, K., et al. Influence of oocyte preincubation time on fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (8), 2223-2226 (1998).
