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Biochemistry

लीवर कैंसर में सूमो प्रोटेओम के संवर्धन, अलगाव, पहचान, और विशेषता के लिए उपकरण के रूप में SUMO-Binding संस्थाओं (SUBEs)

Published: November 1, 2019 doi: 10.3791/60098
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 1
1Liver Disease and Liver Metabolism Lab, CIC bioGUNE, Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd), 2Proteomics Platforms, CIC bioGUNE, ProteoRED-ISCIII, CIBERehd, 3Advanced Technology Institute in Life Sciences (ITAV)-CNRS-IPBS, UbiCARE

Summary

यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए समृद्ध, अलग, पहचान, और दोनों मानव hepatoma कोशिकाओं और यकृत ट्यूमर से मानव hepatoma कोशिकाओं और यकृत ट्यूमर से vivo में संशोधित प्रोटीन की विशेषता SUMO बाध्यकारी संस्थाओं का उपयोग करके hepatocellular कार्सिनोमा के माउस मॉडल से प्राप्त (SUBEs).

Abstract

पोस्ट-ट्रांस्लेशनल संशोधन प्रोटीन होमियोस्टेसिस को विनियमित करने वाला एक महत्वपूर्ण तंत्र है और यूकैरियोटिक कोशिकाओं में कार्य करता है। यकृत कैंसर में सभी सर्वव्यापक प्रोटीन की तरह, SUMO द्वारा संशोधन (लघु Ubicuitin MOdifier) सबसे अधिक ध्यान दिया गया है. विवो में अंतर्जात सुमोइलित प्रोटीन का अलगाव सक्रिय सूमो-विशिष्ट प्रोटीज़ की उपस्थिति के कारण चुनौतीपूर्ण है। विवो में सुमोयलेशन के प्रारंभिक अध्ययन विशिष्ट सुमोयलेट प्रोटीन (जैसे, पश्चिमी धब्बा द्वारा) के आणविक पता लगाने पर आधारित थे। हालांकि, कई मामलों में, एंटीबॉडी, आम तौर पर गैर संशोधित पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ बनाया, ब्याज की प्रोटीन के इम्यूनोप्रिसिपेट SUMOylated रूपों नहीं किया. निकल क्रोमैटोग्राफी सूमो अणुओं के histidine-tagged संस्करणों पर कब्जा करके SUMOylation का अध्ययन करने के लिए अन्य दृष्टिकोण रहा है। यह दृष्टिकोण मुख्य रूप से उनकी-SUMO अणुओं के साथ stably व्यक्त या क्षणिक रूप से transfected कोशिकाओं में प्रयोग किया जाता है. इन सीमाओं को दूर करने के लिए, सूमो बाध्यकारी संस्थाओं (SUBEs) अंतर्जात SUMOylated प्रोटीन को अलग करने के लिए विकसित किए गए थे. इसमें, हम सब संवर्धन, अलगाव के लिए आवश्यक कदम का वर्णन, और SUBEs का उपयोग करके एक जिगर के कैंसर माउस मॉडल से मानव hepatoma कोशिकाओं और यकृत ऊतकों से SUMOylated substrates की पहचान. सबसे पहले, हम मानव hepatoma कोशिकाओं और जिगर ट्यूमर ऊतक के नमूने की तैयारी और lysis में शामिल तरीकों का वर्णन. फिर, SUBEs और नियंत्रण की तैयारी की एक पूरी तरह से विवरण प्रोटीन पुल नीचे परख के लिए प्रोटोकॉल के साथ विस्तृत है. अंत में, कुछ उदाहरण की पहचान और SUMOylated proteome, अर्थात् जिगर ट्यूमर या उपयोग से एक विशिष्ट SUMOylated सब्सट्रेट का पता लगाने के लिए पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण के उपयोग की विशेषता के लिए उपलब्ध विकल्पों के बारे में प्रदान की जाती हैं हेपेटोमा कोशिकाओं में सुमोयलेटिड प्रोटीओम और इंटरैक्टोम के उच्च थ्रूपुट लक्षण के लिए जन स्पेक्ट्रममिति द्वारा प्रोटीओमिक्स की।

Introduction

लिवर कैंसर दुनिया भर में छठा सबसे आम कैंसर है और कैंसर से जुड़ी मौतों का दूसरा कारण1. हेप्टोकोशिकीय कार्सिनोमा (एचसीसी) प्राथमिक यकृत कैंसर का सबसे प्रचलित रूप है। ऐतिहासिक रूप से, एचसीसी के विकास के लिए आम जोखिम कारकों में क्रोनिक हेपेटाइटिस बी या सी संक्रमण और अपमानजनक शराब की खपत शामिल थी। पिछले दशकों में, चयापचय सिंड्रोम, प्रकार 2 मधुमेह गैर शराबी फैटी लीवर रोग (NAFLD) एचसीसी2के विकास के लिए जोखिम कारक के रूप में उभरा है। एचसीसी बहुत विषम है, दोनों phenoआमरूपऔर और आनुवंशिक रूप से, जिसमें संकेतन रास्ते का एक जटिल नेटवर्क बाधित कर रहे हैं. पिछले वर्षों में, भले ही एचसीसी के रोगजनन में फंसा आणविक रास्ते के बारे में हमारे ज्ञान में वृद्धि हुई है, फिर भी एचसीसी प्रबंधन के लिए कोई प्रभावी चिकित्सीय दृष्टिकोण नहीं है। कई रास्ते एचसीसी में सक्रिय हो जाते हैं और एक को रोकते हैं जो आम तौर पर अन्य मार्गों3द्वारा मुआवजे को चलाता है। एचसीसी के इलाज के दौरान यह मुख्य कठिनाइयों में से एक रहा है। इस प्रकार, एक और अधिक वैश्विक दृष्टिकोण जिगर के कैंसर के नैदानिक प्रबंधन के लिए एक संभावित चिकित्सीय दृष्टिकोण प्रदान कर सकते हैं जैसे, पोस्ट-अनुवाद संशोधनों (PTMs) को लक्षित, के रूप में कई संकेतन रास्ते एक साथ प्रोटीन के PTMs द्वारा विनियमित किया जा सकता है.

अनुवादके बाद के संशोधनों को प्रोटीन होस्टेसिस और कार्यों को विनियमित करने वाले प्रमुख तंत्र के रूप में माना जाताहै। संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन PTMs द्वारा शुरू कर रहे हैं, जिससे, proteome विविधता में वृद्धि. सबसे आम पीटीएम में फॉस्फोरिलेशन, मिथाइलेशन, एसिटाइलेशन, ग्लाइकोसिकेशन, सर्वव्यापकता, और सर्वव्यापक प्रोटीन (यूबीएल) का संयोजन शामिल है। सभी UbLs के अलावा, SUMO द्वारा प्रोटीन संशोधन (छोटे Ubicuitin MOdifier) सेलुलर प्रक्रियाओं की एक किस्म में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका के साथ सहयोग में ध्यान आकर्षित किया है, प्रतिलेखन सहित, सेलुलर स्थानीयकरण, डीएनए की मरम्मत, और सेल चक्र प्रगति 5. हाल ही में, SUMOylation जिगर के कैंसरमेंबदल दिखाया गया था 6,7,8,9, और विशिष्ट प्रोटीन के SUMOylation में परिवर्तन की प्रगति में एक भूमिका निभाने के लिए वर्णित किया गया है कैंसर से संबंधित बीमारियों9|

स्तनधारियों में, पांच सूमो पैरालॉग, सूमो-1 से सुमो-5 होते हैं। आज तक, अंतर्जात सूमो-4 और अंतर्जात सूमो-5 के अस्तित्व के बारे में कोई प्रयोगात्मक साक्ष्य प्रोटीन स्तर10,11,12पर उपलब्ध नहीं है। स्तनधारियों में सुमोयलेशन एक एंजाइमी थायोल-एस्टर झरना द्वारा किया जाता है जिसमें तीन एंजाइम शामिल होते हैं, हेटोऑडिमिक सूमो सक्रिय एंजाइम (SAE1/SAE2) या E1, SUMO संयोजन एंजाइम (Ubc9) या E2 और प्रत्येक लक्ष्य प्रोटीन के लिए एक SUMO-E3-ligase विशिष्ट। SUMO E3s के कई परिवारों की कार्रवाई SUMO-विशिष्ट proteases (SUSPs या SENPs)13 SUMOylation प्रतिक्रिया अत्यधिक प्रतिवर्ती बनाने के साथ एक गतिशील संतुलन में प्रतीत होता है. इसके अलावा, केवल SUMYlated प्रोटीन का एक छोटा सा अंश बनाम गैर-SUMYlated कुल प्रोटीन मौजूद है. इस तरह, विवो में अंतर्जात सुमोइलित प्रोटीन को अलग करना13के बजाय चुनौतीपूर्ण है।

विवो में सुमोयलेशन का अध्ययन शुरू में पश्चिमी दाग द्वारा ब्याजकेप्रोटीन के विरुद्ध एंटीबॉडी द्वारा किया जाता था . प्रोटीन का इम्यूनोवेरेशन विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ किया गया था और फिर पेज-वेस्टर्न ब्लॉट एंटी-सुमो एंटीबॉडी के साथ किया गया था। इस रणनीति के साथ मुख्य समस्या यह है कि एक गैर संशोधित पुनः संयोजक प्रोटीन के खिलाफ उत्पन्न एंटीबॉडी हमेशा एक प्रोटीन के SUMOylated रूप प्रतिरक्षा करने में सक्षम नहीं हैं. वैकल्पिक रूप से, निकैल क्रोमैटोग्राफी के बाद histidine टैग (His6) SUMO अणुओं के संस्करणों और ब्याज के प्रोटीन कोशिकाओं में SUMOylation अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस आधार पर, यह और अधिक सुविधाजनक होगा SUMO संशोधित रूपों का पता लगाने के लिए कोशिकाओं से stably His6-SUMO15व्यक्त . विवो अध्ययन में, अग्रानुक्रम-सुमो-इंटरैक्टिंग रूपांकनों (सिम) आधारित संवर्धन पॉलीसूमो के शुद्धिकरण के लिए प्रदर्शन किया गया था16. अन्य समूह प्राथमिक कोशिकाओं, ऊतकों औरअंगोंमें अंतर्जात सुमोयलेशन की जांच करने के लिए एक व्यवहार्य उपकरण प्रदान करने वाले एपिटो-टैग किए गए एंटीबॉडी सूमो दृष्टिकोणों का उपयोग कर रहेहैं। और हाल ही में, नीलसन और उनके सहयोगियों ने कोशिकाओं और ऊतकों में अंतर्जात और साइट-विशिष्ट सूमो की पहचान करने के लिए एंटीबॉडी-आधारित संवर्धन का उपयोग कियाहै।

विवो में सुमोयलेशन की भूमिका के बारे में पूरक जानकारी प्रदान करने के लिए, सुमो-बाध्यकारी इकाइयों (SUBEs), जिसे सुमो ट्रैप के नाम से भी जाना जाता है,20विकसित किया गया था। प्रासंगिकता की, अग्रानुक्रम सर्वव्यापकता बाध्यकारी संस्थाओं (TUBEs) SUBEs के संकल्पनात्मक अग्रदूत माना जाता है और पॉलीयूबिक्विटीलेटेड प्रोटीन21का पता लगाने और अलगाव के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरण हैं। SUBEs पुनः संयोजक प्रोटीन है कि सिम के अग्रानुक्रम दोहराता शामिल हैं जिससे SUMO substrates के लिए समग्र संबंध में वृद्धि के साथ संशोधित प्रोटीन पर SUMO अणुओं को पहचानने. सुमो-ट्रैप एक E3 सर्वव्यापक प्रोटीन लिगाज़ RNF4 व्युत्पन्न सिम 2 और सिम3 रूपांकनों एक साथ मिलकर, glutathione एस-ट्रांसफरेस (जीएसटी), एक विषमवाहक वाहक प्रोटीन20युक्त एक वेक्टर में शुरू करके इंजीनियर थे। हालांकि SUBEs ठीक से मोनो-SUMOylated लक्ष्य प्रोटीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, इस विधि के शुद्धिऔर विवो में पाली-SUMO लक्ष्य प्रोटीन की पहचान की सुविधा के लिए एक उपकरण प्रदान करता है. इसमें, हम दोनों मानव hepatoma कोशिकाओं में और माउस जिगर बायोप्सी, जिगर के कैंसर के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण में SUMOylated प्रोटीन को अलग करने के लिए SUBEs के आवेदन का वर्णन. इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल की एक समग्र योजना चित्र 1 में दर्शायीगई है।

Protocol

सभी प्रयोगों को पशु देखभाल और हैंडलिंग के लिए सीआईसी बायोगन संस्थागत समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था। पशुओं की पीड़ा को कम करने और उपयोग किए जाने वाले पशुओं की संख्या को कम करने के सभी प्रयास किए गए। 3 महीने पुराने पुरुष ग्लिसिन एन-मेथिलट्रांसफर्स(जीएनएमटी) की कमी ( Gnmt[/

1. सेल तैयारी और Lysis

नोट: इसमें, Huh-7 (मानव hepatoma सेल लाइन) और THLE2 (मानव यकृत सेल लाइन) का उपयोग किया गया.

  1. 5% सीओ2-95% आर्द्रता के आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर मानक विकास मीडिया में P100 प्लेटों में कोशिकाओं को बनाए रखें।
  2. P100 प्लेटों में कोशिकाओं को 1.2-1.5 के घनत्व पर चढ़ाना में वृद्धि 106 कोशिकाओं प्रति डिश एक Neubauer हीमोसाइटोमेट्री गिनती कक्ष का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती द्वारा.
    1. संस्कृति Huh-7 DMEM में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-एम्फोटोरिकोरिन बी (पीएसए) और 1% glutamine के साथ पूरक.
    2. संस्कृति व्यंजन में संस्कृति THLE2 कोशिकाओं 0.01 mg/mL fibronectin के साथ पूर्व लेपित, 0.01 mg/mL गोवंश सीरम एल्बुमिन (BSA) और 0.03 mg/mL कोलेजन प्रकार मैं विकास माध्यम में भंग जो ब्रोन्कियल उपकला सेल विकास आधार माध्यम (BEGM) के साथ पूरक विकास कारक (0.4% BPE, 0.1% इंसुलिन, 0.1% hydrocortisone, 0.1% रेटिनोइक एसिड, 0.1% transferrin, 0.1% triiodothyronine के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 10% FBS, 1% पीएसए, 5 एनजी /
  3. प्रयोग के अंत बिंदु पर, प्लेटों से मीडिया aspirate और बाँझ 1x फॉस्फेट-बफर ्ड नमकीन (पीबीएस) के 5 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोने. Lyse कोशिकाओं को बर्फ पर रखा प्लेट पर सीधे lysis बफर के 500 डिग्री एल (50 एम एम Tris पीएच 8.5, 150 एमएम NaCl, 5 एमएम EDTA, 1% nonidet पी -40 (एनपी 40), पूर्ण EDTA मुक्त प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल और 50 डिग्री एम पीआर-619 प्रत्येक P100 डिश के लिए के साथ पूरक का उपयोग कर। एक सेल खुरचनी का उपयोग करना, धीरे Lysis माध्यम में थाली के नीचे से कोशिकाओं को परिमार्जन.
    नोट: सभी कोशिकाओं नेत्रहीन उपचार के बाद प्लेट बेस का निरीक्षण करके थाली से अलग है कि जाँच करें।
  4. वैकल्पिक रूप से, सेल मीडिया को प्रेरित करके ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा फसल कोशिकाओं और 1x (0.05%) के 1 एमएल जोड़ें थाली के लिए trypsin-EDTA, पर्याप्त कोशिकाओं को कवर करने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,और $ 5 मिनट के लिए 95% आर्द्रता सभी कोशिकाओं को थाली से अलग कर दिया है सुनिश्चित करने के लिए इनक्यूबेटर सेट में थाली रखने के लिए। trypsinization को रोकने के लिए पूर्व-गर्म विकास माध्यम के 2 एमएल जोड़ें। 10 मिनट के लिए 150 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और सुपरनेंट को प्रेरित करें। 1x पीबीएस और 10 मिनट के लिए 150 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के साथ धो लें। सुपरनेंट को स्प्रूट करने के बाद, 50 एमएल लाइसिस बफर (50 एमएम ट्रास पीएच 8.5, 150 एमएम नैकल, 5 एमएम ईएलटीए, 1% एनपी 40, पूर्ण EDTA-मुक्त प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल और प्रत्येक P100 डिश के लिए 50 डिग्री एम पीआर-619 के साथ पूरक जोड़ें।
    नोट: PR-619 के अलावा महत्वपूर्ण है.
  5. 15,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस. सुपरनेंट को किसी अन्य ट्यूब पर स्थानांतरित करें और गोली को त्याग दें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है, और नमूने आगे विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.

2. ऊतक तैयारी और Lysis

  1. पशु बलिदान पर, माउस जिगर इकट्ठा, ठंड पीबीएस के साथ धोने, और तरल नाइट्रोजन में तुरंत फ्रीज तस्वीर. आगे के विश्लेषण तक नमूनों को $80 डिग्री सेल्सियस स्टोर करें।
  2. Homogenize 75 तस्वीर से मिलीग्राम टुकड़े-frozen / या ताजा जिगर में बर्फ ठंडा lysis बफर के 1 एमएल (50 एमएम Tris पीएच 8.5, 150 एमएम NaCl, 5 एमएम EDTA, 1% NP40, पूर्ण EDTA मुक्त protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल और 50 सीएम पीआर-619) के साथ पूरक. 6500 x आरपीएम पर homogenizer चलाने के लिए, 2 x 60 प्रत्येक, एक 30 s ठहराव के साथ (सामग्री की तालिकादेखें).
  3. 10 मिनट के लिए 15, 500 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक माइक्रोफ्यूज में नमूनों को एक और ट्यूब में स्थानांतरित करें और गोली को त्याग दें।
  4. वैकल्पिक रूप से, तरल नाइट्रोजन में जमे हुए ऊतकों के 75 मिलीग्राम triturate. फिर 1 एमएल lysis बफर में ऊतक ठीक हो.
  5. 10 मिनट के लिए 15, 500 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक माइक्रोफ्यूज में नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनेंट को किसी अन्य ट्यूब में स्थानांतरित करें और गोली को त्याग दें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है, और नमूने आगे विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.

3. जीएसटी-SUBEs या जीएसटी नियंत्रण के बंधन Glutathione-Agarose मोती के लिए

नोट: जीएसटी-SUBEs या जीएसटी नियंत्रण के संश्लेषण इस पांडुलिपि के दायरे से बाहर हैं और पहले से प्रकाशित साहित्य20में समीक्षा की जा सकती है. वैकल्पिक रूप से, जीएसटी- और नियंत्रण SUBEs वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध हैं (उदा., SignalChem).

  1. ग्लूटाथिओन मनकों की तैयारी
    1. 70 मिलीग्राम लाइओफिलित ग्लूटाथिओन-अगारोस मोती में 1 एमएल डी-आयनीकृत पानी जोड़ें। चार डिग्री सेल्सियस (या कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए) पर रात भर मोती का पुनर्गठन।
    2. सूजन के बाद मोती को अच्छी तरह से धो लें (लैक्टोज और इथेनॉल को हटाने के लिए जो आमतौर पर lyophilized पाउडर agarose मोती में मौजूद हैं)। ऐसा करने के लिए, पहले 10 एमएल डी-आयनीकृत पानी या पीबीएस के साथ धोएं जिसके बाद कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन होता है। इसे तीन बार करें।
    3. 3 washes के बाद, एक 50% (v/v) घोल प्राप्त करने के लिए पीबीएस के 1 एमएल में मोती resuspend.
      नोट: यह खंड 10 नमूनों के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है.
  2. प्रत्येक नमूने के लिए, GST-SUBEs या GST नियंत्रण के 100 $g जोड़ें (संदर्भ20देखें ) glutathione मोती घोल के 100 डिग्री सेल्सियस और पीबीएस के 500 डिग्री एल करने के लिए।
    नोट: ब्याज के SUMOylated प्रोटीन की सापेक्ष बहुतायत पुल-डाउन के लिए इस्तेमाल किया जीएसटी-SUBEs की राशि निर्धारित करता है। प्रत्येक नए प्रयोगात्मक मॉडल के लिए, इनपुट, बाउंड, और प्रवाह के माध्यम से (एफटी) सामग्री का उपयोग करके या ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ या ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ पश्चिमी blotting द्वारा वास्तविक प्रयोग करने से पहले स्थिति का विश्लेषण (लाइवर Kinase B1 (LKB1).
  3. 3.2. में तैयार मोती के साथ सभी जीएसटी-SUBEs या जीएसटी नियंत्रण इनक्यूबेट करें, धीरे-धीरे रोटेटर या मिनी रोलर में घूर्णन (सामग्री की तालिकादेखें ) कम से कम 2 एच (धीमी बाइंडिंग प्रतिक्रिया) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: जोड़ने 1 एमएम dithiothreitol (DTT) glutathione मोती के लिए बाध्यकारी जीएसटी में सुधार.
  4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रण द्वारा agaros मोती पुनर्प्राप्त करें। अंत में, पीबीएस में मोती को 50% (v/v) घोल प्राप्त करने के लिए पुनः निलंबित कर दिया।
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है, और नमूने आगे विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.

4. जीएसटी पुल डाउन परख

  1. चरण 1.5, 2.3 या 2.5 के बाद, कुल मात्रा का 1/10 (उदा. 50 डिग्री सेल्सियस) लें और 3x उबलते बफर (250 एम एम ट्राइस-एचसीएल पीएच 6.8, 500 एमएम-मेरकैप्टोथेनोल, 50% ग्लिसरोल, 10% एसडीएस, ब्रोमोफेनॉल) की समान मात्रा में पतला करें। इस अंश को INPUT के रूप में माना जाता है।
  2. चरण 1.5, 2.3 या 2.5 से 100 डिग्री सेल्सियस ग्लूटाथिओन मोती घोल से स्पष्ट lysate के 450 $L जोड़ें। मोतियों के साथ लाइसेट को इनक्यूबेट करें, धीरे-धीरे कम से कम 2 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घूर्णन करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, चरण 1.5, 2.3 या 2.5 से कुल प्रोटीन के 100-200 $g 450 $L की कुल मात्रा में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर एक microfuge में मोती नीचे स्पिन और विश्लेषण के लिए supernatant इकट्ठा. कुल आयतन (उदा., 50 डिग्री सेल्सियस) का अंतरण एक पृथक ट्यूब में तथा 3x उबलते बफर के बराबर आयतन में पतला हो जाता है। यह अंश प्रवाह के माध्यम से (एफटी) अंश है.
  4. शेष नमूने को 1 एमएल बर्फ-ठंडा पीबीएस, 0.05% ट्वीन 20, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन और 1 मिनट के लिए 300 x ग्राम के साथ तीन बार धोएं। मोती SUBEs BOUND (SB) अंश के अनुरूप हैं।
  5. 3x उबलते बफर के 15 डिग्री एल और lysis बफर के 15 डिग्री एल के साथ नमूने को लागू करें। इसे BOUND भिन्न कहते हैं।

5. पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण द्वारा सूमो लक्ष्यों की पहचान और विशेषता

  1. पहले वर्णित के रूप में एक विरोधी SUMO2/3 एंटीबॉडी या पसंद के किसी भी अन्य विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रदर्शनकरतेहैं।

6. मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा सुमोयलेट प्रोटेओम की पहचान और विशेषता

नोट: मास-स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण के मामले में, नमूने Wisniewski एट अल द्वारा वर्णित फ़िल्टर-एडेड नमूना तैयारी (FASP) विधि का उपयोग कर संसाधित किए गएथे।

  1. मंच टिप C18 microcolumns का उपयोग करके पेप्टाइड्स Desalt और उन्हें में resuspend 0.1% formic एसिड (एफए) एमएस विश्लेषण से पहले.
  2. नमूनों को एलसी-एमएस प्रणाली पर लोड करें (सामग्री की तालिकादेखें ) और त्रिफला में उनका विश्लेषण करें (तकनीकी प्रतिकृतियां)(चित्र 2ख)
  3. एक संबद्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रोटीन पहचान और बहुतायत गणना के साथ पर ले.
  4. सांख्यिकीय विश्लेषण और हीटमैप उत्पादन के लिए, डेटा को पर्सियस प्लेटफ़ॉर्म (http://www.perseus.tufts.edu/hopper/) पर लोड करें. बहुतायत की तुलना के लिए एक क्रमचय-आधारित झूठी खोज दर (FDR)-सही टी-परीक्षण लागू करें। 2 से अधिक एक क्यू और एलटी के साथ प्रोटीन को समृद्ध24माना जाता था .
    नोट: कम से कम दो अलग पेप्टाइड्स के साथ की पहचान प्रोटीन अंतिम विश्लेषण में माना जाता है.

Representative Results

पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण द्वारा लिवर ट्यूमर बायोप्सी में एक विशिष्ट SUMOylation Substrate की पहचान

लिवर Kinase B1 (LKB1) SUMOylation हाल ही में जिगर के कैंसर9,25में एक महत्वपूर्ण oncogenic ड्राइवर होना दिखाया गया है. ग्लिसिन एन-मेथिलट्रांसफरेज(जीएनएमटी)में कमी वाले चूहे, जिसे अक्सर Gnmtके रूप में जाना जाता है,एक ऐसा मॉडल है जो सहज रूप से हेप्टोकोशिकीय कार्सिनोमा (एचसीसी) विकसित करता है, जो प्राथमिक यकृत कैंसर का सबसे आम प्रकार है। SUBEs को समृद्ध और दोनों Gnmtमें SUMOylated प्रोटीन को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया[/ चित्र 2कमें, तीन अलग-अलग भिन्न भागों (इनपुट, एफटी और बाउंड) के पोनाऊ एस धुंधला, SUBEs पुल-डाउन परख में प्राप्त शामिल हैं। एक Ponceau एस दाग पश्चिमी दाग द्वारा मूल्यांकन किया जा करने के लिए blotted प्रोटीन की लोडिंग पर एक संभव हानिकारक प्रभाव को नियंत्रित करने के लिए उपयोगी है. चित्र 2ब में अंतर्जात सुमोइलित LKB1 को कैप्चर करने के लिए SUBEs का उपयोग करके LKB1 का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण दिखाया गया है। LKB1 SUMOylation के स्तर जिगर ट्यूमर में संवर्धित कर रहे हैं. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के मामले में, समान भार और स्थानांतरित प्रोटीन इनपुट अंश के Ponceau धुंधला द्वारा मनाया गया और washes के बाद काफी बदल नहीं थे (अंश के माध्यम से प्रवाह). SUBEs के साथ कब्जा कर लिया प्रोटीन की मात्रा काफी अधिक था, विशेष रूप से ट्यूमर में. वैकल्पिक रूप से, Coomasie नीले रंग के साथ एक डुप्लिकेट जेल धुंधला इसी तरह की जानकारी प्रदान कर सकते हैं. कुछ प्रोटीन के p53 या SUMOylated रूपों जैसे चिपचिपा प्रोटीन जीएसटी नियंत्रण के लिए बाध्य हो सकता है। पृष्ठभूमि को दूर करने के लिए, कम घनत्व agarose मोती का उपयोग करें, बीएसए के साथ एक कोटिंग प्रदर्शन, या अतिरिक्त washes शामिल. हालांकि, यह इस तरह के मास स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में अनुप्रयोगों को प्रभावित कर सकता है और कम आत्मीयता बातचीत प्रोटीन के नुकसान में परिणाम हो सकता है.

मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण द्वारा मानव हेपेटोमा कोशिकाओं में सूमो इंटरैक्टोम की विशेषता

सुमो-ट्रैप की क्षमता की जांच करने के लिए स्वाभाविक रूप से सुमोयलेट प्रोटीन के साथ बातचीत करने के लिए, Huh-7 (मानव hepatoma) और गैर बदल जिगर उपकला मानव THLE2 सेल लाइनों का इस्तेमाल किया गया. पहला कदम SUBEs के साथ कब्जा कर लिया कुल सामग्री का दृश्य है और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में जीएसटी का उपयोग कर रहा है। इस प्रयोजन के लिए, हम पारंपरिक प्रोटीन धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं जैसा कि चित्र 3कमें दर्शाया गया है। फिर, हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण प्रदर्शन किया. Huh7 जीएसटी नमूनों (2339, 2297 और 2168 प्रत्येक लोड के लिए क्रमशः) में 2268 प्रोटीन की पहचान की गई, जबकि 2812 प्रोटीन Huh7 SUBEs नमूने (2815, 2817 और 2806) में औसत पर पहचान की गई. घटाव के बाद, 742 प्रोटीन SUBEs में समृद्ध थे. दूसरी ओर, THLE2 जीएसटी नमूनों (2476, 2520 और 2495, क्रमशः) और 2763 SUBEs (2823, 2783 और 2684) में 2497 प्रोटीन के औसत की पहचान की गई। इनमें से 577 को SUBEs नमूनों में समृद्ध माना गया था। तकनीकी प्रतिकृतियां का विश्लेषण चित्र 3bमें दिखाए गए हीटमैप को पुनः प्राप्त करता है, जिसकी गणना उपलब्ध डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स (यूक्लिडियन दूरी, औसत लिंकेज और कश्मीर-मंस के साथ पूर्व-प्रसंस्कृत) का उपयोग करके की गई थी। heatmap प्रत्येक सेल लाइन में 100 सबसे महत्वपूर्ण और विशेष रूप से समृद्ध प्रोटीन के वितरण को दर्शाया गया है.

Figure 1
चित्रा 1: यकृत कैंसर के अध्ययन के लिए विवो में संवर्धन, अलगाव और पहचान और सुमोइलित प्रोटीओम की विशेषता के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल प्रवाह चार्ट का योजनाबद्ध आरेख। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: Hepatotocellular Carcinoma के माउस मॉडल में SUMO-2 द्वारा LKB1 का संशोधन.
(क) तीन अलग-अलग भिन्न भागों (इनपुट, फ्लो थ्रू (एफटी) और बाउंड) का पोनाऊ एस धुंधला, जो सब्स पुल-डाउन परख में प्राप्त किया गया था। (ख)सूमो बाध्यकारी संस्थाओं (SUBEs) का उपयोग करके एलकेबी1 का पश्चिमी दाग विश्लेषण अंतर्जात सुमोइलित LKB1 को पकड़ने के लिए; GAPDH एक लोडहोज नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ट्यूमरल Huh-7 और गैर-परिवर्तित जिगर उपकला THLE2 मानव सेल लाइनों के बीच SUMOylated प्रोटीओम के बीच अंतर।
(क)कब्जा कर लिया प्रोटीन सामग्री के Sypro धुंधला, जीएसटी (नेगेटिव नियंत्रण) और SUBEs के साथ. (ग)हीटमैप में हुह-7 और THLE2 SUBE नमूनों में विभेदक रूप से समृद्ध प्रोटीनों का चित्रण किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इसमें, हमने यकृत कैंसर के विवो मॉडल में संवर्धन, अलगाव और पहचान और सुमोयलेत प्रोटीन के लक्षण के लिए SUBEs के उपयोग की रिपोर्ट करने वाली पद्धति का एक पूर्ण और विस्तृत विवरण प्रदान किया है। दोनों माउस जिगर ट्यूमर और मानव hepatoma कोशिकाओं में, हम सही ढंग से अलग करने और ब्याज की SUMOylated प्रोटीन की पहचान करने के लिए और SUMOylated प्रोटीओम और interactome के एक उच्च throughput लक्षण प्रदर्शन करने में सक्षम थे. यद्यपि SUBEs का संश्लेषण इस पांडुलिपि के दायरे से बाहर है, फिर भी अधिक जानकारी के लिए निम्नलिखित संदर्भों को26पर देखा जाना चाहिए . वर्णित प्रोटोकॉल तेजी से और बहुत संवेदनशील है और प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम SENPs inhibitors (पीआर-619) का उपयोग भी शामिल है. वैकल्पिक रूप में, रासायनिक आइसोप्टिडेस इनहिबिटर जैसे एनईएम (एन-एथिलमेलीमाइड) और आईएए (2-इडोएमैटाइड) lysis बफर में इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि, पिछले रिपोर्टों से पता चला है कि SUBEs प्रोटोकॉल के लिए, पीआर-619 का उपयोग अन्य के रूप में फायदेमंद है अवरोधक जीएसटी के साथ हस्तक्षेप करते हैं जो ग्लूटाथिओन मोती20के लिए बाध्यकारी है .

SUBEs पुनः संयोजक प्रोटीन है कि सिम के अग्रानुक्रम दोहराता शामिल हैं जिससे SUMO substrates के लिए समग्र संबंध में वृद्धि के साथ संशोधित प्रोटीन पर SUMO अणुओं को पहचानने. इसकी उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता के कारण, SUMOylated proteome के अलगाव के लिए SUBEs का उपयोग इस तरह के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग विशिष्ट SUMOylated प्रोटीन के पश्चिमी-ब्लॉट द्वारा पता लगाने के रूप में साहित्य में अन्य दृष्टिकोण के सापेक्ष फायदेमंद है ब्याज का प्रोटीन या सुमो अणुओं के विभिन्न हिस्टोडाइन टैग संस्करणों का उपयोग कर निकल क्रोमैटोग्राफी। हालांकि, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि के रूप में SUBEs प्रोटोकॉल गैर denaturing शर्तों के तहत किया जाता है, SUMOylated प्रोटीन और अन्य बातचीत प्रोटीन के बीच बातचीत बनाए रखा है. इसलिए, हम केवल SUMO interactome के बारे में जानकारी प्राप्त करने के बजाय केवल SUMOylated लक्ष्य प्रोटीन की एक सूची. इस प्रकार, आगे के प्रयोगों की पुष्टि करने के लिए यदि पहचान प्रोटीन एक SUMO लक्ष्य या एक बातचीत कारक है आवश्यक हैं. SUBEs की अन्य सीमा तथ्य यह है कि उपयोग किए गए जीएसटी जाल को नियंत्रित करने के लिए कई पृष्ठभूमि ऑक्सीडेटिव तनाव से संबंधित प्रोटीन पर कब्जा करने में सक्षम हैं। इस मुद्दे को विशेष रूप से तकनीक की उच्च संवेदनशीलता के कारण एमएस विश्लेषण के दौरान प्रासंगिक है. इन सीमाओं को पार करने के लिए बायोटिनलेट्ड सूमो-ट्रैप (बायोसब) को26विकसित किया गया है। SUBEs की एक अन्य सीमा तथ्य यह है कि हम केवल सूमो 2 और SUMO 3 द्वारा संशोधित प्रोटीन पर कब्जा करने में सक्षम हैं में रहता है जबकि SUMO 1-संशोधित प्रोटीन अलग नहीं किया जा सकता है.

SUBEs के उपयोग की अन्य चिंता प्रक्रिया के लिए आवश्यक प्रारंभिक सामग्री की मात्रा से संबंधित है। SUMOylated प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया प्रारंभिक सामग्री का पता लगाया विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों पर विचार करना चाहिए. जबकि बेसल SUMOylation विभिन्न सेलुलर संदर्भों में सूचित किया गया है, SUMOylation एक प्रक्रिया है कि दृढ़ता से कई तनाव की स्थिति के बाद प्रेरित है / इलाज के नमूनों बनाम अनुपचारित की तुलना करते हैं, तो एक स्तंभ संतृप्त नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए है, और मतभेद उन स्थितियों के बीच मनाया जा सकता है। माउस phenotypes हम विश्लेषण कर रहे हैं के मामले में, कोई उपचार इस्तेमाल किया गया है और बेसल SUMOylation स्तर कम कर रहे हैं. इस कारण से, प्रोटीन की उच्च मात्रा में इस्तेमाल किया गया. जीएसटी का उपयोग करके पृष्ठभूमि स्तर को नियंत्रित किया जाना चाहिए और यदि विशिष्ट बाइंडिंग अधिक है, तो प्रारंभिक सामग्री या बाइंडिंग समय की मात्रा कम की जानी चाहिए। एफटी अंश का विश्लेषण कब्जा दक्षता का संकेत हो सकता है भले ही इन जाल पाली-SUMOylated प्रोटीन पसंद करते हैं और कुल कमी की उम्मीद नहीं की जानी चाहिए, कुल SUMOylation की कमी सामान्य रूप से अच्छी तरह से मनाया जाता है जब कब्जा दक्षता है इष्टतम.

अंत में, SUBEs प्रौद्योगिकी के अन्य आवेदन वास्तविक समय सतह Plasmon अनुनाद (एसपीआर) सेल निष्कर्षों से SUMOylated प्रोटीन के साथ वास्तविक समय बातचीत की अनुमति के साथ SUBEs प्रौद्योगिकी का संयोजन भी शामिल है27. इसके अलावा, हाल ही में, biotinylated SUMO-ट्रैप (बायोसब) बड़े टैग करने के लिए जुड़े पृष्ठभूमि को कम करने के लिए लाभ के साथ विकसित किया गया है, उदा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के दौरान26. इसके अलावा, bioSUBE संस्करण बायोटिन के लिए बाध्यकारी स्ट्रेपटेविडिन के साथ अलग फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल का उपयोग करके फ्लोरोसेंट द्वारा जीवित कोशिकाओं में SUMOylated प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, SUMOylated प्रोटीन का पता लगाने और परिमाणीकरण के तरीकों दोनों जीएसटी और bioSUBEs संस्करणों के साथ विचार किया जा सकता है जैसे कि यह अग्रानुक्रम सबबीक्विटीन बाध्यकारी संस्थाओं (TUBEs)21के साथ किया गया था।

कुल मिलाकर, जिगर के कैंसर में प्रासंगिक SUMOylated proteome के अलगाव और विशेषता के लिए SUBEs का उपयोग एक तेज और संवेदनशील विधि जिगर के कैंसर में SUMOylation मार्ग की अभी भी बल्कि अज्ञात भूमिका पर विशाल जानकारी प्रदान है.

Disclosures

डॉ मार्टनेज़-चन्तर Mitotherapeutix LLC के लिए सलाह देते हैं।

Acknowledgments

यह काम Institut राष्ट्रीय du कैंसर, FRANCE, INCa अनुदान PLBIO16-251 (PLBIO16-251), CONACyT-एसआर (मैक्सिको) अनुदान 0280365 और Occitanie, फ्रांस (M.S.R.) के REPERE कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. इसके अलावा, NIH (अमेरिकी स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग)-R01AR001576-11A1, गोबिर्नो वास्को-डिपार्टमेंटो डी सालुड 2013111114 (M.L.M.-C करने के लिए), ELKARTEK 2016, Departamento de Industria del Gobierno Vasco, MINECO: SAF2017-87301-R integrado en el Estatal de Investigaci]n Cientifica y T$cnica y Innovaci]n 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER, BIOEF (बास्क फाउंडेशन फॉर इनोवेशन एंड हेल्थ रिसर्च): EITB Maratoia BIO15/ Instituto de Salud कार्लोस III:PIE14/ integrado en el Plan Estatal de Investigaci]n Cientifica y T$cnica y Innovaci]n 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER (M.L.M.-C), Asociaci]n Espa]ola एल सीजेआर (टी.सी.डी., एम.एल.एम.सी.) EASL (T.C.D करने के लिए), Fundaci]n Cient]fica de la Asociaci]n Espa$ola Contra el Cancer (AECC Scientific Foundation) दुर्लभ ट्यूमर कॉल 2017 (M.L.M करने के लिए), ला Caixa फाउंडेशन कार्यक्रम (M.L.M. करने के लिए). सीआईसी बायोगन (एसईवी-2016-0644) के लिए सेवरो ओको एक्सीलेंस प्रत्यायन के लिए हम मिंको को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(Gnmt−/−)/ (Gnmt+/+) mice CIC bioGUNE
0.5% Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
BEBM Lonza/Clonetics Corporation cc-3171
BEGM Bullet Kit Lonza/Clonetics Corporation CC3170
Bromophenol blue Sigma 115-39-9
BSA Sigma A4503
C18 microcolumns Millipore Z720070
Collagen type I Santa Cruz Biotechnology sc-136157
Complete tablets EDTA-free Roche 4693132001
DMEM Life Technologies A14431-01
DTT Sigma 43815
EDTA Sigma E6758
EGF Sigma e9644
FBS Life Technologies 10270
Fibronectin Life Technologies 33010018
Glutamine Life Technologies 25030-024
Glutathione agarose beads Sigma G4510
Glycerol Sigma G5516
GST-Control SignalChem G52-30H
GST-SUBEs SignalChem S291-340G
Huh7 CLS (Cell Lines Service) 300156 https://clsgmbh.de/
IAA (2-Iodoacetamide) Merck L58046844
LKB1 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-32245
Mini LabRoller Rotator LABNET H5500 https://www.labnetinternational.com
NaCl Merck 106404041000
nanoElute BRUKER https://www.bruker.com/
NEM (N-Ethylmaleimide) Sigma E3876
NP40 Fluka 74385
PBS Life Technologies 14190-094
Peaks software Bioinformatics Solutions Inc. http://www.bioinfor.com/
Phosphoetanolamine Sigma P0503
Ponceau S solution Sigma P7170
PR-619 Merck 662141
Precellys 24 Bertin Technologies P000669-PR240-A
PSA Life Technologies 151-40-122
PSG Life Technologies 10378-016
SDS Sigma L3771
SUMO2/3 antibody Abcam Ab3742
THLE-2 ATCC ATCC CRL-2706 http://www.lgcstandards-atcc.org
timsTOF Pro with PASEF mass spectrometer BRUKER https://www.bruker.com/
β-mercaptoethanol Sigma 60-24-2

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References

  1. Forner, A., Llovet, J. M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 379 (9822), 1245-1255 (2012).
  2. Gerbes, A., et al. Gut roundtable meeting paper: selected recent advances in hepatocellular carcinoma. Gut. , (2017).
  3. Avila, M. A., Berasain, C., Sangro, B., Prieto, J. New therapies for hepatocellular carcinoma. Oncogene. 25 (27), 3866-3884 (2006).
  4. Grotenbreg, G., Ploegh, H. Chemical biology: dressed-up proteins. Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).
  5. Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 17 (9), 581-595 (2016).
  6. Seeler, J. S., Dejean, A. SUMO and the robustness of cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (3), 184-197 (2017).
  7. Tomasi, M. L., et al. S-adenosyl methionine regulates ubiquitin-conjugating enzyme 9 protein expression and sumoylation in murine liver and human cancers. Hepatology. 56 (3), 982-993 (2012).
  8. Li, J., et al. Cbx4 governs HIF-1alpha to potentiate angiogenesis of hepatocellular carcinoma by its SUMO E3 ligase activity. Cancer Cell. 25 (1), 118-131 (2014).
  9. Zubiete-Franco, I., et al. SUMOylation regulates LKB1 localization and its oncogenic activity in liver cancer. EBioMedicine. 40, 406-421 (2019).
  10. Sarge, K. D., Park-Sarge, O. K. SUMO and its role in human diseases. Internationa Review of Cell and Molecular Biology. 288, 167-183 (2011).
  11. Da Silva-Ferrada, E., Lopitz-Otsoa, F., Lang, V., Rodriguez, M. S., Matthiesen, R. Strategies to Identify Recognition Signals and Targets of SUMOylation. Biochemical Research International. , 875148 (2012).
  12. Liang, Y. C., et al. SUMO5, a Novel Poly-SUMO Isoform, Regulates PML Nuclear Bodies. Science Reports. 6, 26509 (2016).
  13. Mikolajczyk, J., et al. Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs. Journal of Biologucal Chemistry. 282 (36), 26217-26224 (2007).
  14. Hilgarth, R. S., Sarge, K. D. Detection of sumoylated proteins. Methods in Molecular Biology. 301, 329-338 (2005).
  15. Vertegaal, A. C., et al. A proteomic study of SUMO-2 target proteins. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33791-33798 (2004).
  16. Bruderer, R., et al. Purification and identification of endogenous polySUMO conjugates. EMBO Reports. 12 (2), 142-148 (2011).
  17. Becker, J., et al. Detecting endogenous SUMO targets in mammalian cells and tissues. Nature Structural Molecular Biology. 20 (4), 525-531 (2013).
  18. Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nature Protocols. 9 (4), 896-909 (2014).
  19. Hendriks, I. A., et al. Site-specific characterization of endogenous SUMOylation across species and organs. Nature Communications. 9 (1), 2456 (2018).
  20. Da Silva-Ferrada, E., et al. Analysis of SUMOylated proteins using SUMO-traps. Science Reports. 3, 1690 (2013).
  21. Hjerpe, R., et al. Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities. EMBO Reports. 10 (11), 1250-1258 (2009).
  22. Embade, N., et al. Murine double minute 2 regulates Hu antigen R stability in human liver and colon cancer through NEDDylation. Hepatology. 55 (4), 1237-1248 (2012).
  23. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  24. Meier, F., et al. Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
  25. Ritho, J., Arold, S. T., Yeh, E. T. A Critical SUMO1 Modification of LKB1 Regulates AMPK Activity during Energy Stress. Cell Reports. 12 (5), 734-742 (2015).
  26. Lang, V., Da Silva-Ferrada, E., Barrio, R., Sutherland, J. D., Rodriguez, M. S. Using Biotinylated SUMO-Traps to Analyze SUMOylated Proteins. Methods in Molecular Biology. 1475, 109-121 (2016).
  27. Xolalpa, W., Rodriguez, M. S., England, P. Real-Time Surface Plasmon Resonance (SPR) for the Analysis of Interactions Between SUMO Traps and Mono- or PolySUMO Moieties. Methods in Molecular Biology. 1475, 99-107 (2016).

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जैव रसायन अंक 153 सूमो SUBEs लिवर कैंसर Hepatotocellular Carcinoma hepatoma मास-स्पेक्ट्रोमेट्री
लीवर कैंसर में सूमो प्रोटेओम के संवर्धन, अलगाव, पहचान, और विशेषता के लिए उपकरण के रूप में SUMO-Binding संस्थाओं (SUBEs)
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Lopitz-Otsoa, F., Delgado, T. C.,… More

Lopitz-Otsoa, F., Delgado, T. C., Lachiondo-Ortega, S., Azkargorta, M., Elortza, F., Rodríguez, M. S., Martínez-Chantar, M. L. SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer. J. Vis. Exp. (153), e60098, doi:10.3791/60098 (2019).

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