Summary
Hier presenteren we een protocol om te verrijken, isoleren, identificeren en karakteriseren van eiwitten die zijn gewijzigd door SUMO in vivo zowel van menselijke hepatoma cellen en lever tumoren verkregen uit muizen modellen van hepatocellulaire carcinoom met behulp van SUMO-bindende entiteiten (SUBEs).
Abstract
Post-translationele modificatie is een belangrijk mechanisme reguleren van eiwit homeostase en functie in eukaryotische cellen. Onder alle ubiquitin-achtige eiwitten in leverkanker heeft de modificatie door SUMO (kleine Ubiquitin-MOdifier) de meeste aandacht gekregen. Isolatie van endogene SUMOylated eiwitten in vivo is uitdagend vanwege de aanwezigheid van actieve SUMO-specifieke proteasen. De initiële onderzoeken naar Sumoylatie in vivo waren gebaseerd op de moleculaire detectie van specifieke SUMOylated eiwitten (bijv. door Western Blot). Echter, in veel gevallen, antilichamen, over het algemeen gemaakt met niet-gemodificeerde recombinant eiwit, niet immunoprecipitate SUMOylated vormen van het eiwit van belang. Nikkel chromatografie is de andere benadering geweest om Sumoylatie te bestuderen door het vastleggen van histidine-gelabelde versies van SUMO-moleculen. Deze aanpak wordt voornamelijk gebruikt in cellen die stabiel of transitief met zijn-SUMO moleculen worden getransffecteerd. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn SUMO-bindende entiteiten (SUBEs) ontwikkeld om endogene SUMOylated eiwitten te isoleren. Hierin beschrijven we alle stappen die nodig zijn voor de verrijking, isolatie en identificatie van SUMOylated substraten van humane hepatoma cellen en hepatische weefsels uit een leverkanker muismodel met behulp van SUBEs. Ten eerste beschrijven we methoden die betrokken zijn bij de voorbereiding en Lysis van de humane hepatoma cellen en lever tumorweefsel monsters. Dan, een grondige uitleg van de voorbereiding van SUBEs en controles wordt gedetailleerd samen met het protocol voor de eiwit pull-down assays. Ten slotte worden enkele voorbeelden gegeven met betrekking tot de beschikbare opties voor de identificatie en karakterisering van het SUMOylated proteome, namelijk het gebruik van de analyse van de Western-Blot voor de detectie van een specifiek Sumoylleerd substraat van lever tumoren of het gebruik van proteomica door massaspectrometrie voor de karakterisering van hoge doorvoer van het sumoylated Proteoom en interactome in hepatoma cellen.
Introduction
Leverkanker is de zesde meest voorkomende kanker wereldwijd en de tweede oorzaak van de kanker-geassocieerde sterfgevallen1. Hepatocellulair carcinoom (HCC) is de meest heersende vorm van primaire leverkanker. In het verleden waren de gemeenschappelijke risicofactoren voor de ontwikkeling van HCC chronische hepatitis B-of C-infectie en misbruik van alcoholgebruik. In de laatste decennia, het metabool syndroom, type 2 diabetes niet-alcoholische vette leverziekte (NAFLD) is ontstaan als risicofactoren voor de ontwikkeling van HCC2. HCC is zeer heterogeen, zowel fenotypisch als genetisch, waarbij een complex netwerk van signalerings trajecten verstoord wordt. In de afgelopen jaren, ook al is er een toename van onze kennis over de moleculaire trajecten die betrokken zijn bij de pathogenese van HCC, er zijn nog steeds geen effectieve therapeutische benaderingen voor HCC management. Veel trajecten worden geactiveerd in HCC en remmen een over het algemeen drijft de compensatie door andere trajecten3. Dit was een van de grootste moeilijkheden bij de behandeling van HCC. Een meer globale aanpak kan dus een potentiële therapeutische aanpak bieden voor het klinisch beheer van leverkanker, bijvoorbeeld gericht op post-translationele modificaties (Ptm's), omdat meerdere signalering trajecten gelijktijdig kunnen worden gereguleerd door Ptm's van eiwitten.
Post-translationele modificaties worden beschouwd als belangrijke mechanismen reguleren van eiwit homeostase en functies4. Structurele en functionele veranderingen worden geïntroduceerd door ptm's, waardoor de Proteoom diversiteit toeneemt. De meest voorkomende Ptm's omvatten fosforylering, methylering, acetylering, glycosylatie, alomtegenwoordige en conjugatie van ubiquitin-achtige eiwitten (Ubl's). Onder alle Ubl's, eiwit modificatie door SUMO (kleine Ubiquitin MOdifier) heeft aandacht getrokken in verband met zijn cruciale rol in een verscheidenheid van cellulaire processen, met inbegrip van transcriptie, cellulaire lokalisatie, DNA-herstel, en celcyclus progressie 5. onlangs bleek sumoylatie te worden gewijzigd in leverkanker6,7,8,9, en veranderingen in de sumoylatie van specifieke eiwitten is beschreven om een rol te spelen in de progressie van kanker-gerelateerde ziekten9.
Bij zoogdieren zijn er vijf SUMO paralogues, SUMO-1 tot SUMO-5. Tot op heden is er geen experimenteel bewijs beschikbaar over het bestaan van endogene SUMO-4 en endogene SUMO-5 conjugatie reacties op het eiwit niveau10,11,12. Sumoylatie in zoogdieren wordt uitgevoerd door een enzymatische thiol-Ester Cascade met drie enzymen, het heterodimeric SUMO activerende enzym (SAE1/SAE2) of E1, het SUMO-conjugerende enzym (Ubc9) of E2 en een SUMO-E3-ligase specifiek voor elk doeleiwit. De actie van verschillende families van SUMO E3s lijkt te zijn in een dynamisch evenwicht met SUMO-specifieke proteasen (SUSPs of SENPs)13 waardoor de SUMOylation reactie zeer omkeerbaar. Bovendien is slechts een kleine fractie van het SUMOylated eiwit versus niet-SUMOylated totaal eiwit aanwezig. Daardoor is het isoleren van endogene SUMOylated eiwitten in vivo nogal uitdagend13.
Sumoylatie in vivo werd aanvankelijk bestudeerd door Western Blot met antilichamen tegen het eiwit van belang14. Immunoprecipitatie van het eiwit werd uitgevoerd met specifieke antilichamen en vervolgens werd PAGE-Western Blot uitgevoerd met anti-SUMO antilichamen. Het belangrijkste probleem met deze strategie is dat antilichamen die zijn gegenereerd tegen een niet-gemodificeerd recombinant eiwit niet altijd in staat zijn om de SUMOylated vorm van een eiwit te immunoprecipiteren. Als alternatief, nikkel chromatografie na de voorbijgaande uitdrukking van histidine Tagged (His6) versies van SUMO moleculen en het eiwit van belang is gebruikt voor het bestuderen van Sumoylering in cellen. Op deze basis, het zal handiger zijn om te detecteren SUMO gewijzigde formulieren van cellen stabiel uitdrukken His6-SUMO15. Voor in vivo studies, tandem-SUMO-interactie motieven (SIM) gebaseerde verrijking werd aangetoond voor de zuivering van polySUMO conjugaten16. Andere groepen zijn met behulp van epitope-Tagged antilichaam Sumo benaderingen bieden een haalbaar instrument om te onderzoeken van endogene sumoylatie in primaire cellen, weefsels, en organen17,18. En meer recentelijk hebben Nielsen en collega's gebruik gemaakt van op antilichamen gebaseerde verrijking om endogene en sitespecifieke SUMO in cellen en weefsels19te identificeren.
Om aanvullende informatie te verstrekken over de rol van Sumoylering in vivo, werden SUMO-bindende entiteiten (SUBEs), ook bekend als SUMO-traps, ontwikkeld20. Van relevantie, tandem ubiquitine bindende entiteiten (buizen) worden beschouwd als de conceptuele voorlopers van SUBEs en zijn commercieel beschikbare instrumenten voor de opsporing en isolatie van polyubiquityated eiwitten21. SUBEs zijn recombinant eiwitten die tandem herhalingen van SIMs bevatten, waardoor SUMO-moleculen op gemodificeerde eiwitten worden herkend met een toename van de algehele affiniteit voor SUMO-substraten. Sumo-traps werden ontworpen door de introductie van een E3 ubiquitin-eiwit ligase RNF4-afgeleide SIM2 en SIM3 motieven in tandem, in een vector met glutathion S-transferase (GST), een heterologe dragerproteïne20. Hoewel SUBEs niet goed kunnen worden gebruikt om mono-SUMOylated doel eiwitten te identificeren, biedt deze methode een hulpmiddel om de zuivering en identificatie van poly-SUMO-doel eiwitten in vivo te vergemakkelijken. Hierin beschrijven we de toepassing van SUBEs om SUMOylated eiwitten te isoleren, zowel in humane hepatoma cellen als bij muizen lever biopsieën, een belangrijk hulpmiddel voor de studie van leverkanker. Een totaal schema van het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, wordt weergegeven in Figuur 1.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door de CIC bioGUNE institutionele comités voor dierenverzorging en-behandeling. Alle inspanningen werden gedaan om dierenleed te minimaliseren en het aantal gebruikte dieren te verminderen. 3 maanden oud mannelijk Glycine N-methyltransferase (GNMT) deficiënte (GNMT−/−) en zijn wilde type littermates (GNMT+/+) werden gebruikt.
1. voorbereiding van de cel en Lysis
Opmerking: hierin werden huh-7 (humane hepatoma cellijn) en THLE2 (humane hepatische cellijn) gebruikt.
- Houd cellen in P100 platen in standaard groeimedia bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2-95% luchtvochtigheid.
- Kweekcellen in P100 platen met een dichtheid van 1,2 – 1,5 × 106 cellen per schotel door de cellen te tellen met behulp van een Neubauer hemocytometrie telkamer.
- Cultuur huh-7 in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicillaire-streptomycine-amfotericine B (PSA) en 1% glutamine.
- Cultuur THLE2 cellen in cultuur gerechten voorgecoat met 0,01 mg/mL fibronectin, 0,01 mg/mL bovien serumalbumine (BSA) en 0,03 mg/mL collageen type I opgelost in groeimedium dat bestaat uit bronchiale epitheliale celgroei basale medium (BEGM) aangevuld met groeifactoren (0,4% BPE, 0,1% insuline, 0,1% hydrocortison, 0,1% retinoïnezuur, 0,1% transferrin, 0,1% trijodothyronine, evenals 10% FBS, 1% PSA, 5 ng/mL epidermale groeifactor (EGF) en 70 ng/mL foshoethanolamine.
- Op het eindpunt van het experiment, aspireren de media van de platen en Wash cellen met 5 mL steriele 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Lyse cellen direct op de plaat geplaatst op ijs met behulp van 500 μL lysisbuffer (50 mM tris pH 8,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% nonidet P-40 (NP40), aangevuld met volledige EDTA-vrije proteaseremmer cocktail en 50 μM PR-619 voor elke P100 gerecht. Met behulp van een celscraper, schrapen voorzichtig de cellen van de bodem van de plaat in het lysis medium.
Opmerking: Controleer of alle cellen van de plaat zijn losgemaakt door de plaat basis visueel te inspecteren na de behandeling. - Als alternatief, oogst cellen door trypsinisatie door aspirerende celmedia en voeg 1 mL 1x (0,05%) trypsine-EDTA aan de plaat, voldoende om de cellen te bedekken en de plaat in de broedplaats te plaatsen bij 37 °C, 5% CO2en 95% vochtigheid gedurende ~ 5 minuten, zodat alle cellen van de plaat zijn losgemaakt. Voeg 2 mL voorverwarmde groeimedium toe om trypsinoisatie te stoppen. Centrifugeer bij 150 g gedurende 10 minuten en zuig het supernatant op. Was met 1x PBS en centrifugeer bij 150 x g gedurende 10 minuten. Na het opzuigen van het supernatant, voeg 500 μL lysisbuffer (50 mM tris pH 8,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, aangevuld met volledige EDTA-vrije proteaseremmer cocktail en 50 μM PR-619 voor elke P100 schotel.
Opmerking: de toevoeging van de PR-619 is van cruciaal belang. - Centrifugeer bij 15.500 x g en 4 °c gedurende 10 min. Breng de supernatant over naar een andere buis en gooi de pellet weg.
Opmerking: het protocol kan hier worden gepauzeerd en samples opgeslagen bij-80 °C tot verdere analyse.
2. weefsel preparaat en Lysis
- Bij dieren offer, verzamelen muis levers, wassen met koude PBS, en snap bevriezen onmiddellijk in vloeibare stikstof. Bewaar de monsters − 80 °C tot verdere analyse.
- Homogeniseren 75 mg fragmenten uit snap-Frozen/of Fresh levers in 1 ml ijskoude lysisbuffer (50 mm tris pH 8,5, 150 mm NaCl, 5 mm EDTA, 1% NP40, aangevuld met volledige EDTA-vrije cocktail van proteaseremmer en 50 μM PR-619). Voer de homogenisator uit op 6500 x rpm, 2 x 60 s per stuk, met een 30 s pauze (Zie tabel met materialen).
- Centrifugeer de monsters in een microfugebuis bij 15, 500 x g en 4 °c gedurende 10 min. Breng de supernatant over naar een andere buis en gooi de pellet weg.
- Alternatief, wrijf 75 mg bevroren weefsels in vloeibare stikstof. Vervolgens herstelt u het weefsel in 1 mL lysisbuffer.
- Centrifugeer het monster in een microfugebuis bij 15, 500 x g en 4 °c gedurende 10 min. Breng het supernatant over naar een andere buis en gooi de pellet weg.
Opmerking: het protocol kan hier worden gepauzeerd en samples opgeslagen bij-80 °C tot verdere analyse.
3. binding van GST-SUBEs of GST Control aan glutathion-agarose kralen
Opmerking: de synthese van de GST-SUBEs of GST-controle valt buiten het bestek van dit manuscript en kan worden bekeken in eerder gepubliceerde literatuur20. Als alternatief zijn GST-en Control SUBEs commercieel beschikbaar (bijv. SignalChem).
- Bereiding van glutathion kralen
- Voeg 1 mL gedeïoniseerd water toe aan 70 mg gelyofiliseerde glutathion-agarose kralen. Reconstitueer de parels 's nachts bij 4 °C (of gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur).
- Was de kralen grondig na zwelling (om lactose en ethanol te verwijderen die meestal aanwezig zijn in de gelyofiliseerde poeder agarose kralen). Om dit te doen, moet u eerst wassen met 10 mL gedeïoniseerd water of PBS, gevolgd door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voer deze driemaal uit.
- Na 3 wast, resuspendeer de parels in 1 mL PBS om een 50% (v/v) slurry te verkrijgen.
Opmerking: dit volume is geschikt voor de analyse van 10 samples.
- Voeg voor elk monster 100 μg GST-SUBEs of GST Control (zie referentie20) toe aan 100 μL van de glutathion kralen slurry en 500 μL PBS.
Opmerking: de relatieve overvloed van de SUMOylated eiwitten van belang bepaalt de hoeveelheid GST-SUBEs gebruikt voor pull-downs. Analyseer voor elk nieuw experimenteel model de toestand voorafgaand aan het eigenlijke experiment door Western de input, Bound en flow-through (FT) materiaal met anti-SUMO2/3 antilichamen of tegen eiwitten van belang (lever kinase B1 (LKB1). - Inbroed alle GST-SUBEs of GST Control met kralen bereid in 3,2., langzaam roteren in Rotator of mini roller (Zie tabel van de materialen) bij 4 °c gedurende ten minste 2 uur (langzame bindende reactie).
Opmerking: het toevoegen van 1 mm dithiotreïtol (DTT) verbetert de gst binding aan de glutathion kralen. - Herstel de agarose-parels door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde, resuspendeerde de parels in PBS om 50% (v/v) slurry te verkrijgen.
Opmerking: het protocol kan hier worden gepauzeerd en samples opgeslagen bij-80 °C tot verdere analyse.
4. GST pull down assay
- Na stap 1,5, 2,3 of 2,5, neem 1/10 van het totale volume (bv. 50 μL) en Verdun in hetzelfde volume van 3x kook buffer (250 mm tris-HCl pH 6,8, 500 mm β-mercaptoethanol, 50% glycerol, 10% SDS, broomfenolblauw). Deze breuk wordt beschouwd als INPUT.
- Voeg 450 μL geklaarde lysaat toe uit de stappen 1,5, 2,3 of 2,5 tot 100 μL glutathion kralen slurry. Inbroed het lysaat met kralen, langzaam roteren bij 4 °C gedurende ten minste 2 uur.
Opmerking: als alternatief kan 100-200 μg totaal eiwit uit stap 1,5, 2,3 of 2,5 (gekwantificeerd met de Bradford-test) in een totaal volume van 450 μL worden gebruikt. - Spin de kralen in een micro Fuge op 300 x g gedurende 5 minuten en verzamel het supernatant voor de analyse. Breng 1/10 van het totale volume (bijv. 50 μL) over in een aparte buis en Verdun in een gelijk volume van 3x kook buffer. Deze breuk is de doorstroom (ft) Fractie.
- Was het resterende monster driemaal met 1 mL ijskoude PBS, 0,05% Tween 20, spin naar beneden bij 4 °C en 300 x g gedurende 1 minuut. Zorg ervoor dat er geen vloeistof overblijft. De parels corresponderen met SUBEs gebonden (SB) breuk.
- Elute het monster met 15 μL 3x kook buffer en 15 μL lysisbuffer. Dit wordt de afhankelijke breuk genoemd.
5. identificatie en karakterisering van SUMO-targets door Western Blot Analysis
- Voer de analyse van Western Blot uit met een anti-SUMO2/3-antilichaam of een ander specifiek antilichaam van keuze zoals eerder beschreven22.
6. identificatie en karakterisering van het SUMOylated proteome door massaspectrometrie
Opmerking: in het geval van massaspectrometrie (MS)-analyse werden monsters verwerkt met behulp van de door Wisniewski et al.23beschreven filter-aided monster Preparation (fasp) methode.
- Ontzout de peptiden met behulp van stage-Tip C18 microcolumns en verwerk ze in 0,1% mierenzuur (FA) voorafgaand aan MS-analyse.
- Laad de monsters op een LC-MS-systeem (Zie tabel met materialen) en analyseer ze in drievat (technische duplo's) (Figuur 2b).
- Doorgaan met de eiwit identificatie en abundantie berekening met behulp van een bijbehorende software.
- Voor statistische analyses en het genereren van Heatmap laadt u de gegevens op het Perseus-platform (http://www.perseus.tufts.edu/hopper/). Breng een permutatie gebaseerde valse Discovery rate (FDR)-gecorrigeerde t-test voor de vergelijking van de Abundances. Eiwitten met een q < 0,05 en een SUBEs/GST-ratio groter dan 2 werden beschouwd als verrijkte24.
Opmerking: eiwitten die met ten minste twee verschillende peptiden worden geïdentificeerd, worden in de uiteindelijke analyse meegenomen.
Representative Results
Identificatie van een specifiek SUMOylation substraat in lever tumor biopsies door Western Blot analyse
Lever kinase B1 (LKB1) sumoylation is onlangs aangetoond dat een belangrijke oncogene bestuurder in leverkanker9,25. Muizen met een tekort aan Glycine N-methyltransferase (GNMT), vaak aangeduid als GNMT−/−, is een model dat spontaan hepatocellulaire carcinoom (HCC) ontwikkelt, de meest voorkomende vorm van primaire leverkanker. Subes werden gebruikt om de sumoylated eiwitten te verrijken en te isoleren, zowel in GNMT−/− muizen met leverkanker muizen als in het wild type littermates (GNMT+/+). In Fig. 2azijn Ponceau S kleuring van de drie verschillende fracties (input, ft en Bound) verkregen in de subes pull-down assay inbegrepen. Een Ponceau S Stain is nuttig om een mogelijk schadelijk effect op het laden van uitgebloefde eiwitten te controleren door westerse blots te beoordelen. In Figuur 2b wordt een Western Blot-analyse van LKB1 met behulp van subes voor het vastleggen van endogene SUMOylated LKB1 weergegeven. De niveaus van LKB1 SUMOylation worden verhoogd in lever tumoren. In het geval van de analyse van Western Blot werden gelijke belastingen en overgedragen eiwitten waargenomen door Ponceau kleuring van de ingangs Fractie en werden niet significant veranderd na wassen (doorstroming door breuk). De hoeveelheid eiwit gevangen met SUBEs was aanzienlijk hoger, met name in de tumoren. Als alternatief kan de kleuring van een duplicaat gel met Coomassie Blue soortgelijke informatie bieden. Kleverige eiwitten zoals p53 of SUMOylated vormen van sommige eiwitten kunnen aan de GST-controle binden. Om de achtergrond te verwijderen, agarose-kralen met lage dichtheid te gebruiken, een coating met BSA uit te voeren of extra wasmiddel in te nemen. Echter, dit kan invloed hebben op toepassingen zoals massaspectrometrie en kan leiden tot verlies van lage affiniteit interactie eiwitten.
Karakterisering van de SUMO interactome in humane hepatoma cellen door massaspectrometrie analyse
Om te onderzoeken van de capaciteit van de SUMO-trap om te communiceren met natuurlijke SUMOylated eiwitten, huh-7 (menselijke hepatoma) en niet-getransformeerde lever epitheliale menselijke THLE2 cellijnen werden gebruikt. De eerste stap is de visualisatie van het totale materiaal dat is vastgelegd met SUBEs en het gebruik van GST als een negatieve controle. Hiervoor kunnen we conventionele eiwit kleurings protocollen gebruiken zoals weergegeven in Figuur 3a. Vervolgens, we voerden massaspectrometrie analyse. Een gemiddelde van 2268 eiwitten werden geïdentificeerd in de Huh7 GST-monsters (2339, 2297 en 2168 voor elke belasting), terwijl 2812-eiwitten gemiddeld werden geïdentificeerd in het Huh7-monster van SUBEs (2815, 2817 en 2806). Na het aftrekken werden 742 eiwitten verrijkt in de SUBEs. Aan de andere kant, een gemiddelde van 2497 eiwitten werden geïdentificeerd in de THLE2 GST monsters (2476, 2520 en 2495, respectievelijk) en 2763 in de SUBEs (2823, 2783 en 2684). Van deze, 577 werden beschouwd als verrijkt in de SUBEs monsters. Analyse van technische replicaten haalt de heatmap op die wordt weergegeven in Figuur 3b, die werd berekend aan de hand van de beschikbare standaardinstellingen (Euclidische afstand, gemiddelde koppeling en voorbewerkt met k-middelen). De heatmap toont de verdeling van de 100 meest significante en uitsluitend verrijkte eiwitten in elke cellijn.
Figuur 1: Schematisch diagram van het protocol stroomschema dat wordt gebruikt voor de verrijking, isolatie en identificatie en de karakterisering van het sumoylated Proteoom in vivo voor de studie van leverkanker. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: modificatie van LKB1 door SUMO-2 in muismodellen van hepatocellulaire carcinoom.
a) Ponceau S kleuring van de drie verschillende fracties (input, flow through (ft) en Bound) verkregen in de subes pull-down test. b) analyse van Western Blot van LKB1 door het gebruik van Sumo-bindende entiteiten (subes) om endogene SUMOylated LKB1 vast te leggen; GAPDH wordt gebruikt als laadregelaar. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: verschillen tussen de sumoylated Proteoom tussen de tumor huh-7 en niet-getransformeerde lever epitheel THLE2 menselijke cellijnen.
a) sypro-kleuring van opgenomen proteïne-materiaal, met gst (negatieve controle) en subes. c) heatmap met de differentieel verrijkte eiwitten in huh-7-en THLE2-sube-samples. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Hierin hebben we een volledige en gedetailleerde beschrijving gegeven van de methodologie die het gebruik van SUBEs meldt voor de verrijking, isolatie en identificatie en karakterisering van de SUMOylated eiwitten in in vivo modellen van leverkanker. Zowel in muizen lever tumoren en menselijke hepatoma cellen, we waren in staat om te isoleren en te identificeren sumoylated eiwitten van belang en voor het uitvoeren van een hoge doorvoer karakterisering van de sumoylated Proteoom en interactome. Hoewel de synthese van SUBEs buiten het bestek van dit manuscript valt, moeten voor verdere informatie de volgende verwijzingen naar26worden bekeken. Het beschreven protocol is snel en zeer gevoelig en de kritieke stap van het protocol omvat het gebruik van SENPs-remmers (PR-619). In het alternatief kunnen chemische isopeptidase remmers zoals NEM (N-Ethylmaleimide) en IAA (2-Iodoacetamide) in de lysisbuffer worden gebruikt, maar uit eerdere rapporten is gebleken dat het gebruik van PR-619 voor het subes-protocol voordelig is als de andere remmers interfereren met GST binding aan de glutathion kralen20.
SUBEs zijn recombinant eiwitten die tandem herhalingen van SIMs bevatten, waardoor SUMO-moleculen op gemodificeerde eiwitten worden herkend met een toename van de algehele affiniteit voor SUMO-substraten. Vanwege de hoge specificiteit en gevoeligheid is het gebruik van Suben voor de isolatie van het sumoylated Proteoom voordelig in vergelijking met andere benaderingen in de literatuur, zoals de detectie door Western-Blot van specifieke sumoylated eiwitten met antilichamen tegen het eiwit van belang of de nikkel-chromatografie met behulp van de verschillende histidine-gelabelde versies van SUMO-moleculen. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat als het SUBEs-protocol wordt uitgevoerd onder niet-denaturerende omstandigheden, de interactie tussen SUMOylated eiwitten en andere werkende eiwitten wordt gehandhaafd. Daarom verkrijgen we informatie over de SUMO interactome in plaats van alleen een lijst van SUMOylated doel eiwitten. Daarom zijn verdere experimenten nodig om te bevestigen of het geïdentificeerde eiwit een SUMO-doelwit of een interactie factor is. Andere beperking van de SUBEs is het feit dat controle GST traps gebruikt zijn in staat om veel achtergrond eiwitten die verband houden met oxidatieve stress vast te leggen. Dit probleem is vooral relevant tijdens de MS-analyse vanwege de hoge gevoeligheid van de techniek. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn biotinyleerd Sumo-traps (biosubes) ontwikkeld26. Een andere beperking van SUBEs woont in het feit dat we alleen kunnen vangen eiwitten gemodificeerd door SUMO 2 en SUMO 3 terwijl SUMO 1-gemodificeerde eiwitten niet kunnen worden geïsoleerd.
Andere bezorgdheid over het gebruik van SUBEs is gerelateerd aan de hoeveelheid uitgangsmateriaal die nodig is voor de procedure. Het uitgangsmateriaal dat wordt gebruikt om SUMOylated eiwitten vast te leggen, moet rekening houden met de verschillende experimentele omstandigheden. Terwijl basale SUMOylation is gemeld in verschillende cellulaire contexten, SUMOylation is een proces dat sterk wordt geïnduceerd na meerdere stress voorwaarden/stimuli. Bij het vergelijken van onbehandelde versus behandelde monsters moet men er zeker van zijn dat de kolom niet verzadigd is en er verschillen tussen die omstandigheden kunnen worden waargenomen. In het geval van de muis fenotypes die we analyseren, zijn er geen behandelingen gebruikt en zijn de basale Sumoylatie niveaus laag. Om deze reden werden grote hoeveelheden eiwitten gebruikt. Het achtergrondniveau moet worden bepaald met behulp van GST en als de niet-specifieke binding hoog is, moet de hoeveelheid begin materiaal of de bindingstijd worden verlaagd. De analyse van de FT-fractie kan indicatief zijn voor de opname-efficiëntie, zelfs als deze vallen de voorkeur geven aan poly-SUMOylated eiwitten en een totale depletie niet mag worden verwacht, is een reductie van de totale Sumoylering in het algemeen goed waargenomen wanneer de vangst efficiëntie Optimale.
Tot slot, andere toepassing van de SUBEs-technologie omvat de combinatie van SUBEs-technologie met real-time Surface Plasmon Resonance (SPR) waardoor de real-time interacties met SUMOylated eiwitten uit celextracten27. Ook, meer recentelijk, biotinyleerd Sumo-traps (biosubes) zijn ontwikkeld met het voordeel om de achtergrond van grotere Tags te verminderen, bijvoorbeeld tijdens massaspectrometrie analyse26. Bovendien kan de bioSUBE-versie worden gebruikt om SUMOylated eiwitten in levende cellen te detecteren door fluorescentie door het gebruik van streptavidine-gelabeld met duidelijke fluorescerende kleurstoffen die profiteren van de streptavidine binding aan biotine. Ook kunnen methoden voor de detectie en kwantificering van SUMOylated eiwitten worden overwogen met zowel GST-als bioSUBEs-versies, zoals het werd gedaan met de tandem ubiquitine bindings entiteiten (TUBEs)21.
Over het algemeen is het gebruik van Suben voor de isolatie en karakterisering van het sumoylated Proteoom dat relevant is voor leverkanker een snelle en gevoelige methode die enorme informatie verschaft over de nog steeds eerder onbekende rol van het sumoylatiepad in leverkanker.
Disclosures
Dr. Martínez-chantar adviseert voor Mitotherapeutix LLC.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van het Institut National du Cancer, Frankrijk, INCa Grant PLBIO16-251 (PLBIO16-251), CONACyT-SRE (Mexico) Grant 0280365 en het REPERE programma van Occitanie, Frankrijk (M.S.R.). Ook, NIH (US Department of Health and Human Services)-R01AR001576-11A1, Gobierno Vasco-Departamento de Salud 2013111114 (naar M.L.M.-C), ELKARTEK 2016, Departamento de Industria del Gobierno Vasco, MINECO: SAF2017-87301-R integrado en El plan Estatal de Onderzoeksbureau Cientifica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER, BIOEF (Baskische Stichting voor innovatie en gezondheidsonderzoek): EITB Maratoia BIO15/CA/014; Instituto de Salud Carlos III: PIE14/00031, integrado en El plan Estatal de Onderzoeksación Cientifica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER (to M.L.M.-C), Asociación Española Contra el cáncer (T. C. D, M. L. M-C), Daniel Alagille Award van EASL (naar T. C. D), Fundación científica de la Asociación Española Contra el kanker (AECC Scientific Foundation) zeldzame tumor noemt 2017 (naar M. L. M), La Caixa Foundation programma (naar M. L. M). Wij danken MINECO voor de Severo Ochoa Excellence accreditatie aan CIC bioGUNE (SEV-2016-0644).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Gnmt−/−)/ (Gnmt+/+) mice | CIC bioGUNE | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| BEBM | Lonza/Clonetics Corporation | cc-3171 | |
| BEGM Bullet Kit | Lonza/Clonetics Corporation | CC3170 | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| C18 microcolumns | Millipore | Z720070 | |
| Collagen type I | Santa Cruz Biotechnology | sc-136157 | |
| Complete tablets EDTA-free | Roche | 4693132001 | |
| DMEM | Life Technologies | A14431-01 | |
| DTT | Sigma | 43815 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | e9644 | |
| FBS | Life Technologies | 10270 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33010018 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma | G4510 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| GST-Control | SignalChem | G52-30H | |
| GST-SUBEs | SignalChem | S291-340G | |
| Huh7 | CLS (Cell Lines Service) | 300156 | https://clsgmbh.de/ |
| IAA (2-Iodoacetamide) | Merck | L58046844 | |
| LKB1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32245 | |
| Mini LabRoller Rotator | LABNET | H5500 | https://www.labnetinternational.com |
| NaCl | Merck | 106404041000 | |
| nanoElute | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
| NEM (N-Ethylmaleimide) | Sigma | E3876 | |
| NP40 | Fluka | 74385 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Peaks software | Bioinformatics Solutions Inc. | http://www.bioinfor.com/ | |
| Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 | |
| PR-619 | Merck | 662141 | |
| Precellys 24 | Bertin Technologies | P000669-PR240-A | |
| PSA | Life Technologies | 151-40-122 | |
| PSG | Life Technologies | 10378-016 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| SUMO2/3 antibody | Abcam | Ab3742 | |
| THLE-2 | ATCC | ATCC CRL-2706 | http://www.lgcstandards-atcc.org |
| timsTOF Pro with PASEF mass spectrometer | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 60-24-2 |
References
- Forner, A., Llovet, J. M., Bruix, J.
- Gerbes, A., et al. Gut roundtable meeting paper: selected recent advances in hepatocellular carcinoma. Gut. , (2017).
- Avila, M. A., Berasain, C., Sangro, B., Prieto, J. New therapies for hepatocellular carcinoma. Oncogene. 25 (27), 3866-3884 (2006).
- Grotenbreg, G., Ploegh, H.
- Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 17 (9), 581-595 (2016).
- Seeler, J. S., Dejean, A.
- Tomasi, M. L., et al. S-adenosyl methionine regulates ubiquitin-conjugating enzyme 9 protein expression and sumoylation in murine liver and human cancers. Hepatology. 56 (3), 982-993 (2012).
- Li, J., et al. Cbx4 governs HIF-1alpha to potentiate angiogenesis of hepatocellular carcinoma by its SUMO E3 ligase activity. Cancer Cell. 25 (1), 118-131 (2014).
- Zubiete-Franco, I., et al. SUMOylation regulates LKB1 localization and its oncogenic activity in liver cancer. EBioMedicine. 40, 406-421 (2019).
- Sarge, K. D., Park-Sarge, O. K. SUMO and its role in human diseases. Internationa Review of Cell and Molecular Biology. 288, 167-183 (2011).
- Da Silva-Ferrada, E., Lopitz-Otsoa, F., Lang, V., Rodriguez, M. S., Matthiesen, R. Strategies to Identify Recognition Signals and Targets of SUMOylation. Biochemical Research International. , 875148 (2012).
- Liang, Y. C., et al. SUMO5, a Novel Poly-SUMO Isoform, Regulates PML Nuclear Bodies. Science Reports. 6, 26509 (2016).
- Mikolajczyk, J., et al. Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs. Journal of Biologucal Chemistry. 282 (36), 26217-26224 (2007).
- Hilgarth, R. S., Sarge, K. D.
- Vertegaal, A. C., et al. A proteomic study of SUMO-2 target proteins. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33791-33798 (2004).
- Bruderer, R., et al. Purification and identification of endogenous polySUMO conjugates. EMBO Reports. 12 (2), 142-148 (2011).
- Becker, J., et al. Detecting endogenous SUMO targets in mammalian cells and tissues. Nature Structural Molecular Biology. 20 (4), 525-531 (2013).
- Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nature Protocols. 9 (4), 896-909 (2014).
- Hendriks, I. A., et al. Site-specific characterization of endogenous SUMOylation across species and organs. Nature Communications. 9 (1), 2456 (2018).
- Da Silva-Ferrada, E., et al. Analysis of SUMOylated proteins using SUMO-traps. Science Reports. 3, 1690 (2013).
- Hjerpe, R., et al. Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities. EMBO Reports. 10 (11), 1250-1258 (2009).
- Embade, N., et al. Murine double minute 2 regulates Hu antigen R stability in human liver and colon cancer through NEDDylation. Hepatology. 55 (4), 1237-1248 (2012).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Meier, F., et al. Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
- Ritho, J., Arold, S. T., Yeh, E. T. A Critical SUMO1 Modification of LKB1 Regulates AMPK Activity during Energy Stress. Cell Reports. 12 (5), 734-742 (2015).
- Lang, V., Da Silva-Ferrada, E., Barrio, R., Sutherland, J. D., Rodriguez, M. S. Using Biotinylated SUMO-Traps to Analyze SUMOylated Proteins. Methods in Molecular Biology. 1475, 109-121 (2016).
- Xolalpa, W., Rodriguez, M. S., England, P. Real-Time Surface Plasmon Resonance (SPR) for the Analysis of Interactions Between SUMO Traps and Mono- or PolySUMO Moieties. Methods in Molecular Biology. 1475, 99-107 (2016).
