Summary
במחקר זה, אנו מתארים הליך מפורט של פיברוזיס בתיווך מעיים של TNBS, אשר מציג הפתופסולוגיה המקבילה ל-פיברוזיס של קרוהן. אנו גם דנים גישה זו לאור של rapamycin הקלה השפעות מעכבות על סיסטיק מעיים.
Abstract
מחקרים משמעותיים בוצעו כדי להבין את הניהול האפקטיבי של סיסטיק מעיים. עם זאת, חוסר הידע הטוב ביותר של סיסטיק פיברוזיס הפריע להתפתחות של תרופה מונעת. בעיקר, מציאת המודל החי המתאים הוא מאתגר להבין את המנגנון של קרוהן הקשורים פיברוזיס מעיים פתולוגיה. כאן, אימצנו שיטה יעילה שבה tnbs חשיפה כימית לעכברים מפי מייצרת כיבית עמוק באופן משמעותי ודלקת כרונית, ואת העכברים אז באופן כרוני לפתח פיברוזיס במעיים. גם, אנו מתארים טכניקה שבה הזרקה rapamycin מראה השפעות מעכבות על TNBS-תיווך פיברוזיס במודל העכבר. כדי להעריך את המנגנון הבסיסי של סיסטיק, אנחנו באופן שיטתי לדון הליך לטיהור Cx3Cr1 + תאים מתוך לאמה קיננה של מטופלים ועכברים שליטה של TNBS. פרוטוקול זה מפורט יסייע לחוקרים החוקרים את המנגנון של פיברוזיס ולסלול את הנתיב כדי למצוא המצאה טיפולית טובה יותר עבור פיברוזיס של המעי הקשורות של קרוהן.
Introduction
דיסרגולציה של הומאוסטזיס החיסונית בבטן מובילה לדלקת פתוגניים והיה ידוע לגרום מחלות מעי דלקתיות (ibd)1,2. מעיים פיברוזיס היא תוצאה כרונית של מחלות מעי דלקתיות (IBDs), כגון מחלת קרוהן (CD)3. הפתופסולוגיה בלתי הפיכה של תקליטור כולל מעיים או היצרות של פיברוזיס, אשר מגביל את אפשרויות הטיפול, עם תרופות לא זמין כרגע, הטיפול היחיד הוא ניתוח. בסופו של דבר, ההתפתחות של טיפולים יעילים לדלקת הבלתי הולמת מונה נחוצה הרבה כדי ללמוד את מנגנון התקליטור, וזה יוביל אותנו צעד קרוב יותר לזה.
מגוון של מודלים של עכבר גנטי זמינים כדי ללמוד ibd כולל IL10 KO, samp/yit והמאמצת CD45+RB העברת תאים גבוה לתוך עכברים scid4,5,6. כאן, אנו מראים את ההליך עבור TNBS בתיווך פיברוזיס במודל העכבר של תקליטור, אשר דומה הפתולוגיה של האדם פיברוזיס של קרוהן. למודל המושרה של TNBS יש יתרונות מסוימים. מודל זה הוא מבחינה טכנית פשוטה; התפרצות המחלה היא מהירה, זולה, והוא יכול לשמש באופן נרחב בעלי חיים שונים (למשל, עכבר, עכברוש ושפן גינאה7). שיתוף המינהל של אתנול ו-tnbs (2, 4, 6-trinitrobenzene נזן חומצה sulfonic) בפתאומיות נזקים מחסום המעי וחושף חלבון רקמת המעי כדי tnbs ולעורר תגובות חיסוני משמעותי8,9. חשיפה חוזרת של TNBS מובילה תהליך תיקון מוגזם תגובה להגיב לדלקת ופציעה, ומפתחת תגובה פיברוטית בבטן. כך, TNBS-המושרה פיברוזיס המודל משמש להיות מודל משכנע מאוד ללמוד פיברוזיס של המעי הקשורים סיסטיק.
יתר על כן, phagocytes מונפנקייה הם התאים העיקריים כי בוררויות את התגובה החיסונית מולדת הפתוגנזה ופציעה בבטן10,11,12,13. כדי להבהיר את המנגנון הסלולר כדי לקבוע את התפקיד של Cx3Cr1+ מונגוציטים phagocytes ב פיברוזיס המודל של tnbs, אנו מראים את ההליך של טיהור phagocytes מונמונומנט. ניתוח של Cx3Cr1+ תאים הוא צעד חיוני כדי להעריך את סמנים דלקתיים ולקבוע את המנגנון המקביל עבור סיסטיק מעיים. באופן קולקטיבי, זה הליך מפורט עבור סיסטיק בBS פיברוזיס יהיה מועיל להסביר את המנגנונים הסלולריים של סיסטיק מעיים.
Protocol
עבור כתב היד הזה, כל הדגימות האנושיות הושגו על פי הפרוטוקול המאושר על ידי מכון הסקירה של המכון (IRB) ועל ידי הוועדה לחקר האדם במכללת אולבני בקולג '. כל המחקרים הכרוכים בבעלי חיים עקבו בקפדנות בהתאם לפרוטוקול המאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באולבני קולג ' רפואי, כמו גם המכונים הלאומיים למדריך בריאות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים .
1. איסוף דגימות המעי האנושי
- לאסוף דגימות של רקמות האדם על פי פרוטוקולי ועדת המחקר של המוסד.
- רכישת רקמת המעיים (מעי הגס) של חולה תקליטור שאובחנו עם פיברוזיס ודגימות בקרה מחולים עם היסטוריה של IBDs.
- השתמש בחלק מרקמת המעיים עבור אימונוהיסטולוגיה, חלק אחר של הרקמה לניתוח mrna, ואת החלק הסופי של ביטוי חלבון של הגנים פיברוטיק ו ציטוקינים/סמנים.
- עבור ניתוח אימונוהיסטולוגיה, תחילה לתקן את דגימת רקמת האדם ב 4% פאראפורמלדהיד לפחות 48 h ולאחר מכן להעביר אותו לתוך צינור המכיל 70% אתנול עבור לפחות 16 h. השתמש ברקמה קבועה זו לביצוע בלוק פרפין וחותכים 5 יקרומטר רקמה עבה סעיפים באמצעות רקמה-מיקרוטומה.
- באמצעות מברשת, הפיצו בעדינות את כל מקטע החיתוך בשקופית זכוכית לצביעת.
- מקטע רקמת כתם שקופית עם כתם trichrome לזהות התצהיר קולגן, עם αSMA כתם כדי לזהות מיופיברופיצוצים (ראה סעיף 3 למידע מפורט על trichrome ו αSMA כתמי). בחנו את החלקים המוכתמים תחת מיקרוסקופ קל.
- לעבד חלק אחר של דגימת רקמת האדם המתקבל כדי להפוך את החלבון לαSMA לזהות באמצעות הכתם המערבי (ראה סעיף 7 למידע מפורט על ניתוח כתמי מערביות).
- להשיג RNA מהחלק האחרון של דגימת רקמה אנושית באמצעות מגיב החילוץ (טבלת חומרים) ולהמיר mrna ל-cdna באמצעות RT-PCR.
- ניתוח גנים פיברוטיק וציטוקין על ידי qPCR (ראה סעיף 6 למידע מפורט על הכנה mRNA).
2. אינדוקציה של פיברוזיס וטיפול rapamycin בעכברים
- ביצוע מחקר בעלי חיים על פי פרוטוקולי מחקר בעלי חיים שאושרו על ידי המוסד.
- להתגלח עכברים למבוגרים סביב האזור הצוואר כדי לקדם את הרגישות כדי TNBS באמצעות חשיפה לעורי. להשרות TNBS בספוגית כותנה ולאחר מכן להחיל TNBS לאזור מגולח של צוואר העכבר.
הערה: טרום רגישות היא צעד חשוב מאוד מאז היא משפרת את תגובת רגישות היתר מתעכב ליזום את הדלקת TNBS-בתיווך. - שמונה ימים פוסט הרגישות מראש, לגרום קוליטיס על ידי מינהל פנים-רקטלי פעם בשבוע במשך שישה שבועות. החלת ארבעה מ"ג של TNBS (ב 25% אתנול) באמצעות חוקן 100 μL באמצעות מזרק 1 mL מצורף 3.5 פוליאוריטן הצרפתי ולתת עכברים בקרה 100 μL של 25% אתנול בלבד.
- עכברים מורדם עם פנטוברביטל (25 מ"ג/ק"ג בתוך הצפק) או לחשוף אותם 2.5% isof ane יחד עם 1 L/min של חמצן במהלך הממשל TNBS. אשר התכווצות בהונות בעדינות ומחפש העדר רפלקס.
- השתמש במשחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בעוד עכברים נמצאים תחת הרדמה.
- הכנס rapamycin ב 2 מ"ג/ק"ג/יום או רכב (5% רצף-20 ו 4% אתנול) כל יום בשבוע עבור 3-6 שבועות, תוך הצפק, הן בקרה והן עכברים מטופלים TNBS.
- השתמש 6-שבוע המעי העכברים מטופלים המעיים עבור ניתוח החילוץ בחני כולל היסטולוגיה, הזרמת cy, לחסום המערבי ו-RNA חילוץ. כדי לקצור איברים, להרוג עכברים באמצעות שאיפת CO2 ולאשר המתת חסד עם פריקה צוואר הרחם.
- כדי לקצור איברים, להרוג עכברים באמצעות שאיפת CO2 ולאשר המתת חסד עם פריקה צוואר הרחם. לאחר המתת חסד, longitudinally לפתוח את העכבר על הצד הגחוני שלו באמצעות מספריים כיתה כיתה ומלקחיים. הסר את המעי הגס כולו מן הרקטום לאזור אגן כסל הטרמינל. במהירות להעביר את המעי הגס לקרח קר 1x HBSS ולשטוף את המעי הגס באמצעות אותו מאגר.
- מדוד והשווה את אורכי הנקודתיים של הפקד ואת העכברים שטופלו TNBS. בצע פעולה זו במהירות האפשרית כדי להימנע מייבוש של נקודתיים כדי למנוע מקרי מוות של תאים.
- חותכים את המעי הגס לחתיכות קטנות ולשמור ב-80 ° צ' לאחסון למטרות עתידיות (רנ א/ניתוח כתמי מערבי). השתמש בחלק אחר של הנקודתיים לניתוח של FACS.
- הקפד לגזור ולאסוף דגימות של רקמת חוקן מאזורים דומים של המעי הגס של שני בקרה ו-TNBS מטופלים בעלי חיים.
הערה: התמותה של 10%-20% צפויה עם החיסון למרות הניסיון, שיעור התמותה יכול להיות מופחת באופן משמעותי.
3. אימונופתולוגיה של הערכת פיברוזיס של המעיים
- תקן רקמות אדם ו/או עכברים ב 4% פאראפורמלדהיד עבור 48 h, ולאחר מכן העבר 70% אתנול עבור 16 h.
הערה: פאראפורמלדהיד הוא כימיקל נוירוטוקסיאז להימנע משאיפת; השתמש במסיכת פנים בעת השימוש בו. - פרפין להטביע את רקמות המעי הגס קבוע, פרוסה 5 יקרומטר עובי, וישירות לשים את הרקמות על שקופיות זכוכית עבור היסטולוגיה.
- לעשות H & E ו Trichrome מכתים כחול על פי הוראות היצרן כדי לזהות קולגן.
- בקצרה, מקטעים ראשונים מחלקים לפי מיזוג השקופית המכילה מקטעים בשני תאי קסילן עבור 5 דקות בכל תא.
- לשטוף שקופיות עם 100% אלכוהול עבור 1 דקות; חזור על שלב זה שלוש פעמים. לשטוף שוב עם מי ברז עבור 1 דקות.
- לאחר מכן, לטבול שקופיות בפתרון של Bouin מחומם ב 56 ° c עבור 60 min. הפתרון של Bouin הוא צהוב במראה; לשטוף לאחר נטילת השקופיות מהפתרון של Bouin מים ברז עבור 3 דקות או עד שקופיות הפך חסר צבע.
- הישאב שקופיות בתמיסה של מאייר המטאוקסילין במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר.
- שקופיות כתם על ידי המאכשר בכתם Trichrome עבור 5-8 דקות. מיד, לשטוף שקופיות מים זורמים עבור 5-10 s כדי להסיר את הכתם העודף Trichrome.
- מייבשים שקופיות עם 100% אלכוהול במשך 1 דקות. חזור על הליך זה שלוש פעמים.
- נקה שקופיות עם קסילן עבור 1 דקות וחזור על השלב 3x.
- טעינת שקופיות עם מדיההרכבה (טבלת חומרים).
- בזהירות להחזיק שמיכות בקצה אחד עם מלקחיים ולתת לו לכסות את כל הקטע בלי שום בועות. אם יש כמה בועות, להסיר במהירות בועות על ידי הקשה coverslip.
- השתמש בצביעת החיסוני כדי לזהות αSMA.
- חסום מקטעי נקודתיים במאגר חסימת (0.2% טריטון X-100 ו-5% סרום עז רגיל ב-1x PBS) עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
- דגירה עם 100 μL של נוגדן ראשוני מדולל עבור αSMA (טבלת חומרים) בפתרון השקופית (0.2% טריטון X-100 ו 3% סרום עז רגיל ב-1 X PBS; Anti-αSMA 1:200) ב 4 ° c לילה.
- שטוף את הסעיפים שלוש פעמים באמצעות 1x PBS.
- השתמש עז נגד עכבר IgG (H + L) מצומדת עם אלקסה Fluor 488 (טבלת חומרים) כנוגדן משני עבור 2 H בטמפרטורת החדר.
- שטוף את הסעיפים שלוש פעמים באמצעות 1x PBS.
- השתמש ב-DAPI כדי להכתים את הגרעין במשך 5 דקות.
- שטוף את הסעיפים שלוש פעמים באמצעות 1x PBS.
- הר מגלשות עם מדיה הרכבה פלורסנט (טבלת חומרים), וחותם עם שמיכות באמצעות לק ציפורניים.
- לרכוש תמונות באמצעות lsm 880 מיקרוסקופ קונפוקלית וקד ותמונות תהליך באמצעות תוכנת מיקרוסקופ.
- מכמת תמונות על-ידי נקיטת ממוצע של אזורים נבחרים מרובים באותו מקטע עם ImageJ.
4. בידוד של מעיים לאמא וטיהור של Cx3Cr1+ מונפציטים
- Longitudinally לפתוח את המעי הגס בקרח קר האנק מאוזן תמיסת מלח (HBSS; רשימת חומרים) ולשטוף את המעי הגס עם אותו מאגר.
- חותכים כ 5 ס מ פיסות קטנות של רקמות המעי הגס באמצעות מספריים סטרילי ב HBSS.
- העברת חתיכות קטנות רקמת המעי הגס בצינור 50 mL מכיל 10 מ ל של מאגר טרום העיכול (1x HBSS עם 5% FBS, 5 מ"מ EDTA ו 1 מ"מ DTT), ולנער עבור 20 דקות ב 100 rpm בחממה 37 ° c11.
הערה: דגירה של רקמת חוקן ב 37 מעלות צלזיוס ב 100 סל ד לרעוד מצב מאפשר העיכול יעיל קולגן רקמות ותשואה גבוהה של תאים קיימא. - להיפטר האפיתל המעי הגס על ידי עובר דרך מסננת תא 40 יקרומטר.
- לאסוף את הרקמה הנותרת מן המסננת ולעכל אותם במאגר העיכול המכיל הקולגן סוג IV ו DNase I (הטבלה של חומרים) ב 1X HBSS עם 5% fbs עבור 20 דקות ב 37 ° c ב 100 rpm.
- מערבולת הרקמות מתעכל עבור כ 20 s ולעבור דרך מסננת תא 40 יקרומטר כדי להשיג לאמנה שברים.
- צנטריפוגה את בקיננה שברים כדי להפיל את התאים בשעה 700 x g ב 4 ° c
- כדי שלא לכלול תאים מתים מתוך השימוש בצפיפות הצבע (טבלת חומרים).
הערה: מדיית צפיפות הצבע הנמצאת בשימוש כאן (טבלת חומרים) עלולה לגרום לאבדן תאים מוננורורים; עם זאת, זה מאוד מסיר תאים מתים מן ההכנה, אשר הכולל מגביר את הטוהר.- להפוך 100 mL כל אחד 30% ו 70% מעבר בצפיפות פתרונות מדיה. מחדש את התאים המתקבלים 10 מ ל של 30% הפתרון ואת שכבת הכיסוי על גבי 5 מ ל של 70% הפתרון בתוך שפופרת 15 mL.
- צנטריפוגה את מעבר הצבע במצב ללא בלם ב 1,000 x g וטמפרטורת החדר. לאסוף את שלב הטבעת הלבנה המכילה לימפוציטים המ, אשר יהיה בין 30% ו 70% שכבות הדרגתי.
- לשטוף את התאים שהושגו על ידי השעיית מחדש ב-HBSS קר קרח ו צנטריפוגה ב 500 x g, 20 ° c, עבור 10 דקות. re-להשעות תאים ב-facs (מיון תאים פלואורסצנטית המופעל) מאגר (PBS, pH 7.4, עם 1% bsa ו 2 מ"מ edta).
- לטהר את phagocytes מוננוציטים מן התאים שנאספו טיהור באמצעות חרוזים מגנטיים ו/או FACS מיון.
- טיהור מגנטי
- לפני הצביעת עם נוגדנים, לחסום הראשון תא משטח של לאמה קינא תאים על ידי דגירה עם אנטי עכבר CD16/CD32 חוסם Fc עבור 15 דקות על הקרח.
- התאים דגירה עם anti-Cx3Cr1-PE (phycoerythrin) נוגדנים יחד עם מיקרוחרוזי אנטי-PE (טבלת חומרים) עבור 30 דקות על הקרח, כדי ללכוד את התאים המאוגדים. שטוף תאים עם מאגר FACS.
- להעביר את התאים המאוגדים נוגדן/חרוז באמצעות עמודה מגנטית המופעל תא מיון בשדה מגנטי כדי להסיר תאים לא מאוגדים. שטפו שלוש פעמים עם מאגר ה-FACS. הסר את העמודה מהשדה המגנטי ולאחר מכן לחץ על הבוכנה בעמודה כדי להניב תאים מאוגדים לחרוז.
- מיון FACS
הערה: מיון FACS ניתן להשתמש במקום טיהור מגנטי. למרות טיהור מגנטי הוא שיטה קלה וחסכונית, הוא מוגבל רק לטיהור תאים בודדים, לא עבור אוכלוסיות משנה של תאים. לכן, כדי לבודד אוכלוסיות משנה של תאים, שיטת המיון של FACS היא שיטה יעילה למיון תאים בודדים וכן אוכלוסיות משנה של תאים.- בלוק לאמינה תאים בעלי מניעת עכבר CD16/CD32 Fc (טבלת חומרים).
- כתם תאים על ידי דגירה עם anti-CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C, ו MHCII נוגדנים.
- מיון באמצעות cytometer זרימה של זרימת FACS, לעבור CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C- תאים כדי לטהר את האוכלוסיה Cx3Cr1 (P3 + P4).
- טיהור מגנטי
- Lyse תאים מיון עבור סה כ הכנה RNA ולזהות ציטוקינים סמנים פיברוטיק (ראה סעיף 6 עבור RNA ו cdna הכנה).
- ניתוח mrna ביטוי של סמנים פיברוטיק וניתוח ציטוקינים דלקתית מבודדים תא בודד השעיות טיהור מגנטי.
- לניתוח FACS, לחסום תאים עם אנטי עכבר CD16/CD32 Fc חוסם (טבלת חומרים) לפני הצביעת עם נוגדנים נגד פני השטח או סמנים תאיים.
5. ניתוח הציטוקימטריה לזרימה
- כתמים וניתוח משטח התא
- Resuspend 5-10 × 105 מבודד לאמינה בתאי תאים 50 mL של מאגר facs (1% bsa, 2 מ"מ edta ב PBS, pH 7.4).
- התאים דגירה עם אנטי עכבר CD16/CD32 (טבלה של חומרים) ב 1:50 דילול לחסום קולטני Fc על קרח עבור 10 דקות.
- לשטוף את התאים עם 500 μL של מאגר FACS קר קרח להסיר anti-CD16/CD32 לפני כתמים תא פני השטח.
- משטח הכתם מעיים תא יחיד השעיות (106 תאים/50 mL) עם נוגדן המסומנת באמצעות פלורסנט ב 1:100 דילול על הקרח במשך 30 דקות כדי להעריך את המעי הגס לאמינה קינא.
- שטוף התווית תאים עם 500 μL של מאגר FACS קר קרח פעמיים כדי להסיר נוגדנים לא מאוגדים.
- לנתח את התאים המונחדרורים על ידי הזרימה cy, לנסות. שער לשידור חי, לאחר מכן עבור FSC+אס. אס. סי+ ואחריו CD11b+ Cx3Cr1+, ולאחר מכן לנתח סמנים אחרים מקרופאג הפעלה כולל mhcii, CD80, CD86 ו-CD40.
- ציטוקין כתמים וניתוח
- עבור הכתמים התאיים, לתקן ולחלחל את התאים המוכתמת על פני השטח באמצעות קיבוע הפתרון (טבלת חומרים); נא בצע את הוראות היצרן לקבלת צעדים מפורטים.
- שער לאמינה בתאים לחיות, אז עבור fsc+הסוכנות התחתיתואחריו CD11b + Cx3Cr1+IL23+ כדי לזהות רמת תאיים של IL23 ציטוקינים ו CD11b+ Cx3Cr1+IL1β+ ל לזהות רמה תאיים של IL1β cytokine.
- αSMA כתמים וניתוח
- שטוף תאים עם מאגר facs פעמיים על-ידי תפרידו ב 200 x g ו-4 ° צ' עבור 5 דקות כדי להסיר מאגר קבע עודפת.
- כדי לקבוע את רמת ה-αSMA, הוסף את התאים הניתנים לקיבוע בעזרת ערכת הפתרונות של קיבעון/חדירות (טבלת חומרים).
- התאים דגירה עם נוגדן anti-αSMA-AF488 (טבלה של חומרים) באמצעות 1:1000 דילול על הקרח 30 דקות.
- רחץ את התאים פעמיים ולאחר מכן בצע ניתוח FACS. שער לחיות, FSC+המטהואחריו זיהוי של αSMA+ תאים בתאי המעי הגס.
6. בידוד רנ א, RT-PCR, PCR בזמן אמת
- בידוד רנ א מ-מקינטוש או FACS תאים מטוהרים או ברקמת המעי הגס על ידי הומוגניזציה בהפקת מגיב (טבלת חומרים).
הערה: השתמש במשקפי הבטיחות ובציוד להגנה על מעבדה אחרים כאשר עובדים עם החומר הממגיב הזה כפי שהוא מגרה בריאה ובעור. . תעבוד בבטחה בשכונה - הוסף 0.5 μL of RNase-הגליקוגן חינם מ 20 μg/mL פתרון מניות הגליקוגן (טבלת חומרים) כדי לשפר את ההתאוששות של rna הכולל לפני מזרז rna עם איזופנול.
- להשעות מחדש את הגלולה RNA ב 50 μL של RNase מים חופשיים (שולחן חומרים) ו דגירה ב 55 ° צ' עבור 5 דקות כדי לפזר את החך RNA לחלוטין.
- קרא ריכוזי RNA באמצעות ספקטרוסקופיה ב 260 ננומטר.
- סנתז cDNA באמצעות 1 μg של RNA כולל וערכת סינתזה הפוכה (טבלת חומרים).
- לנתח ביטוי גנים באמצעות 2 μL של cDNA כמו תבניות דרך ה-PCR בזמן אמת. השתמש ב-96-ובכן לוחית ה-PCR מערכת מיקס מומחה (טבלת חומרים). השתמש בערכי CT כדי לחשב את שינוי הקיפול של שפע RNA לאחר נרמול ערכי ה-HPRT.
7. בלוק מערבי
- Lyse רקמת המעי הגס באמצעות מאגר לפירוק של ריפה (1% NP40).
- לפתור חלבון ליפוסט ב 8% bis-Tris ג'ל במתח קבוע של 80 V.
- העבר ג'ל-חלבון כדי ניטרוגליצרין קרום (s) במאגר העברה קרה פועל בזרם קבוע של 50 mA עבור 2 h ב 4 ° c.
- לחסום אזורים שאינם ספציפיים על הקרום חלבון שהועבר באמצעות 5% לא שומן חלב ב TBST (25 mM טריס-HCl, pH 7.4, 1.5 M הנאל, 0.05% הרצף-20) עבור לפחות 1 h בטמפרטורת החדר.
- כדי לזהות αSMA רמות, ממברנה דגירה (עם) עם נוגדן זיהוי ראשוני αSMA ב 4 ° c בלילה.
- רוחצים את הקרומים 3-4 פעמים באמצעות TBST במרווחי זמן של 15 דקות.
- דגירה עם הנוגדן המשני מעלה מצועם (1:10000) ב 5% חלב ללא שומן ב TBST.
- פיתוח קרומים בעזרת ערכת פיתוח ECL.
- הנרמל את עוצמות האות של החלבון באמצעות העברת העמסה כבקרת טעינה עבור ניתוח densi, try.
8. אנליזה סטטיסטית
- לנתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח נתונים של בחירה על ידי השוואה בין סוג פראי ובעלי חיים KO.
- שקול P-ערך של < 0.05 להיות משמעותי (* P < 0.05; * * P < 0.01; * * * P < 0.001).
- השתמש במבחן t של סטודנט כדי לבדוק את ההבדלים בין שתי קבוצות לבין בדיקת ANOVA לניתוח בין יותר משתי קבוצות.
Representative Results
אימצנו את דגם העכבר הקוליטיס TNBS כדי ללמוד ולהבהיר את המנגנונים הבסיסיים של סיסטיק מעיים8. כאן, אנו ביצעו המחקר מפורט בקורס הזמן של קוליטיס בתיווך TNBS, שם TNBS היה מחודש שבועי בניהול בשבוע לעכברים סוג פראי עבור עד שישה שבועות כמו מיוצג שטוח (איור 1א). לאחר שישה שבועות של טיפול TNBS, הבחנו כי אורכי חוקן לקצר בהדרגה במהלך הטיפול TNBS, מהממוצע של 5 ± 0.5 ס מ בקבוצת הביקורת כדי 3 ± 0.5 ס מ בקבוצה TNBS; ניתוח כמותי כזה של אורך המעי הגס מייצג הפחתה ניכרת באורך המעי הגס (איור 1B). כדי להבטיח כי מודל TNBS קרוהן היא דומה למודל פיברוזיס של האדם של קרוהן ולא היה חפץ הקשור המתודולוגיה, ניתחנו את סמנים פיברוטיק ברמות מרובות במחקר מפורט מסלול הזמן להזרקה TNBS לסוג פראי . הצטברות של אלפא השריר חלקה אקטין (αSMA) תאים חיוביים והתצהיר קולגן בתוך שכבות submucosal דווחו ברוב המקרים פיברוזיס ונחשב סימן ההיכר של אירועים פיברוטיק14. מצאנו כי קטעי המעי הגס של העכברים מטופלים TNBS כי היו מוכתמים עם αSMA הראו עלייה מקפלים 4-6 בשכבת המעי הגס מוכתם באופן חיובי עם αSMA (איור 1ג). חוץ מזה, Trichrome כתמים כחול עבור סעיפים אלה גם הראה גידול 2-4 מקפלים, מציע התצהיר קולגן משמעותי, אשר מאמתת פיברוזיס מעיים חמורות (איור 1ד). אנו עוד העריכו את ההפעלה של מיופיברופיצוצים על ידי זיהוי תאים αSMA-חיוביים על-ידי ניתוח FACS במעי הגס של עכברים מטופלים ומצא הצטברות משמעותית של αSMA-חיוביים מכתים (איור 1E). יתר על כן, מצאנו אינדוקציה משמעותית בביטוי של αSMA, קולונל I, ו-Col-III נמדד על ידי ניתוח qPCR בעכברים מטופלים TNBS (איור 1F). ביטוי מוגבר של חלבון αSMA בניתוח כתמי אבן המערבי חשף פיברוזיס מוגברת (איור 1G). בסך הכל, הטיפול הקינטיקה TNBS מספק הזדמנות לגשת תגובת החיסון החיסונית בתנאים כרוניים, אשר מחקה היטב את המצב בשלב כרונית CD והוא חיוני פיברוזיס פיתוח.
כדי להשוות פיברוזיס של tnbs עם פיברוזיס הקשורים קרוהן, ניתחנו את הביטוי של פיברוזיס סמנים ו ציטוקינים ביופסיה רקמה טרייה מן מעי של חולים עם תקליטור פעיל או תחת הפוגה. במידה ניכרת, מצאנו אינדוקציה מסומן של עיבוי של שכבות αSMA-חיוביים מוגברת התצהיר קולגן כפי שזוהה על ידי כתמים trichrome במקטעי תקליטור פעיל (איור 2א). בוצע גם ניתוח כתמי מערבי ואישר את האינדוקציה של ביטוי αSMA בדגימות תקליטורים פעילים (איור 2ב). בנוסף, הבחנו אינדוקציה משמעותית של סיסטיק סמנים כולל αSMA, עמודה 1, כפי שזוהה על ידי ניתוח qPCR (איור 2ג).
הבא, כדי לקבוע מנגנון להגביל את tnbs פיברוזיס הערכנו את ההשפעות של rapamycin, מעכב תרופתי של פעילות mtor15,16. לכן, התייחסו עכברים עם TNBS ו rapamycin וניתח αSMA ו קולגן רמת היסטולוגיה המעי הגס הראו מדידה כמותית של αSMA ו קולגן בעלילה densi,איור 3A). הנתונים שלנו מראים כי rapamycin מפחית את αSMA-חיוביים מכתים בשכבה submucosal ומפחית את התצהיר קולגן. כדי לוודא עוד ולכמת תגובות פיברוטיק, קבענו את αSMA, קולגן ו TGFβ ביטויים על ידי qPCR, וביטוי αSMA ידי זרימה cy, לנסות ב-TNBS מטופלים נקודתיים (איור 3B, 3c). הצגנו גם Cx3Cr1+ מונפציטים phagocytes לגרום תגובה חיסונית דלקתית לפציעה9. כך, רצינו לראות אם המינהל של rapamycin בעכברים מטופלים TNBS יכול להפוך את ההשפעות דלקתיות ופיברוטי. לכן, אנחנו מטוהרים Cx3Cr1+ תושב מוננוציטים phagocytes המעי הגס בודד תא השעיות באמצעות מיקרוחרוזים מגנטיים (איור 3ד). מצאנו רמה מוגברת של p-p70 ו-p-S6 ב Cx3Cr1+ תושב phagocytes ברור על ידי ניתוח כתמי המערבי של העכברים מטופלים tnbs, ורמה זו נחסמה על ידי rapamycin (איור 3E). חוץ מזה, מצאנו כי rapamycin טיפול לחות במורד IL-23 ו-IL-1β בקבוצה מטופלים TNBS (איור 3F). יתר על כן, ממצאים אלה להבהיר את המנגנון האפקטיבי המעורבים אינדוקציה של TNBS פיברוזיס והראו כי rapamycin מחליש את אינדוקציה של פיברוזיס.
איור 1: הממשל TNBS מוצלחת מוביל לפתח פיברוזיס המעי בעכברים. A. תרשים סכמטי ייצוג של טיפול tnbs שבועי שניתנו עכברים מסוג פראי. B. colon תמונות ומדידה של אורכי נקודתיים מעכברים שטופלו tnbs, שנקטפו בשבועות 0, 2, 4, ו 6 הטיפול post-TNSB. C-D. מקטעים נקודתיים ' ניתוח היסטולוגית ויטראז ' אנטי αSMA להפעלה של מיופיברותקיעות ו trichrome כחול כתמים עבור קולגן; סרגל בקנה מידה 100 μm. E. ניתוח FACS לזיהוי תאים αSMA-חיוביים בנקודתיים ובקוונפיקציה של תאים αSMA-חיוביים. F. פיברוטיק סמנים ו ציטוקינים זיהה על ידי qpcr. G. ניתוח כתמי מערביות של αSMA מ המעי הגס ליפוסט של שטופלו tnbs ועכברים שליטה. איור שונה זה נעשה שימוש חוזר עם ההרשאה של פרסום קודם9 במערכת האימונולוגיה של Mucosal, 2019 על ידי אטור et Al. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: TNBS פיברוזיס הוא דומה קרוהן-הקשורים פיברוזיס המעי. A. הנציג תמונות של ביופסיות המעי הגס של שליטה, תקליטור פעיל המציג גידול משמעותי של כתמים כחולים trichrome ו αSMA-חיוביים כתמים בשכבות submucosal, סרגל קנה מידה 50 Μm. B. ניתוח כתמי אבן מערבי של ביטוי αSMA וכימות. ג. qpcr ניתוח של סמנים פיברוטיק ו ציטוקינים. איור שונה זה נעשה שימוש חוזר עם ההרשאה של פרסום קודם9 במערכת האימונולוגיה של Mucosal, 2019 על ידי אטור et Al. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הטיפול rapamycin ביעילות קילה המושרה הנגרמת פיברוזיס. A. Colon ניתוח היסטולוגית-תמונות מייצגות של כתמים מיופיברוסט עם נוגדן Anti-αSMA ו קולגן מכתים עם כחול trichrome, סרגל בקנה מידה 100 Μm. B. Qpcr ניתוח של ΑSMA, קולגן ו TGFβ ביטוי בקרה/ מטפל בעכבר נקודתיים. C. facs ניתוח של αSMA בתלייה תא בודד מתוך קולון העכבר שטופלו עם שליטה/tnbs. ד. סכמטית לטיהור של Cx3Cr1+ תאים מחוקן לאמינה שבריר וניתוח ה-facs של תאים מטוהרים. ה. ניתוח כתמי מערב של p-p70 ו p-S6 רמות מטוהרים Cx3Cr1 + מוננוציטים phagocytes מעכברים שטופלו עם tnbs ו/או rapamycin. F. qpcr ניתוח של הביטוי ב מטוהרים Cx3Cr1 + מונמונומנט phagocytes, אשר מייצרת il-23 ו-il-1β. איור שונה זה נעשה שימוש חוזר עם ההרשאה של פרסום קודם9 במערכת האימונולוגיה של Mucosal, 2019 על ידי אטור et Al. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
ריפוי הפצע או תיקון רקמות הוא תהליך ביולוגי מוסדר היטב17. במהלך הפגיעה ברקמה במצב כימי, מכני וזיהום, תגובה דלקתית מפעילה את תהליך תיקון רקמות. עם זאת, התגובה דלקתיות מוסדר ופתולוגי מוביל לפתח צלקות או תגובת פיברוטיק, אשר עלול לפגוע בפונקציה תיקון רקמות9,18,19. כאן, אנו מראים את ההליך עבור המודל לחיות פיברוזיס הנגרמת על ידי TNBS, אשר מחולקת באופן משמעותי pathפסיולוגיה עם מחלת קרוהן האנושית. החיסונים הרצופים של החשיפה הכימית של TNBS לנזק האפיתל העכבר גורם כיבית עמוקים וגורמת פיברוזיס הפיתוח. עם אמינות, עלות נמוכה, אינדוקציה מהירה של התפתחות המחלה, שיטה זו מקובלת באופן נרחב על ידי קבוצות מחקר מרובות מעורבים במחקרים עבור פציעה ברקמות, דלקת הקיר העור הציר המוח המעיים.
כדי ליישם בהצלחה את המודל של TNBS פיברוזיס, קיימים מספר שלבים חיוניים. לדוגמה, מינון הולם ותזמון של מינהל TNBS חשובים מאוד. 6-8 מאפשר לחלות ברקמות עמוקות ומומלצת מאוד למחקרים כרוניים. שרפרף מתקרב מעכברים הרפלקס הרטרוגרדי של מחוסן TNBS הם שתי בעיות גדולות, אשר יכול לגרום למשלוח של מינונים משתנה לעכברים. לחץ עדין ליד הרקטום עכברים עשוי לעזור שחרור שרפרפים לפני הממשל TNBS. החזקת הראש של בעל החיים למטה למשך כמה שניות משמעותית מסייע להפסיק ריפלוקס הפוכה של TNBS. שמירה על העכברים בכלוב, הצבת הכלוב על משטח חום, ואספקת העכברים עם נקטר נאפה יכול גם להיות אסטרטגיות שימושיות למניעת תמותה גבוהה.
כאן, אנחנו גם דנים בדלקת בטן במהלך פיברוזיס TNBS ואת השפעתם על תגובת פיברוטיק. תפקיד mtor/אוטומטי מעורב באופן כללי על הומאוסטזיס מעיים ו-ibd בפתוגנזה20,21. זיהינו כי mTOR/אוטומטי איתות הוא קריטי כדי לווסת את התגובות pro-דלקתיות מ-IL-23 ו ציטוקינים IL1β מ Cx3Cr1+ מונמונומנט phagocytes המשפיעים על pro-פיברוטיק IL-23/il-22 ציר (איור 3A)9 . ובכך, טיהור יחיד Cx3Cr1+ מונמונומנט תאים עבור immunoprofiling וביטוי גנטי הוא צעד קריטי של המודל. אנו דנים בפירוט את הפרוטוקול לבידוד לאמינה ולספק את תהליך הטיהור לCx3Cr1+ מונמונומנט באמצעות חרוזים מגנטיים.
באופן קולקטיבי, למרות הנוכחות של מודלים גנטיים וספונטניים עבור מחלת קרוהן, TNBS-קוליטיס נשאר כלי רב עוצמה כדי ללמוד את דלקת הפתוגנזה של תקליטור ויש לו את הפוטנציאל להעריך את הטיפול פיברוזיס של קרוהן. המגבלה העיקרית של שימוש כימית המושרה פיברוזיס מודלים כגון TNBS הוא הסיכוי של שינויים גבוהים מהמשתמש למשתמש ואת האפשרות של outliers הנתונים. גודל מדגם של 5-8 בעלי חיים לכל קבוצה יחד עם חוויית משתמש גדולה יותר יכול להגביר את העקביות של המודל. עם זאת, מציאת מודל גנטי מתאים גרימת פיברוזיס של קרוהן היא ותמיד יהיה מוצדקת.
Disclosures
תחומי עניין מתחרים: המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק R01NS093045 (י דמרי), NIH גרנט K08DK088950 (X.Z.), R03DK099566 (X.Z.), ו קרוהן & קוליטיס קרן של מחקר אמריקה מלגת המחקר (CCFA) 481637 (עקב חומרי גלם).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 | e-bioscience | 53-9760-82 | |
| Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 | e-bioscience | 149760-80 | |
| Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 | Biolegend Inc | 101226 | |
| Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 | Biolegend | 149006 | |
| Anti-mouse purified CD16/32 Fc block | Biolegend Inc | 14-9760-80 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-105-639 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | e-bioscience | 7074 | |
| Bovine Serum Albumin | InvivoGen | tlrl-isdn | |
| Collagenase type IV | Roche | 1088866001 | |
| DAPI | SIGMA | D9542 | |
| DMEM | Corning | 10013-CV | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | D263-5vl | |
| Falcon® 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit | BD Bioscience | 555028 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | www.flowjo.com | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | e-bioscience | 5018 | |
| Graphpad Prism 7 | GraphPad Software Inc | www.graphpad.com | |
| H&E kit | American Mastertech Kit | HXMMHPT | |
| Image J | NIH | www.imagej.nih.gov/ij/ | |
| Mouse: C57BL/6J | Jackson Laboratories | 664 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Percol | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| PMA/Ionomycin salt | Sigma | P8139 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermofisher | A25777 | |
| Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 | Cell signaling | 5174 | |
| Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 | Cell signaling | 2708 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 | Cell signaling | 9208 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E | Cell signaling | 4858 | |
| Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein | Cell signaling | 2217 | |
| Rapamycin | LC LABORATORIES | 1003799 | |
| TNBS | Sigma | 92823 | |
| Trichorme staining kit | American Mastertech Kit | STOSTBPT | |
| TRIzol | Life technologies | 15596018 | |
| Verso cDNA Synthesis Kit | Thermofisher | AB1453B | |
| Zen black 2.1 | Carl Zeiss | www.zeis.com | |
| Zen blue lite 2.3 | Carl Zeiss | www.zeis.com |
References
- Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H.
- Park, S. G., et al. T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing gammadelta T cells. Immunity. 33, 791-803 (2010).
- Speca, S., Giusti, I., Rieder, F., Latella, G. Cellular and molecular mechanisms of intestinal fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18, 3635-3661 (2012).
- Keubler, L. M., Buettner, M., Hager, C., Bleich, A. A Multihit Model: Colitis Lessons from the Interleukin-10-deficient Mouse. Inflammatory Bowel Disease. 21, 1967-1975 (2015).
- Strober, W., Nakamura, K., Kitani, A. The SAMP1/Yit mouse: another step closer to modeling human inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 107, 667-670 (2001).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology-Gastroenterology and Liver Physiology. 296, G135-G146 (2009).
- Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery. 11, 9-15 (2016).
- Loeuillard, E., et al. 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced chronic colitis with fibrosis and modulation of TGF-beta1 signaling. World Journal of Gastroenterology. 20, 18207-18215 (2014).
- Mathur, R., et al. Induction of autophagy in Cx3cr1(+) mononuclear cells limits IL-23/IL-22 axis-mediated intestinal fibrosis. Mucosal Immunology. 12, 612-623 (2019).
- Joeris, T., Muller-Luda, K., Agace, W. W., Mowat, A. M. Diversity and functions of intestinal mononuclear phagocytes. Mucosal Immunology. 10, 845-864 (2017).
- Mathur, R., et al. A mouse model of Salmonella typhi infection. Cell. 151, 590-602 (2012).
- Zhao, X., et al. Noninflammatory Changes of Microglia Are Sufficient to Cause Epilepsy. Cell Reports. 22, 2080-2093 (2018).
- Murugaiyan, G., et al. MicroRNA-21 promotes Th17 differentiation and mediates experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 125, 1069-1080 (2015).
- Hinz, B., Celetta, G., Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Chaponnier, C. Alpha-smooth muscle actin expression upregulates fibroblast contractile activity. Molecular Biology of the Cell. 12, 2730-2741 (2001).
- Yang, J., et al. Rapamycin Inhibition of mTOR Reduces Levels of the Na+/H+ Exchanger 3 in Intestines of Mice and Humans, Leading to Diarrhea. Gastroenterology. 149, 151-162 (2015).
- Mutalib, M., et al. The use of sirolimus (rapamycin) in the management of refractory inflammatory bowel disease in children. Journal of Crohns and Colitis. 8, 1730-1734 (2014).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3209-3213 (2009).
- Paul, J., et al. IL-17-driven intestinal fibrosis is inhibited by Itch-mediated ubiquitination of HIC-5. Mucosal Immunology. 11, 427-436 (2018).
- Sohail, I., Ghosh, S., Mukundan, S., Zelewski, S., Khan, M. N. Role of Inflammatory Risk Factors in the Pathogenesis of Streptococcus pneumoniae. Frontiers of Immunology. 9, 2275 (2018).
- Laplante, M., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 149, 274-293 (2012).
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448, 427-434 (2007).
