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Developmental Biology

मानव अंडा परिपक्वता आकलन और इसके नैदानिक आवेदन

doi: 10.3791/60058 Published: August 19, 2019

Summary

हम polarized प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मानव अंडे परिपक्वता के गैर इनवेसिव मूल्यांकन के लिए नैदानिक प्रोटोकॉल की एक रूपरेखा प्रदान करते हैं.

Abstract

intracytoplasmic शुक्राणु इंजेक्शन (ICSI) का इष्टतम समय प्रजनन कार्यक्रमों के लिए एक गंभीर चिंता का विषय है क्योंकि असामयिक शुक्राणु प्रविष्टि अंडे के विकास क्षमता कम हो जाती है. प्रथम ध्रुवीय शरीर (पीबी) की उपस्थिति एक साथ meiotic धुरी के साथ अंडाणु परिपक्वता और निषेचन के लिए अंडे की तत्परता के पूरा होने का संकेत है. नैदानिक अभ्यास में, यह मान लेना प्रथागत है कि पंजाब को प्रदर्शित करने वाले सभी अंडाणु परिपक्व मेटाफेज (एमआईआई) ओसाइट्स हैं। हालांकि, पंजाब बाहर निकालना द्विध्रुवी MII धुरी के गठन से पहले. इस अतुल्यकाल पंजाब की मात्र उपस्थिति oocyte परिपक्वता के एक अविश्वसनीय मार्कर बनाता है. noninvasive धुरी इमेजिंग polarized प्रकाश माइक्रोस्कोपी (PLM) का उपयोग कर त्वरित और आसान निरीक्षण की अनुमति देता है कि क्या पंजाब प्रदर्शित oocyte वास्तव में ICSI से पहले एक meiotic धुरी reassembled. यहाँ, हम नैदानिक प्रयोगशाला में मानव अंडा परिपक्वता मूल्यांकन करने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम यह भी बताते हैं कि ओसाइट के विकास के चरण के संबंध में आईसीएसआई के समय को कैसे अनुकूलित करें ताकि देर से-मटरिंग ऊसाइट्स के समय से पहले शुक्राणु इंजेक्शन को रोका जा सके। इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, यहां तक कि अपरिपक्व oocytes इन विट्रो में पंजाब extruding चिकित्सकीय उपयोग किया जा सकता है. पुष्टि है कि MII धुरी शुक्राणु इंजेक्शन और ICSI के समय के व्यक्तिगत समायोजन से पहले मौजूद है गरीब रोग का रोग इन-विट्रो निषेचन (IVF) चक्र में विशेष रूप से निषेचन के लिए उपलब्ध ocytes की एक कम संख्या के साथ महत्वपूर्ण है.

Introduction

एक निषेचनीय अगुणित अंडा बनने के लिए, द्विगुणित अंडाणु को अपनी आनुवंशिक जानकारी का आधा आसन्न कोशिका में निकालना होता है, जिसे पहले ध्रुवीय शरीर (पीबी) कहा जाता है, और द्विध्रुवी मेटाफेज II (एमआईआई) धुरी के भूमध्य रेखा में गुणसूत्रों को संरेखित करना होता है। जबकि पंजाब स्पष्ट रूप से पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा जा सकता है, आनुवंशिक सामग्री और cytoskeletal संरचनाओं का पता लगाने आम तौर पर आक्रामक तैयारी प्रक्रियाओं है कि प्रजनन उपचार के लिए ocyte के आगे उपयोग के साथ असंगत हैं की आवश्यकता है. इसलिए, नैदानिक अभ्यास में, पंजाब की उपस्थिति को अंडाणु परिपक्वता की पहचान के रूप में माना जाता है। हालांकि, मानव अंडाणु परिपक्वता के दौरान microtubule और गुणसूत्र गतिशीलता के लाइव इमेजिंग से पता चला कि पंजाब द्विध्रुवी MII धुरी इकट्ठा किया जाता है और गुणसूत्रों गठबंधन कर रहे हैं1से पहले कुछ घंटे दिखाई देता है. फिर भी, संचारित प्रकाश में, MII गिरफ्तार अंडे ocytes जो सिर्फ गुणसूत्र अलगाव की प्रक्रिया में प्रवेश से अविवेच्य हैं. इस प्रकार, अंडाणुओं का एक सहगण, जिसे केवल पंजाब की उपस्थिति के आधार पर एमआईआई ओसाइट्स के रूप में वर्गीकृत किया गया है, में देर से ओसाइट्स हो सकते हैं जो अभी तक अपना विकास पूरा नहीं कर चुके हैं और इस प्रकार निषेचन के लिए तैयार नहीं हैं।

अंडाणु परिपक्वता की देरी से गरीब प्रतिक्रियाकर्ताओं की संख्या कम होने की संभावना है जिसमें एमआईआई ऊसाइटों की संख्या कम हो जाती है और उत्तेजित चक्र2में अप्रत्याशित रूप से अपरिपक्व अंडाणुओं का उच्च अनुपात होता है . विवो में, केवल एक एकल, सबसे अच्छी गुणवत्ता वाले अंडे परिपक्वता प्राप्त करता है और ovulated हो जाता है। इन-विट्रो निषेचन (आईवीएफ) चक्र में, नियंत्रित डिम्बग्रंथि hyperstimulation परिपक्वता के लिए कई अंडाणुओं की भर्ती करने के लिए प्रयोग किया जाता है। गोनाडोट्रोपिन वृद्धि से माइओटिक कार्यक्रम की बहाली शुरू हो जाती है और अंडे के जनक ों को 36 घंटेकेभीतर एमआईआई गिरफ्तारी चरण तक पहुंचने की अपेक्षा की जाती है . हालांकि, preovulatory follicles से प्राप्त अंडाणु अक्सर पीबीdisplaying MIi oocytes और अपरिपक्व oocytes के एक वर्गीकरण का गठन, या तो मेटाफेज मैं (एमआई) या germinal वेस्कल चरण (GV) (चित्र 1)। केवल एमआईआई ओसाइट्स इंट्रासाइटोप्लाज्मिक शुक्राणु इंजेक्शन (आईसीएसआई) के अधीन हैं, जबकि अपरिपक्व अंडाणु आमतौर पर खारिज कर दिए जाते हैं। फिर भी, जब इन विट्रो में खेती की जाती है, तो एमआई ओसाइट्स आमतौर पर इन विट्रो में पंजाब को बाहर निकालने के लिए मनाया जाता है। उनकी सामान्य हीनता के बावजूद, देर से-मटरिंग oocytes जो सहज रात भर संस्कृति के दौरान पहली meiotic विभाजन पूरा सफलतापूर्वक पिछले संसाधन oocytes के रूप में इस्तेमाल किया गया है, और जीवित जन्मों की सूचना दी गई है4,5 ,6,7,8. इसलिए, शुक्राणु का असामयिक इंजेक्शन एक प्राथमिक कारण हो सकता है जो पिछले अध्ययनों9,10,11में रिपोर्ट किए गए देर से-मटरिंग ओसाइट्स के खराब विकास ात्मक परिणामों के अंतर्निहित हो सकता है .

एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के साथ संयुक्त Polarized प्रकाश माइक्रोस्कोपी (PLM) लाइव अंडाणु में meiotic धुरी के गैर इनवेसिव दृश्य के लिए अनुमति देता है. डबल प्रतिबिंब द्विध्रुवी धुरी के निर्माण microtubules के अत्यधिक आदेश विधानसभा के साथ polarized प्रकाश बीम की बातचीत से उत्पन्न होता है. चूंकि ध्रुवित प्रकाश सामान्य तीव्रता का है , इसलिए इस तकनीक का प्रयोग नैदानिक सेटिंग्स में विभाजन तंत्र11,12,13,14की गतिशीलता को देखने के लिए सुरक्षित रूप से किया जा सकता है . अंडाणु के भीतर एमआईआई तर्कु द्वि-प्रावरण की उपस्थिति की पहचान अंडे की विकास क्षमता9,15,16,17,18के मार्कर के रूप में की गई है, 19,20,21,22,23. इस प्रकार, यह सुझाव दिया गया है कि गैर इनवेसिव meiotic धुरी इमेजिंग नैदानिक अभ्यास में अंडे की गुणवत्ता नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकताहै 11,14,20.

चूंकि अंडाणु अर्धसूत्री विषाणु के दौरान माइक्रोट्युबुलर गतिशीलता के लिए समय-सीमा1हल की गई है, इसलिए मनाया गया पीएलएम पैटर्न एमआई आई आई संक्रमण के समय पाठ्यक्रम से बेहतर हो सकता है। पंजाब उत्सर्जन के तुरंत बाद, नवजात MII धुरी पीएलएम द्वारा undetectable हो जाता है. हालांकि, अगर अंडाणुओं को संस्कृति में रखा जाता है, तो द्विध्रुवी एमआईआई धुरी9,10,11को फिर से इकट्ठा करने पर बाद में उभर सकता है। इस प्रकार, अंडाणुओं में एक पंजाब इन विट्रो में extruding, धुरी की अनुपस्थिति केवल अस्थायी एमआई से MII चरण के लिए देर से परिपक्व अंडाणु के शारीरिक संक्रमण के लिए इसी हो सकती है. यदि MII धुरी संकेत undetectable है, शुक्राणु इंजेक्शन एक बाद समय बिंदु MII धुरी गठन के लिए अतिरिक्त समय प्रदान करने के लिए आस्थगित किया जा सकता है. ICSI समय के PLM-सहायता प्राप्त अनुकूलन नैदानिक उपयोग किया जा करने के लिए देर से परिपक्व oocytes की संभावना को अधिकतम और गरीब रोग का रोग का पूर्वानुमान रोगियोंकेलिए एक फर्क 9 .

नीचे, हम मानव oocytes में गैर इनवेसिव धुरी इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए कैसे की एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि कैसे PLM देर से-मटरिंग oocytes के समय से पहले निषेचन के जोखिम से बचने के लिए नियोजित किया जा सकता है.

Protocol

इस प्रोटोकॉल नैदानिक प्रक्रिया है जो मानक आईवीएफ उपचार के लिए एक 'add-on' है वर्णन करता है. यह अच्छा प्रयोगशाला अभ्यास और नैदानिक दिशा निर्देशों के अनुपालन में अनुभवी कर्मियों द्वारा किया जाना चाहिए24,25. पात्र रोगियों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है। इस प्रोटोकॉल को संस्थागत आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. अंडा पुनः प्राप्ति और निंदा

  1. पारंपरिक उत्तेजना प्रोटोकॉल3का उपयोग डिम्बग्रंथि उत्तेजना प्रेरित . व्यक्तिगत प्रतिक्रिया के लिए खुराक समायोजित करें. जब दो या अधिक follicles, अल्ट्रासाउंड स्कैन द्वारा कल्पना, 18 मिमी के एक व्यास तक पहुँचने, 250 ग्राम मानव chorionic gonadotropin (एचसीजी) के आवेदन के साथ oocyte परिपक्वता प्रेरित. अनुसूची ocyte पिक-अप (OPU) पर 35 डिग्री 36 एच पोस्ट एचसीजी इंजेक्शन.
  2. सीओ2में पुनः प्राप्त कपास-ऊसाइट परिसरों (सीओसी) को एकत्र करें - स्वतंत्र हैंडलिंग माध्यम (सामग्रीकीतालिका)। एक सीओ2- स्वतंत्र इनक्यूबेटर में एक छोटी ऊष्मायन अवधि (10 डिग्री 15 मिनट) के बाद, संक्षेप में (30 s तक) hyaluronidase समाधान के लिए एकत्र सीओसी का पर्दाफाश (सामग्रीकीतालिका)। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, यंत्रवत् एक 200 डिग्री एल फिल्टर टिप के साथ सीओसी पाइपिंग द्वारा cumulus-कोरोना कोशिकाओं को हटा दें।
  3. धीरे-धीरे कम व्यास (200 डिग्री, 180 डिग्री मीटर और 150 डिग्री मीटर) के साथ डेनूडेशन माइक्रोपिपेट का उपयोग करना, धीरे से शेष कूपिक कोशिकाओं से ओसाइट्स को पट्टी करें और मध्यम से निपटने में ओसाइट्स 3x को धो एंडिएट्स करें।
  4. नाभिक और प्रथम पीबी की उपस्थिति या अनुपस्थिति के अनुसार विकृत अंडाणुओं की संख्या और विकास की स्थिति का आकलन करना (चित्र1)।
  5. PLM परीक्षा के लिए शामिल किए जाने के मानदंड की जाँच करें. एक अंडा परिपक्वता मूल्यांकन बाहर ले अगर वहाँ है (1) से कम के साथ पारंपरिक उत्तेजना के लिए एक अप्रत्याशित गरीब प्रतिक्रिया 6 MII oocytes OPU में एकत्र और (2) पिछले निषेचन विफलता या oocyte अपरिपक्वता का एक इतिहास.
  6. जीवी, एमआई और एमआई ओसाइट्स को आईवीएफ डिश में अलग-अलग कुओं में रखें, प्रत्येक में खनिज तेल ( सामग्री कीतालिका) से कवर किए गए पूर्व-समानीकृत सीओ 2-निर्भर संस्कृति माध्यम (सामग्री की तालिका) का 500 डिग्री सेल्सियस होता है।
  7. 5% व्2 और 6% ब्व्2के आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 3 डिग्री 4 एच के लिए इनक्यूबेट ।

2. पीएलएम परीक्षा और बाद में आईसीएसआई के लिए तैयारी

नोट: यहाँ प्रदान की प्रोटोकॉल OCTAX ध्रुवीय AIDE प्रणाली(सामग्री कीतालिका) का उपयोग कर प्रदर्शन किया PLM मूल्यांकन का वर्णन करता है. वैकल्पिक रूप से, अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध धुरी दृश्य प्रणालियों का इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. भ्रूण की खेती के लिए प्लेटें तैयार करें।
    1. जांच की जा करने के लिए oocytes की संख्या के आधार पर (एमआई ओसाइट्स की कुल, और एमआई oocytes preincubation अवधि के दौरान एक पंजाब extruding), या तो एक 4-वेल प्लेट या एक 12 अच्छी तरह से थाली तैयार, संस्कृति माध्यम के 500 $ या 30 $L के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से भरें, क्रमशः , और पहले से समभित खनिज तेल के साथ कवर.
    2. सुनिश्चित करें कि दोनों संस्कृति मध्यम और खनिज तेल सीओ2 इनक्यूबेटर में रात भर बराबर किया गया है. कम से कम 2 ज के लिए सीओ2-निर्भर इनक्यूबेटर में तैयार पकवान रखें। यदि आवश्यक हो तो व्यक्तिगत अंडाणुओं के विकासात्मक भाग्य को ट्रैक करने के लिए कुओं की संख्या।
  2. ICSI पकवान तैयार करें.
    1. असाइन किए गए प्लास्टिक डिश का उपयोग करें और प्रत्येक पंजाब-प्रदर्शन ऊसाइट और सुई धोने के लिए एक अतिरिक्त छोटी बूंद के लिए प्रीवार्म्ड हैंडलिंग माध्यम की 5 डिग्री एल छोटी बूंद बनाएं। ICSI से पहले शुक्राणु स्थिरीकरण के लिए पॉलीविनाइलपिरोलिडोन (पीवीपी) घोल (सामग्रीकी तालिका) की एक अतिरिक्त छोटी बूंद बनाएं (आईसीएसआई से पहले शुक्राणु जोड़ें) और प्रीवार्म्ड खनिज तेल के साथ ओवरले करें।
    2. कम से कम 20 मिनट के लिए सीओ2-स्वतंत्र इनक्यूबेटर में तैयार ICSI पकवान रखें। आईसीएसआई के बाद ओसाइट्स को ट्रैक करने के लिए यदि आवश्यक हो तो कुओं की संख्या।
  3. PLM परीक्षा पकवान तैयार करें.
    1. असाइन किए गए ग्लास बॉटम डिश का उपयोग करें और प्रत्येक पीबी-प्रदर्शन ऊसाइट के लिए प्रीवार्म्ड हैंडलिंग माध्यम की 5 डिग्री एल बूंदों को बनाएं। prewarmed खनिज तेल के साथ ओवरले.
    2. कम से कम 20 मिनट के लिए सीओ2-स्वतंत्र इनक्यूबेटर में पकवान रखें। पीएलएम परीक्षा के बाद ओसाइट्स को ट्रैक करने के लिए यदि आवश्यक हो तो बूंदों को नंबर दें।
  4. PLM परीक्षा के लिए तैयार माइक्रोस्कोप सेट करें।
    1. सही वार्मिंग तापमान को प्राप्त करने के लिए पहले से ही उल्टे माइक्रोस्कोप पर गर्म चरण को स्विच करें। सुनिश्चित करें कि सेटिंग्स सही micromanipulation प्रक्रियाओं के दौरान PLM/ICSI डिश में हैंडलिंग मध्यम बूंदों में 37 डिग्री सेल्सियस बनाए रखने के लिए समायोजित कर रहे हैं।
    2. बाँझ होल्डिंग और आईसीएसआई सुई को माइक्रोइंजेक्शन धारकों में फिट करें और उन्हें ध्यान में लाएं। वैकल्पिक रूप से, एक hatching सुई का उपयोग करें.
    3. उपयुक्त उद्देश्य का चयन करें (20x और 25x सबसे उपयुक्त हैं) और सुनिश्चित करें कि संघनित्र उज्ज्वल क्षेत्र की स्थिति में है.
    4. हरी हस्तक्षेप फिल्टर डालें (प्रकाश हरे रंग बदल जाता है) और काम की स्थिति में तरल क्रिस्टल विश्लेषण स्लाइडर सेट.
    5. $ 50% के लिए शटर सेट और पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए परिपत्र polarizer समायोजित करें।
  5. कंप्यूटर को पीएलएम परीक्षा के लिए तैयार करें।
    1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर लॉन्च करें.
    2. वीडियो का चयन करें ] वीडियो स्रोत ] शीर्ष मेनू पट्टी में वीडियो मेनू में polarAIDE.
    3. वीडियो पृष्ठ पर जाकर वीडियो लाइव करने के लिए स्विच करें और वीडियो उपकरण पट्टी में आइकन (पूरकचित्र 1) पर मार से धुरी और zona विश्लेषण को सक्रिय करें।
    4. धुरी इमेजिंग के दौरान गतिशील स्केलिंग के लिए प्रदर्शन मोड का चयन करें: (1) लाल (birefringence)/हरी (पृष्ठभूमि) संयुक्त दृश्य, या (2) सफेद (birefringence)/ गतिशील स्कोरिंग मोड का उपयोग जोना पेलुसिडा के ऑटोस्कोरिंग के लिए किया जाता है।

3. अंडा परिपक्वता की परीक्षा

  1. प्रीइन्क्यूबेशन अवधि (3 डिग्री 4 एच) के बाद, आईसीएसआई के मानक समय पर अंडाणु परिपक्वता स्थिति का खुलासा करने वाली पीएलएम परीक्षा करें (एचसीजी ट्रिगर के बाद 39 डिग्री 40 एच)।
  2. सभी ओसाइट्स को पीएलएम डिश पर अलग-अलग बूंदों में स्थानांतरित करें और इसे धुरी इमेजिंग के लिए तैयार उल्टे माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। परीक्षा शुरू करने से पहले कांच के नीचे पकवान से प्लास्टिक के ढक्कन को हटाने के लिए याद रखें।
  3. ध्यान में पहली अंडाणु लाओ. यदि हरे प्रकाश के अंतर्गत कक्ष की खोज करना कठिन है, तो हरे फ़िल्टर को अस्थायी रूप से बाहर निकालदें. सुनिश्चित करें कि विश्लेषण से पहले हरा फ़िल्टर डाला गया है.
  4. पता लगाए गए अंडाणु द्वि-रिफ़रिंगेंस छवि (हरे रंग की पृष्ठभूमि पर लाल/नारंगी) का प्रेक्षण करें क्योंकि यह कंप्यूटर-प्रसंस्कृत है और कंप्यूटर स्क्रीन पर वास्तविक समय में प्रदर्शित होता है। याद रखें कि संकेत नेत्रिका में दिखाई नहीं देता है।
  5. यदि संदेश की घोषणा प्रकाश जोखिम बहुत कम है / उच्च ऊपर चबूतरे, माइक्रोस्कोप के प्रकाश तीव्रता घुंडी का उपयोग कर उपयुक्त तीव्रता के लिए चमक को समायोजित.
  6. एक होल्डिंग और ICSI सुई का उपयोग करने के लिए oocyte बारी तो पंजाब 12 बजे की स्थिति में है और पंजाब के लिए ध्यान केंद्रित.
  7. यदि धुरी birefringence पंजाब के आसपास के क्षेत्र में पहली नजर में दिखाई नहीं देता है, धीरे थोड़ा जोना pellucida छू द्वारा प्रत्येक अक्ष के आसपास oocyte बारी सरणी धुरी फाइबर के साथ polarized प्रकाश के संरेखण सुनिश्चित करने के लिए (पूरक वीडियो ). एमआईआई धुरी के अभाव की घोषणा के रूप में लंबे समय के रूप में अंडाणु कठोर रोटेशन के बावजूद धुरी संकेत दिखाने में विफल रहता है.
  8. मनाया birefringence पैटर्न के आधार पर, निम्नलिखित श्रेणियों में oocytes वर्गीकृत (चित्र 2): (क) द्विध्रुवी बैरल के आकार का MII धुरी के उज्ज्वल संकेत के साथ ocytes स्पष्ट रूप से रेखांकित सीमाओं और भी birefringence के वितरण के साथ ; (बी) अनियमित सीमाओं और संकेत के असमान वितरण के साथ डिस्मॉर्फिक, एक ध्रुवीय और पारदर्शी एमआईआई धुरी के साथ अंडाणु; (C) oocytes के साथ कोई पता लगाने योग्य MII धुरी birefringence में ooplasm;   (डी) एमआईआई धुरी के बजाय एक माइक्रोट्बुलर पुल (पहले पीबी और ओसाइट के बीच एक संयोजी किनारा) दिखाते हुए ऐनाफेज I/टेलोफेज I ओसाइट्स दिखाते हैं।
    नोट: पता लगाने योग्य MII धुरी संकेत के साथ Oocyte (ग्रेड ए या बी) तत्काल ICSI के लिए उपयुक्त हैं.
  9. किसी रिपोर्ट और/या अनुवर्ती छवि विश्लेषण के लिए कोई स्नैपशॉट (F9) या रिकॉर्ड वीडियो लें. ऑपरेटर की निष्क्रियता को कम करने के लिए छवि पैटर्न के प्रलेखन रखें.
  10. एक अगले अंडाणु की स्थिति में ले जाएँ और चरणों को दोहराएँ 3.6 $3.9.

4. ICSI समय को अनुकूलित करना

  1. सभी धुरी सकारात्मक oocytes स्थानांतरण (ग्रेड ए या बी, चरण 3.8) ICSI पकवान में और उन्हें मानक प्रोटोकॉल24,25के अनुसार आईसीएसआई के अधीन .
  2. यदि अंडाणु कोई डिटेक्टेबल एमआईआई धुरी संकेत नहीं दिखाते हैं, तो पीएलएम डिश को सीओ2में रखें - स्वतंत्र इनक्यूबेटर और आईसीएसआई को बाद के समय में स्थानांतरित करें।
  3. PLM पुन: परीक्षा प्रदर्शन [2]3 एच बाद में चरणों का पालन 3.3 "3.9. यदि कुछ oocyte(s) अभी भी एक MII धुरी की कमी है, और अतिरिक्त 1 $2 एच के लिए ICSI देरी.
  4. सभी अंडाणुओं को आईसीएसआई डिश में स्थानांतरित करें और उन्हें मानक प्रोटोकॉल24के अनुसार इंजेक्ट करें। यदि पीएलएम डिश माइक्रोइंजेक्शन सुई के झुकने कोण के साथ संगत है, तो एक उज्ज्वल क्षेत्र मोड में स्विच करने के बाद पीएलएम डिश में तुरंत आईसीएसआई करें।
  5. ICSI पर, भ्रूण की खेती और संस्कृति के लिए तैयार प्लेटों के लिए oocytes हस्तांतरण जब तक blastcyst चरण.

Representative Results

Polarized प्रकाश माइक्रोस्कोपी यह संभव तुरन्त निरीक्षण करने के लिए कि क्या ocyte पूरा परमाणु परिपक्वता और इकट्ठे MII धुरी आईसीएसआई से पहले बनाता है. अपने गैर इनवेसिव चरित्र के कारण, यह सुरक्षित रूप से नैदानिक सेटिंग्स11,12,13,14में निषेचन के लिए मानव अंडे की तत्परता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। स्पिंडल ओसाइट्स में 9 , 15,16,17,18,19, बिना किसी नसियों के ओसाइट्स की तुलना में व्यवहार्य भ्रूणों को जन्म देने की अधिक संभावना है, 20 , 21 , 22 , इसकेअलावा , एक विशिष्ट द्विध्रुवी तर्कु की विशेषता वाले अंडाणुओं में ओसाइट्स कीक्षमता अधिक होती है , जिसमें ओसाइट्स के साथ अपरूपी तर्क9 ,21,22होते हैं . एक साथ लिया, धुरी इमेजिंग सफलतापूर्वक निषेचित किया जा करने के लिए सबसे बड़ी क्षमता के साथ ocytes की पहचान करने के लिए एक उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं, preimplantation विकास से गुजरना और पूर्ण अवधि के गर्भावस्था9,15का समर्थन 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23.

धुरी की रिपोर्ट की घटनाओं बदलता है (44 "97%) अध्ययन कीगईजनसंख्या 9,15,16,17,18,19,20,21की विविधता को दर्शाती है, 22 , 23 , 26 , 27 , 28. सामान्य प्रतिक्रियाकर्ताओं से विवो परिपक्व अंडाणुओं में सामान्य प्रतिक्रिया देने वालों में सामान्य रूप से बीजाणु एमआईआई धुरी को एचसीजी ट्रिगर9,18,27,29के बाद 40 एच पर दिखाया जाता है . हालांकि, धीमी प्रतिक्रिया में, preovulatory follicles से प्राप्त अंडाणुओं का पूल परिपक्वता विलंब9,27से प्रभावित होता है। यहाँ, तर्कु इमेजिंग महत्वपूर्ण मातृक संक्रमण के दौर से गुजर रहे लोगों से एम आई आई चरण में गिरफ्तार ओसाइट्स भेदभाव करने के लिए किया जाना चाहिए (चित्र 3)। हम कूपिक कोशिकाओं को तुरंत पुनर्प्राप्ति पर हटाने की सलाह देते हैं, और आईसीएसआई से कुछ ही समय पहले, विवो परिपक्व अंडाणुओं और देर से परिपक्व oocytes में अंतर करने में सक्षम होने के लिए अलग कुओं में एमआई और एमआईआई ओसाइट्स की ऊष्मायन। यदि ICSI से ठीक पहले निंदा की जाती है, तो ओसाइट्स की ये दो आबादी पंजाब उपस्थिति के आधार पर अभेद्य होती है।

PLM पैटर्न के चरण-विशिष्ट परिवर्तन meiotic परिपक्वता के दौरान धुरी गतिशीलता के ज्ञान के संदर्भ में व्याख्या की जानी चाहिए. अंतरागतिक्रम के दौरान , विभाजन तंत्र व्यापक संरचनात्मक पुनर्गठन से गुजरता है और पीएलएम संकेत क्षणिक रूप से1,9,10,11गायब हो जाता है . इस प्रकार, विकास में देरी से अंडाणु इन विट्रो में पंजाब को बाहर निकालते हैं, एमआईआई धुरी संकेत की अनुपस्थिति जरूरी सेलुलर अशांति को प्रतिबिंबित नहीं कर सकती है लेकिन यह एमआई से एमआईआई चरण तक ओसाइट की प्रगति का संकेत दे सकती है (चित्र 3)। यदि शुक्राणु एक unphysiological समय बिंदु पर इंजेक्शन है, अंडे के विकास की क्षमता समझौता किया है. ICSI स्थगित एक MII धुरी जिसकी उपस्थिति बेहतर नैदानिक परिणाम9,10,11के साथ जुड़ा हुआ है इकट्ठा करने के लिए और अधिक समय के साथ देर से परिपक्व oocytes प्रदान करता है. धीमी/गरीब प्रतिक्रियाकर्ताओं को शामिल नैदानिक अध्ययन में, पीएलएम पुन: परीक्षा से पहले लगभग 60% धुरी-नकारात्मक अंडाणुओं ने धुरी संकेत विकसित किया। विकास की अवस्था और देर से-मटरिंग ऊसाइट्स की समग्र फिटनेस के आधार पर, पंजाब बाहर निकालना के बाद MII धुरी उपस्थिति आम तौर पर लेता है 2 "6 एच (अप्रकाशित अवलोकन). पहले पीएलएम परीक्षा के दौरान माइक्रोट्यूबपुल पुल (एनाफेज/टेलोफेज, ग्रेड डी) का प्रदर्शन करने वाले अंडाणुओं को ओसाइट्स की तुलना में ओसाइट्स विकसित करने के लिए लंबे समय तक की आवश्यकता होती है, जिसमें कोई दिखाई नहीं दिया जाता है (इमर्जिंग धुरी, ग्रेड सी)। अंडे के विकास की अवस्था में आईसीएसआई के समय का व्यक्तिगत समायोजन अंडाणु कोशिका के समय से पहले सक्रियण को रोकता है और इसके परिणामस्वरूप एक बेहतर निषेचन दर और सफल भ्रूण विकास9होता है।

हालांकि देर से-मटरिंग oocytes इन विट्रो में पंजाब extruding आम तौर पर vivo परिपक्व ocytes की तुलना में एक कम विकास क्षमता है, भ्रूण विकास की दर स्वीकार्य है अगर वे देरी ICSI से पहले एक डिटेक्टेबल धुरी इकट्ठा करने के लिए प्रबंधन (ब्लास्टेशन 41.32% की दर)9| इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, यहां तक कि अपरिपक्व oocytes, जो सामान्य रूप से प्रजनन उपचार के लिए अस्वीकार कर दिया जाता है, चिकित्सकीय उपयोग किया जा सकता है, हस्तांतरणीय भ्रूण का उत्पादन, और पूर्ण अवधि के गर्भधारण को जन्म दे. प्रत्येक व्यक्ति ऊसाइट के मातृक अवस्था का मूल्यांकन विशेष रूप से गरीब रोग का पूर्वानुमान चक्र में फायदेमंद है जो अपरिपक्व अंडाणुओं की विट्रो परिपक्वता में बचाव करने के बाद बहुत कम एमआईआई ओसाइट्स और/या की एक छोटी संख्या प्रदान करताहै।

अंडा परिपक्वता मूल्यांकन के अलावा, धुरी इमेजिंग भी पंजाब बायोप्सी से पहले की सिफारिश की है ताकि anaphase I/telophase oocytes में धुरी विनाश से बचने के लिए. प्रायोगिक भ्रूणविज्ञान में, अंडा-उदक्षण और/अथवा तर्कु हस्तांतरण प्रक्रिया13के दौरान मेइओटिक तर्कु का दृश्य प्रयोग किया जाता है।

Figure 1
चित्र 1: मानव अंडाणु परिपक्वता. विवो परिपक्व अंडाणुओं (एमआईआई) में पुनः प्राप्ति के समय पीबी प्रदर्शित होता है। अपरिपक्व अंडाणु (जीवी, एमआई) इन विट्रो में अनाप-शनाप परिपक्वता को सहज रूप से पूरा कर सकते हैं। स्केल बार ] 20 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: PLM-पता लगाया पैटर्न के आधार पर Oocyte वर्गीकरण। धुरी संकेत की उपस्थिति के आधार पर अंडाणु ग्रेड (ए-डी) के प्रतिनिधि उदाहरण। पीएलएम-पता लगाएगए पैटर्न: (ए ) द्विध्रुवी धुरी के प्रमुख संकेत, (बी) पारदर्शी एक ध्रुवीय एमआईआई धुरी धुरी, (सी) कोई पता लगाने योग्य धुरी, और (डी) microtubule पुल. स्केल बार ] 20 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: अंडाणु परिपक्वता में MI से MI संक्रमण के चरण. उज्ज्वल क्षेत्र (शीर्ष पंक्ति) में अंडाणुओं की उपस्थिति, गुणसूत्रों (सियान) और माइक्रोट्युब्युल्स (मजंटा) (मध्य पंक्ति) के फ्लोरोसेंट सिग्नल के साथ संयुक्त, और ध्रुवित प्रकाश (नीचे पंक्ति) में दिखाया गया है। प्रत्येक अंडाणु पहले पीएलएम की जांच की गई थी और तुरंत तय की गई थी। फिक्स्ड अंडाणुओं को होचस्ट (डीएनए) और एंटी-जेड-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी (माइक्रोट्युबल्स) के साथ लेबल किया गया था। पीला तीर पंजाब की उपस्थिति को इंगित करता है और सफेद तीर birefringent microtubules की स्थिति पर प्रकाश डाला गया. स्केल बार $ 20 डिग्री मी. यह आंकड़ा Holubcov से संशोधित किया गया है एट अल., JARG 20199. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: ध्रुवित प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाए गए द्वि-प्रवर्तक पैटर्न के साथ गुणसूत्र-माइक्रोट्यूल संगठन का सहसंबंध। गुणसूत्रों (सायन) और माइक्रोट्युब्युल्स (मजेंटा) (शीर्ष पंक्ति) के लिए एक फ्लोरोसेंट संकेत के साथ संयुक्त उज्ज्वल क्षेत्र में अंडाणुओं की उपस्थिति, और polarized प्रकाश (नीचे पंक्ति) में दिखाया गया है। प्रत्येक अंडाणु पीएलएम की जांच के तुरंत बाद तय किया गया था। डीएनए (हॉचस्ट) और माइक्रोट्युबुल (जेड-ट्यूबुलिन) दागे गए थे। (ए -सी) पीएलएम-डिटेक्टेबल धुरी के साथ ओसाइट्स अभी तक misaligned गुणसूत्रों (, बी) या ढीला ध्यान केंद्रित धुरी डंडे (सी); (डी-एफ) असामान्य ओसाइट्स बिना पीएलएम-डिटेक्टेबल एमआईआई धुरी दिखा अविकसित (डी), अध्रुवीय () या कोई धुरी (एफ) . सफेद तीर birefringent microtubules की स्थिति पर प्रकाश डाला गया है, और तारांकन (*) decondensed क्रोमैटिन की स्थिति को इंगित करता है. स्केल बार ] 20 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: मानव अंडाणुओं में बिरिफ़रिंगेंस संरचनाएं। के प्रतिनिधि उदाहरण (ए -डी) मानव ocytes में PLM द्वारा पता लगाया birefringent संरचनाओं. [P ] zona pellucida; पीएम - प्लाज्मा झिल्ली (ओलेमा); आरबी - रिफ्रैकटाइल निकायों, धानी। सफेद तीर, परिपक्वता के विभिन्न चरणों में meiotic धुरी. () एमआईआई धुरी ध्रुवीय शरीर (पीबी) के साथ misalignment. (च) प्लाज्मा झिल्ली से स्पाइनल टुकड़ी। स्केल बार ] 20 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का डेस्कटॉप लेआउट. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो: PLM परीक्षा प्रक्रिया. धुरी (तीर) की उपस्थिति को बाहर करने के लिए अंडाणु की रोटेशन की आवश्यकता है। स्केल बार ] 20 डिग्री मी. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

मानव अंडाणुओं में एसेंटरोसोमल मीयोटिक धुरी अत्यधिक गतिशील और एक नाजुक संरचना1है . उपऑप्टिमल परिस्थितियों के अंतर्गत माइक्रोट्युबल रेशों को शीघ्रतासे विबहुलक बना दिया जाता है और मीओटिक तर्कु 30 ,31,32,33को अलग कर देता है . इसलिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि अंडाणु संस्कृति और माइक्रोमैनोमैनिट की स्थिति, अर्थात् तापमान और पीएच इष्टतम श्रेणी में हैं। तर्कु व्यवधान के जोखिम को कम करने के लिए, अंडाणुओं को तापमान-नियंत्रित वातावरण में रखा जाना चाहिए जिसमें ओसाइट मीडिया में 37 - 0.5 डिग्री सेल्सियस बनाए रखा जाना चाहिए। एक गर्म चरण से सुसज्जित माइक्रोस्कोप और माइक्रोइंजेक्शन सेटअप का उपयोग सख्ती से आवश्यक है। पी एच fluctulations से बचने के लिए इनक्यूबेटर के बाहर oocytes के साथ सभी हेरफेर HEPES/MOPS बफर मीडिया में किया जाना चाहिए। परिवेश की स्थिति में अत्यधिक अंडाणु सौंपने के संभावित प्रतिकूल प्रभावों से बचने के लिए, पीएलएम परीक्षा का कुल समय 10 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए। अंडाणुओं को कांच के नीचे के पकवान पर प्लास्टिक के ढक्कन के साथ विश्लेषण करना पड़ता है क्योंकि बीम पथ में मानक प्लास्टिक की स्थिति छवि विश्लेषण को बाधित करती है। क्योंकि प्लास्टिक और कांच के नीचे व्यंजन अलग थर्मल विशेषताओं है, तापमान परीक्षा डिश में मध्यम से निपटने की बूंदों में सीधे जाँच की जानी चाहिए.

प्रयोगशाला शर्तों के अलावा, प्रक्रियात्मक मतभेद और ऑपरेटर के micromanipulation कौशल PLM परीक्षा सटीकता पर एक प्रभाव हो सकता है. केवल अत्यधिक इकट्ठे द्विध्रुवी धुरी noninvasively कल्पना की जा सकती है. प्रेक्षित संकेत धुरी के संरचनात्मक संगठन की डिग्री के समानुपाती होता है। नवजात, ध्रुवीय, ढीला या अव्यवस्थित तर्कु केवल धुंधली द्वि-परिवर्तन या कोई भी प्रदर्शित नहीं होती है (चित्र3 और चित्र4)। इसके अलावा, माइक्रोट्युबल सरणियों के साथ ध्रुवित प्रकाश का अपूर्ण संरेखण सुविकसित द्विध्रुवी तर्कु की वास्तविक उपस्थिति के बावजूद केवल एक पारदर्शी और अपरिभाषित द्वि-प्रवर्तकता का उत्पादन करता है (चित्र 4)। जब तक ठीक से उन्मुख, धुरी संकेत आसानी से याद किया जा सकता है और oocyte परिपक्वता misdiagnosed (पूरक वीडियो). इष्टतम धुरी इमेजिंग के लिए, अंडाणु को प्रत्येक अक्ष के चारों ओर ठीक से चालू किया जाना चाहिए। चूंकि आईपियों में द्वि-प्रवर्तन दिखाई नहीं देता है, इसलिए ऑपरेटर को अंडाणु के घूर्णन करते समय कंप्यूटर स्क्रीन देखना होता है। माइक्रोमैनुएशन और इन विट्रो परिपक्व अंडाणुओं में अधिशेष में धुरी इमेजिंग के प्रशिक्षण के साथ पिछला अनुभव नैदानिक आवेदन करने के लिए स्विच करने से पहले वांछनीय है।

धुरी के अलावा, अंडाणु, ओलेमा, जोना पेलुसिडा की भीतरी परत और कुछ कोशिकाद्रव्यी संरचनाओं (उदा., रिफ्रैकटाइल निकायों, धानी) के आसपास की कम्युलस कोशिकाएं द्वि-परिवर्तन प्रदर्शित करती हैं (चित्र 5क-डी)। जब तक अच्छी तरह से इमेजिंग से पहले अंडाणु से हटा दिया, कसकर संलग्न कूपिक कोशिकाओं पृष्ठभूमि शोर का उत्पादन और meiotic धुरी का पता लगाने समझौता. धुरी के लिए एक बड़े रिफ्रैकटाइल शरीर की गलती न करें। कोशिकाद्रव्य में रहने वाले कई कोशिकाद्रव्यी समावेशन उच्च चमक प्रदर्शित करते हैं जो अंधेरे पृष्ठभूमि के साथ तेजी से विपरीत होता है। Meiotic धुरी, दूसरी ओर, केवल मध्यम संकेत प्रदर्शन, धुंधली सीमाओं और आम तौर पर नीचे या पहले पंजाब के बगल में oolema को देता है. कभी कभी, PLM परीक्षा अपनी मानक स्थिति से एक सकल धुरी विचलन का पता चलता है (चित्र 5E, एफ). यदि विभाजन तंत्र और पंजाब के बीच एक बड़ा कुसंरेखन है, तो पीएलएम माइक्रोइंजेक्शन के दौरान धुरी चोट के जोखिम से बचने के लिए अंडाणु को उन्मुख करने में मदद करता है। अंडाणु के भीतर धुरी की सापेक्ष स्थिति परिणामी भ्रूणों की विकासात्मकक्षमता को प्रभावित करती प्रतीत नहीं होती. हालांकि, जब धुरी को ओलेमा से प्रतिस्पर्धा होती है, तो निषेचन असामान्यताएं होती हैं। दिलचस्प बात यह है कि कुछ खराब गुणवत्ता वाले ऊसाइटों को माइक्रोट्युबल न्यूक्लिएशन शुरू करने के बजाय पीबी एक्सट्रूज़न के तुरंत बाद क्रोमैटिन विसंघन से गुजरना पड़ता है (चित्र 4 एफ)। ओसाइट परिपक्वता के केवल मार्कर के रूप में पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी और पंजाब का उपयोग करना, ऐसे उप-सक्षम अंडाणुओं को निषेचित माना जाएगा। इस प्रकार, नियमित रूपात्मक मूल्यांकन के शीर्ष पर, धुरी इमेजिंग अंडे की परिपक्वता के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी जोड़ता है और इसकी गुणवत्ता के एक अप्रत्यक्ष मार्कर के रूप में सेवा कर सकते हैं।

तर्कुदार एमआईआई ओसाइट्स की घटना अध्ययन जनसंख्या (उदा., आनुवंशिक पृष्ठभूमि, चिकित्सा स्थिति, मातृ आयु) की विशेषताओं से प्रभावित होने की संभावना है। इसके अतिरिक्त, सहगण के भीतर विकास की देरी वाले अंडाणुओं का अनुपात पता लगाए गए तर्कु-नकारात्मक अंडाणुओं की वास्तविक संख्या9,27को प्रभावित करेगा। Meiotic धुरी दृश्य यह स्पष्ट रूप से MII चरण में गिरफ्तार निषेचनीय ocytes की पहचान करने के लिए संभव बनाता है. इसके अलावा, बाद के समय में दूसरी जांच से यह पता चल सकता है कि धुरी-नकारात्मक अंडाणु असामान्य है या हाल ही में एमआई/एमआईआई संक्रमण9,10,11के माध्यम से प्रगति की है। जब आईसीएसआई से पहले एक धुरी विकसित करने की अनुमति दी जाती है, यहां तक कि अपरिपक्व अंडाणु, जो नियमित रूप से खारिज कर दिए जाते हैं, व्यवहार्य भ्रूण9का उत्पादन कर सकते हैं। निषेचन के लिए उपलब्ध बहुत कुछ oocytes के साथ चक्र में, ठीक से समय पर ICSI oocytes extruding पंजाब एक बचाव रणनीति और चक्र रद्द करने के लिए विकल्प के रूप में सेवा कर सकते हैं.

फिर भी, preincubation समय का विस्तार सभी oocytes के लिए सामान्यीकृत नहीं किया जाना चाहिए. सामान्य प्रतिक्रिया देने वालों से विवो परिपक्व अंडाणु ओंकारमें आम तौर पर एमआईआई धुरी9,20,21,27प्रदर्शित होती है . यहाँ, सफल धुरी इमेजिंग की संभावना इन विट्रो उम्र बढ़ने35में पोस्ट-ओवुलेटरी का एक परिणाम के रूप में समय के साथ कम हो जाती है। यदि संभव हो तो आईसीएसआई को पुनर्प्राप्ति के दिन किया जाना चाहिए और यह 9 घंटे (45 घंटे बाद एचसीजी) से अधिक नहीं होना चाहिए, परिणामस्वरूप भ्रूण की गुणवत्ता में गिरावट के साथ संबद्ध अवधि36,37. अलग द्विध्रुवी धुरी प्रदर्शित Oocytes आगे देरी के बिना आईसीएसआई के अधीन किया जाना चाहिए. संक्षेप में, आईसीएसआई समय के व्यक्तिगत अनुकूलन समय से पहले शुक्राणु इंजेक्शन के किसी भी जोखिम को बाहर करने के लिए गरीब रोग रोगियों में सार्थक है। हालांकि, यह अनावश्यक है, भी समय लेने वाली और सभी आईवीएफ चक्र में प्रदर्शन किया जा करने के लिए कठिन.

पीएलएम विश्लेषण से पता चलता है कि क्या अंडाणु एमआईआई चरण तक पहुंच गया। हालांकि, meiotic धुरी के noninvasive दृश्य गुणसूत्र संगठन के बारे में कोई जानकारी प्रदान करता है. वहाँ गंभीर गुणसूत्र misalignment हो सकता है और / या मातृ उम्र से संबंधित क्रोमेटिड एक द्विध्रुवी धुरी की विशेषता oocytes में विभाजित (चित्र 5) . विभिन्न अन्य कारकों प्रजनन सफलता पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है (जैसे, शुक्राणु कारक, mitochondria, भ्रूण जीनोम सक्रियण, अनियमित दरार, epigenetics, एंडोमेट्रियम, मातृ प्रतिरक्षा). इसलिए, से प्रति MII धुरी का पता लगाने, आईवीएफ प्रक्रिया के एक सकारात्मक नैदानिक परिणाम की गारंटी नहीं है.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम Reprofit इंटरनेशनल के भ्रूण विज्ञान प्रयोगशाला धन्यवाद देना चाहते हैं. हम यहां प्रस्तुत इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग डेटा प्राप्त करने के साथ उनके समर्थन के लिए MEYS CR (LM2015062 चेक-बायोइमेजिंग) द्वारा समर्थित CEITEC की मुख्य सुविधा CELLIM को भी स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin Irvine Scientific 90164 bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture
Denuding micropipette 150 µm Microtech IVF 005-150C
Denuding micropipette 180 µm Microtech IVF 005-180B suitable for oocyte transfer between dishes
Denuding micropipette 200 µm Microtech IVF 005-250-A suitable for oocyte transfer between dishes
FluoroDish World Precision Instruments FD 5040-100 glass-bottom dish
(alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells)
Holding micropipette Microtech 001-120-30 sterile glass microneedles
Hyaluronidase solution Irvine Scientific 90101 for oocyte denudation
ICSI micropipette Microtech 002-5-30 sterile glass microneedles
Micro Droplet Culture Dish Vitrolife 16003 12-well plate for embryo culture
Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin Irvine Scientific 90163 handling medium, MOPS/HEPES buffered
Nikon Eclipse TE 2000-U Nikon inverted microscope with heated stage
Nunc IVF Petri Dish, 60 mm Thermo Fisher Scientific 150270 plastic ICSI dish
Nunc non-treated 4-well IVF dish Thermo Fisher Scientific 179830 4-well plate for embryo culture
OCTAX polarAide MTG integrated PLM system
Oil for embryo culture Irvine Scientific 9305 oil for overlay
Polyvinylpyrrolidone Irvine Scientific 90123 for sperm immobilization prior to ICSI

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References

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मानव अंडा परिपक्वता आकलन और इसके नैदानिक आवेदन
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Holubcová, Z., Kyjovská, D., Martonová, M., Páralová, D., Klenková, T., Kloudová, S. Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application. J. Vis. Exp. (150), e60058, doi:10.3791/60058 (2019).More

Holubcová, Z., Kyjovská, D., Martonová, M., Páralová, D., Klenková, T., Kloudová, S. Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application. J. Vis. Exp. (150), e60058, doi:10.3791/60058 (2019).

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