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Chemistry

Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie-Techniken zur Bestimmung der Struktur und Mechanismen der Metallionenerkennung und Redox-Aktivität von Metallbindungsoligopeptiden

Published: September 7, 2019 doi: 10.3791/60102
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Texas A&M University-Commerce

Summary

Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie und molekulare Modellierungstechniken können die selektive Metallchelating-Performance von entworfenen metallbindenden Peptiden und dem kupferbindenden Peptid-Methanobactin charakterisieren. Die Entwicklung neuer Klassen von Metallchelat-Peptiden wird dazu beitragen, Therapeutika für Krankheiten im Zusammenhang mit Metallionen-Misbalance.

Abstract

Die Elektrospray-Ionisation (ESI) kann einen wässrigen Peptid- oder Peptidkomplex in die Gasphase übertragen und gleichzeitig seine Masse, Gesamtladung, Metallbindungswechselwirkungen und Konformationsform erhalten. Die Kopplung von ESI mit der Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie (IM-MS) bietet eine instrumentelle Technik, die die gleichzeitige Messung des Masse-zu-Lade- (m/z) und des Kollisionsquerschnitts (CCS) eines Peptids ermöglicht, die sich auf seine Stoiximetrie, Protonationszustand, und konforme Form. Die Gesamtladung eines Peptidkomplexes wird durch die Protonierung von 1) den sauren und grundlegenden Stellen des Peptids und 2) dem Oxidationszustand des Metallions(en) gesteuert. Daher ist der Gesamtladungszustand eines Komplexes eine Funktion des pH-Werts der Lösung, die die Peptide MetallionenbindungAffinität beeinflusst. Für ESI-IM-MS-Analysen werden Peptid- und Metallionenlösungen aus wässrigen Lösungen hergestellt, wobei der pH-Wert mit verdünnter wässriger Essigsäure oder Ammoniumhydroxid eingestellt wird. Dadurch können pH-Abhängigkeit und Metallionenselektivität für ein bestimmtes Peptid bestimmt werden. Darüber hinaus können die m/z und CCS eines Peptidkomplexes mit B3LYP/LanL2DZ molekularer Modellierung verwendet werden, um Bindungsstellen der Metallionenkoordination und tertiären Struktur des Komplexes zu erkennen. Die Ergebnisse zeigen, wie ESI-IM-MS die selektive Chelaterfüllung einer Reihe alternativer Methanobactin-Peptide charakterisieren und mit dem kupferbindenden Peptid-Methanobactin vergleichen kann.

Introduction

Kupfer- und Zinkionen sind für lebende Organismen unerlässlich und entscheidend für Prozesse wie oxidativen Schutz, Gewebewachstum, Atmung, Cholesterin, Glukosestoffwechsel und Genom-Lesung1. Um diese Funktionen zu ermöglichen, integrieren Gruppen wie das Thiolat von Cys, Imidazol seiner2,3, (seltener) Thioether von Methionin und Carboxylat von Glu und Asp selektiv Metalle als Kofaktoren in die aktiven Metalloenzyme. Die Ähnlichkeit dieser Koordinierungsgruppen wirft eine faszinierende Frage auf, wie die Seine und Cys-Liganden selektiv entweder Cu(I/II) oder Zn(II) integrieren, um ein korrektes Funktionieren zu gewährleisten.

Selektive Bindung erfolgt häufig durch Erwerb und Handel Peptide, die Zn(II) oder Cu(I/II) Ionenkonzentrationen steuern4. Cu(I/II) ist sehr reaktiv und verursacht oxidative Schäden oder zufällige Bindung an Enzyme, so dass seine freie Konzentration durch Kupferchaperones und kupferregulierende Proteine streng reguliert wird, die es sicher an verschiedene Stellen in der Zelle und fest transportieren. seine Homöostasekontrollieren 5,6. Störungen des Kupferstoffwechsels oder der Homöostase sind direkt in Menkes und Wilsons Krankheit7 sowieKrebserkrankungen 7 und neuronale Erkrankungen wie Prion8 undAlzheimer-Krankheit 9involviert.

Wilson-Krankheit ist verbunden mit erhöhten Kupferspiegeln in den Augen, Leber und Abschnitten des Gehirns, wo die Redox-Reaktionen von Cu(I/II) reaktive Sauerstoffspezies produzieren, was hepatolenticularundäre und neurologische Degeneration verursacht. Bestehende Chelationstherapien sind die kleine Thiol-Aminosäure Penicillamin und Triethylenetetramine. Alternativ weisen die methanotrophen Kupfer-Akquise-Peptide Methanobactin (mb)10,11 aufgrund ihrer hohen Bindungsaffinität zu Cu(I)12therapeutisches Potenzial auf. Als das Methanobactin (mb-OB3b) von Methylosinus trichosporium OB3b in einem Tiermodell der Wilson-Krankheit untersucht wurde, wurde Kupfer effizient aus der Leber entfernt und über die Galleausgeschieden 13. In-vitro-Experimente bestätigten, dass mb-OB3b das Kupfer aus dem kupfernen Metallothionein, das im Leberzytosolenthalten ist, chelatierenkonnte 13 . Laserablation induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie-Bildgebungstechniken haben die räumliche Verteilung von Kupfer in Wilsons Krankheitsleberproben14,15,16 untersucht und gezeigt, dass mb-OB3b entfernt das Kupfer mit kurzen Behandlungsperioden von nur 8 Tagen17.

Die mb-OB3b bindet auch mit anderen Metallionen, einschließlich Ag(I), Au(III), Pb(II), Mn(II), Co(II), Fe(II), Ni(II) und Zn(II)18,19. Der Wettbewerb um die physiologische Cu(I)-Bindungsstelle wird von Ag(I) ausgestellt, weil er Cu(I) aus dem mb-OB3b-Komplex verdrängen kann, wobei sowohl Ag(I) als auch Ni(II) eine irreversible Bindung an Mb aufweisen, die nicht durch Cu(I)19verdrängt werden kann. Kürzlich wurden eine Reihe alternativer Methanobactin (amb) Oligopeptide mit dem Bindungsmotiv 2His-2Cys20,21, und ihre Zn(II) und Cu(I/II) Bindungseigenschaften charakterisiert. Ihre primären Aminosäuresequenzen sind ähnlich, und sie alle enthalten das 2His-2Cys Motiv, Pro und einen acetylierten N-Terminus. Sie unterscheiden sich hauptsächlich von mb-OB3b, da das 2His-2Cys-Motiv die beiden Enethiol-Oxazolon-Bindungsstellen von mb-OB3b ersetzt.

Die Elektrospray-Ionisierung in Verbindung mit der Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie (ESI-IM-MS) sorgt für eine leistungsstarke Instrumentaltechnik zur Bestimmung der Metallbindungseigenschaften von Peptiden, da sie deren Massen-Zu-Ladung (m/z) und Kollisionmisst Querschnitt (CCS) unter Beibehaltung ihrer Masse, Ladung und Konformationsform aus der Lösungsphase. Die m/z und CCS beziehen sich auf die Peptide Stoichiometrie, Protonationszustand und Konformationsform. Die Stoichiometrie wird bestimmt, da die Identität und Anzahl jedes elements, das in der Art vorhanden ist, explizit identifiziert wird. Die Gesamtladung des Peptidkomplexes bezieht sich auf den Protonationszustand der sauren und grundlegenden Stellen und den Oxidationszustand der Metallionen. Das CCS gibt Auskunft über die konforme Form des Peptidkomplexes, da es die rotationsgemittelte Größe misst, die sich auf die tertiäre Struktur des Komplexes bezieht. Der Gesamtladungszustand des Komplexes ist auch eine Funktion des pH-Werts und wirkt sich auf die Metallionenbindungsaffinität des Peptids aus, da die deprotonierten Basis- oder Saurierstellen wie Carboxyl, His, Cys und Tyr auch die potenziellen Bindungsstellen für das Metallion sind. Für die Analysen werden Peptid und Metallion in wässrigen Lösungen mit dem pH-Wert durch verdünnte wässrige Essigsäure oder Ammoniumhydroxid eingestellt. Dadurch können die pH-Abhängigkeit und die Metallionenselektivität für das Peptid bestimmt werden. Darüber hinaus können die von ESI-IM-MS ermittelten m/z und CCS mit B3LYP/LanL2DZ molekularer Modellierung verwendet werden, um die Art der Metallionenkoordination und die tertiäre Struktur des Komplexes zu ermitteln. Die in diesem Artikel gezeigten Ergebnisse zeigen, wie ESI-IM-MS die selektive Chelaterfüllung eines Satzes von Amb-Peptiden charakterisieren und mit dem Kupferbindenden Peptid mb-OB3b vergleichen kann.

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Protocol

1. Herstellung von Reagenzien

  1. Kultur Methylosinus trichosporium OB3b, isolieren Sie die Cu(I)-freie mb-OB3b18,22,23, gefrieren-trocknen Sie die Probe und lagern Sie bei -80 °C bis zum Gebrauch.
  2. Synthetisieren Sie die Amb-Peptide (>98% Reinheit für amb1, amb2, amb4; >70% Reinheit für amb7), gefrieren-trocknen Sie die Proben, und lagern Sie sie bei -80 °C bis zur Verwendung.
  3. Kauf >98% Reinheitsmangan(II)chlorid, Kobalt(II)chlorid, Nickle(II)chlorid, Kupfer(II)chlorid, Kupfer(II) Nitrat, Silber(I) Nitrat, Zink(II)chlorid, Eisen(III)chlorid und Blei(II)chlorid.
  4. Kaufen Sie die Poly-DL-Alaninpolymere, die als Kalibrame zur Messung der Kollisionsquerschnitte der Amb-Arten und HPLC-Grade oder höhere ammoniumhydroxid, Eisessigsäure und Acetonitril verwendet werden.

2. Vorbereitung der Lagerlösung

  1. Peptid-Lagerlösung
    1. Wiegen Sie genau, mit mindestens drei signifikanten Zahlen, die Masse von 10,0–20,0 mg der mb-OB3b oder amb in einer 1,7 ml Kunststoff-Durchstechflasche.
      HINWEIS: Die gewogene Masse sollte je nach Löslichkeit des Peptids entweder 12,5 mM oder 1,25 mM ergeben, wenn 1,00 ml deionisiertes (DI) Wasser zugegeben wird.
    2. Mit einer Pipette 1,00 ml entionisiertes Wasser (>17,8 Mio.) in die gewogene Peptidprobe geben, um entweder die 12,5 mM- oder 1,25 mM-Lösung zu erhalten. Kappe sicher aufstellen und mit mindestens 20 Inversionen gründlich vermischen.
    3. Mit einem Mikropipet 50,0 L Aliquots aus der Peptidprobe in einzeln markierte 1,5 ml Durchstechflaschen geben und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern.
  2. Metallionen-Lagerlösungen
    1. Mit mindestens drei signifikanten Zahlen die Masse von 10,0–30,0 mg des Metallchlorids oder Silbernitrats in einer 1,7 ml Durchstechflasche genau wiegen.
      HINWEIS: Die gewogene Masse sollte 125 mM ergeben, wenn 1,00 ml DI-Wasser zugegeben wird.
    2. Fügen Sie die 1,00 ml DI-Wasser in die gewogene Metallprobe in die 1,7 ml-Durchstechflasche ein, um die 125 ml Lösung zu erhalten. Kappe sicher aufstellen und mit mindestens 20 Inversionen gründlich vermischen.
  3. Ammoniumhydroxid-Stammlösungen:Bereiten Sie eine 1,0 M Essigsäurelösung vor, indem Sie 57 l der 99,5%igen Essigsäurelösung mit DI-Wasser auf ein Endvolumen von 1,00 ml verdünnen. Bereiten Sie eine 1,0 M Ammoniumhydroxid-Lösung vor, indem Sie 90 l der 21%igen Ammoniumhydroxidlösung mit DI-Wasser auf ein Endvolumen von 1,00 ml verdünnen. Machen Sie zwei aufeinanderfolgende Verdünnungen jeder Lösung, indem Sie 100 l der 1,0 M Lösungen zur Herstellung von 0,10 M und 0,010 M Essigsäure- und Ammoniumhydroxidlösungen einnehmen.
  4. Poly-DL-Alanin-Stammlösung:Bereiten Sie das Poly-DL-Alanin (PA) mit einem Gewicht von 1,0 mg PA vor und lösen Sie es in 1,0 ml DI-Wasser auf, um 1.000 ppm zu geben. Mischen Sie gründlich. Mit hilfe einer Mikropipet, geben Sie 50,0 L Aliquots, und legen Sie jeweils in eine 1,7 ml Durchstechflasche und lagern Sie bei -80 °C.

3. Elektrospray-Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie-Analyse

  1. Reinigen Sie die ESI-Eingangsschläuche und Nadelkapillare gründlich mit ca. 500 l 0,1 M Eisessigsäure, 0,1 M Ammoniumhydroxid und schließlich DI-Wasser.
  2. Einen 50,0 L-Aliquot der 1.000 ppm PA-Lagerlösung auftauen und mit 450 l DI-Wasser verdünnen, um eine 100 ppm PA zu erhalten. Pipetten Sie 100,0 l dieser Lösung und verdünnen Sie sie auf 1,00 ml mit 500 l DI-Wasser und 500 l Acetonitril, um 10 ppm PA-Lösung zu geben.
  3. Sammeln Sie die negativen und positiven Ionen-IM-MS-Spektren der 10 ppm PA-Lösung für jeweils 10 min unter Verwendung nativer ESI-IM-MS-Bedingungen, wie im Diskussionsabschnitt beschrieben.
  4. Eine 50,0 L Aliquot der 12,5 mM oder 1,25 mM amb-Stammlösung auftauen und aufeinanderfolgende Verdünnungen mit DI-Wasser vornehmen, um eine Endkonzentration von 0,125 mM amb zu ergeben. Jede Verdünnung gründlich vermischen.
  5. Pipetten Sie 100,0 l der 125 mM Metallionen-Stammlösung, in eine 1,7 ml Durchstechflasche geben und mit DI-Wasser auf 1,00 ml verdünnen, um 12,5 mM Metallionen zu geben. Wiederholen Sie dies mit zwei weiteren aufeinanderfolgenden Verdünnungen, um eine endgültige Metallionenkonzentration von 0,125 mM zu ergeben. Jede Verdünnung gründlich vermischen.
  6. Pipetten Sie 200,0 l der 0,125 mM amb in eine 1,7 ml Durchstechflasche, verdünnen Sie sie mit 500 l DI-Wasser und mischen Sie die Lösung gründlich.
  7. Stellen Sie den pH-Wert der Probe auf 3,0 ein, indem Sie 50 l 1,0 M Essigsäurelösung hinzufügen.
  8. Fügen Sie der pH-angepassten Probe 200,0 l des 0,125 mM-Metallionens hinzu. Di-Wasser hinzufügen, um ein Endvolumen von 1,00 ml der Probe zu ergeben, gründlich mischen und die Probe 10 min bei RT ausdemieren lassen.
  9. Mit einer stumpfen Nasenspritze nehmen Sie 500 l der Probe und sammeln Sie die negativen und positiven Ionen-ES-IM-MS-Spektren für jeweils 5 min. Verwenden Sie die restlichen 500 l der Probe, um den endgültigen pH-Wert mit einer kalibrierten Mikro-pH-Elektrode aufzuzeichnen.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 3.6–3.9, während Sie Schritt 3.7 ändern, um den pH-Wert auf 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 oder 10,0 anzupassen, indem Sie neue Volumina der Lösungen 0,010 M, 0,10 M oder 1,0 M Essigsäure oder Ammoniumhydroxid hinzufügen.
  11. Sammeln Sie die negativen und positiven Ionen-ESI-IM-MS-Spektren der 10 ppm PA-Lösung für jeweils 10 min.

4. Vorbereitung der Metallionentitration von Ambproben

  1. Führen Sie die in den Schritten 3.1–3.5 beschriebenen Schritte aus.
  2. Pipetten Sie 200,0 l der 0,125 mM amb in eine 1,7 ml Durchstechflasche, verdünnen Sie sie mit 500,0 l DI-Wasser und mischen Sie die Lösung gründlich.
  3. Stellen Sie den pH-Wert der Probe auf pH = 9,0 ein, indem Sie 80 l der 0,010 M Ammoniumhydroxidlösung hinzufügen.
  4. Fügen Sie 28 l der 0,125 mM Metallionenlösung hinzu, um 0,14 Moläquivalente des Metallionens zu geben, DI-Wasser hinzuzufügen, um das Endvolumen der Probe 1,00 ml zu machen, gründlich zu mischen und die Probe 10 min bei RT ausgleichen zu lassen.
  5. Mit einer stumpfen Nasenspritze nehmen Sie 500 l der Probe und sammeln Sie die negativen und positiven Ionen-ESI-IM-MS-Spektren für jeweils 5 min. Verwenden Sie die restlichen 500 l der Probe, um den endgültigen pH-Wert mit einer kalibrierten Mikro-pH-Elektrode aufzuzeichnen.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 4.2–4.5, während Sie Schritt 4.3 ändern, um ein entsprechendes Volumen der 0,125 mM Metallionenlösung hinzuzufügen, um entweder 0,28, 0,42, 0,56, 0,70, 0,84, 0,98, 1,12, 1,26 oder 1,40 Moläquivalente zu erhalten.
  7. Sammeln Sie die negativen und positiven Ionen-IM-MS-Spektren der 10 ppm PA-Lösung für jeweils 10 min.

5. Analyse der ESI-IM-MS pH-Titrationsdaten

  1. Aus den IM-MS-Spektren wird ermittelt, welche geladenen Arten von Ambs vorhanden sind, indem sie sie mit ihren theoretischen m/z-Isotopenmustern abgleichen.
    1. Öffnen Sie MassLynx und klicken Sie auf Chromatogramm, um das Chromatogramm-Fenster zu öffnen.
    2. Gehen Sie zum Menü Datei und Öffnen, um die IM-MS-Datendatei zu suchen und zu öffnen.
    3. Extrahieren Sie das IM-MS-Spektrum, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Chromatogramm klicken und es loslassen. Das Spektrumfenster wird geöffnet, das das IM-MS-Spektrum anzeigt.
    4. Klicken Sie im Spektrumfenster auf Werkzeuge und Isotope Modell. Geben Sie im Isotopenmodellierungsfenster die Molekularformel der amb-Arten ein, aktivieren Sie das Feld Geladene Ionen anzeigen, und geben Sie den Ladezustand ein. Klicken Sie auf OK.
    5. Wiederholen Sie dies, um alle Arten im IM-MS-Spektrum zu identifizieren und ihren m/z-Isotopenbereich aufzuzeichnen.
  2. Trennen Sie für jede amb-Art alle zufälligen m/z-Arten und extrahieren Sie ihre Ankunftszeitverteilungen (ATD) unter Verwendung ihrer m/z-Isotopenmuster, um sie zu identifizieren.
    1. Klicken Sie in MassLynx auf DriftScope, um das Programm zu öffnen. Klicken Sie in DriftScope auf Datei und Öffnen, um die IM-MS-Datendatei zu suchen und zu öffnen.
    2. Verwenden Sie die Maus und klicken Sie mit der linken Maustaste, um das m/z Isotopenmuster der amb-Arten zu vergrößern.
    3. Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug und die linke Maustaste, um das Isotopenmuster auszuwählen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Aktuelle Auswahl akzeptieren.
    4. Um alle zufälligen m/z-Arten zu trennen, verwenden Sie das Auswahlwerkzeug und die linke Maustaste, um das ATD mit dem Isotopmuster der amb-Arten auszurichten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Aktuelle Auswahl akzeptieren.
    5. Um die ATD zu exportieren, gehen Sie zu Datei | Exportieren Sie nach MassLynx, dann wählen Sie Drift Time beibehalten und speichern Sie die Datei in einem entsprechenden Ordner.
  3. Bestimmen Sie den Schwerpunkt der ATD und integrieren Sie das Gebiet unter der ATD-Kurve als Maß für die Artenpopulation.
    1. Im Chromatogramm-Fenster von MassLynx öffnen Sie die gespeicherte exportierte Datei. Klicken Sie auf Prozess | Integrieren Sie aus dem Menü. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen ApexTrack Peak Integration, und klicken Sie auf OK.
    2. Zeichnen Sie den Schwerpunkt ATD (tA) und den integrierten Bereich auf, wie im Chromatogrammfenster gezeigt. Wiederholen Sie dies für alle gespeicherten amb- und PA IM-MS-Datendateien.
  4. Verwenden Sie die integrierte ATD für alle extrahierten Amb-Arten der positiven oder negativen Ionen an jedem Titrationspunkt, um sich auf eine relative prozentuale Skala zu normalisieren.
    1. Geben Sie die Identitäten der amb-Art und ihre integrierte ATD bei jedem pH-Wert in eine Tabelle ein.
    2. Verwenden Sie für jeden pH-Wert die Summe der integrierten ATDs, um die ATD der einzelnen amb auf eine prozentuale Skala zu normalisieren.
    3. Plotten Sie die prozentualen Intensitäten jeder Amb-Art im Vergleich zum pH-Wert in einer Grafik, um zu zeigen, wie die Population jeder Art je nach pH-Wert variiert.

6. Kollisionsquerschnitte

  1. Konvertieren Sie mithilfe einer Kalkulationstabelle die CCSs ()) von PA-Negativ25,26 und positiven27 Ionen, gemessen in He Puffergas28, in korrigiertes CCS(c) mit Gleichung 1 unten, wobei: z = Ionenladung; e c = Elektronenladung (1,602 x 10-19 C); m N 2 = Masse vonN2 Gas (Da); und mion = Ionenmasse. 29

Equation 1

  1. Konvertieren Sie die durchschnittlichen Ankunftszeiten (tA) der PA-Kalibrazianten und Amb-Arten in Driftzeiten (tD) unter Verwendung von Gleichung 2 unten, wobei: c = der erhöhte Ztastzyklus-Delay-Koeffizient (1,41) und m/z die Masse-zu-Ladung des Peptid-Ions ist.

Equation 2

  1. Zeichnen Sie die PA-Kalibratoren' tD vs. ihrec. Bestimmen Sie dann anhand einer Regressionsanpassung der nachstehenden Gleichung 3 die A'- und B-Werte, wobei: A' die Korrektur der Temperatur-, Druck- und elektrischen Feldparameter ist; und B kompensiert die nichtlineare Wirkung des IM-Geräts.

Equation 3

  1. Unter Verwendung dieser A' und B-Werte und des Zentroiden t D-Werts aus dem ATD der ambs bestimmen sie ihrec mit Gleichung 3 und ihre mit Gleichung 1. Diese Methode bietet CCS für die Peptidarten mit geschätzten absoluten Fehlern von etwa 2%25,26,27.

7. Berechnungsmethoden

  1. Verwenden Sie die Theorieebene B3LYP/LanL2DZ, bestehend aus den Becke 3-Parameter-Hybridfunktionen30 und dem Dunning-Basissatz31 und den Elektronenkernpotentialen32,33,34, um geometrieoptimierte Konformer für alle möglichen Koordinationsarten der beobachteten m/z amb Art35.
    HINWEIS: Details zum Erstellen und Übermitteln von Berechnungen finden Sie in der GaussView-Verwendung in Der Zusatzdatei.
  2. Vergleichen Sie die vorhergesagte freie Energie der einzelnen Konformer und berechnen Sie ihre theoretischen CCS mit der ionenskalierten Lennard-Jones (LJ)-Methode aus dem Sigma-Programm36.
  3. Aus den niedrigsten freien Energiekonformern bestimmen, welche Konformere den LJ CCS aufweisen, der mit dem im-MS gemessenen CCS übereinstimmt, um die tertiäre Struktur und Art der Koordination für die im Experiment beobachteten Konformer zu identifizieren.

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Representative Results

Metallbindung von amb1
Die IM-MS-Studie20 von amb1 (Abbildung 1A) zeigte, dass sowohl Kupfer- als auch Zinkionen, die auf pH-abhängige Weise an amb1 gebunden sind (Abbildung 2). Kupfer und Zink sind jedoch durch unterschiedliche Reaktionsmechanismen an verschiedenen Koordinationsstellen an amb1 gebunden. Das Hinzufügen von Cu(II) zu amb1 führte beispielsweise zur Oxidation von amb1 (amb1ox) durch Disulfidbrückenbildung, und bei einem pH-Wert von >6 wurde das [amb1ox-3H+Cu(II)]- Ion (Abbildung 2A) gebildet. Dies deutete auf die Deprotonation von zwei Imidazoliumen, der Carboxylgruppe, und zwei weiteren Standorten hin, die Cu(II) koordinierten.

Die molekulare Modellierung des [amb 1ox-3H+Cu(II)]-Ions mit B3LYP/LanL2DZ ergab, dass der niedrigste Energiekomplex Cu(II) über das Imidazol N seiner 1 und die deprotonierten Stickstoffe der Backbone-Amidgruppen von Cys 2 koordiniert wurde. und Gly3. Unterhalb eines pH-Wertes von 6 bildete das Hinzufügen von Cu(II) zu amb1 jedoch ein m/z-Isotopenmuster, das nur durch Cu(I)-Bindung berücksichtigt werden konnte, wodurch die [amb1ox+Cu(I)]+ ion(Abbildung 2B) gebildet wurde. Im Gegensatz dazu führte ein pH-Wert von mehr als 6 dazu, dass das m/z-Isotopenmuster um 1 m/z abnahm, was durch das positiv geladene [amb1ox-H+Cu(II)]+ ion verursacht wurde. Das Hinzufügen von Zn(II) oxidierte amb1nicht, und die Zn(II)-Bindung wurde bei einem pH-Wert von >6 beobachtet, was in erster Linie das [amb13H+Zn(II)]- Ion (Abbildung 2C) bildete. Dies deutete auf die Deprotonation der Imidazolium-, Thiol- und Carboxylgruppen hin. Die molekulare Modellierung des Ions [amb1x 3H+Zn(II)]ermittelte die unterste Energiekonforme entweder als tetraeder Zn(II)-Koordination über 2His-2Cys oder His-2Cys und das Carboxylat des C-Terminus.

Mehrfache Cu(I)-Bindung von amb2
Die Redoxreaktionen zwischen Cu(II) und amb2 (Abbildung 1B) führten zu Cu(I)-Bindung. Dies wurde mit IM-MS, UV-Vis Spektrophotometrie und B3LYP molekularer Modellierung37genauer untersucht. Die Hauptprodukte der Cu(II)-Titration von amb2 bei einem pH-Wert von 5 waren dieAmb-2-Oxidation (durch Disulfidbrückenbildung) und die nicht oxidiertenAmb-2-Arten, die drei Cu(I)-Ionen koordinierten.

Eine Suche nach der B3LYP/LanL2DZ-Methode lokalisierte zwei Niedrigenergiekomplexe, die sich um die koordinierte Art 3Cu(I) handelten. Der erste war der in Abbildung 3Adargestellte Komplex, in dem die 3Cu(I)-Ionen über die Brückentholatgruppen38 der Zyen2 und Cys6 (seiner1) sowie n1 und N5 (seiner 5) koordiniert wurden. ). Der zweite Komplex (3c) hat eine Salzbrücke zwischen der protonierten 1-Seiten-Gruppe und c-terminal carboxylat-Gruppe. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass bei einem pH-Wert von 3,0–6,0 der Hauptkomplex amb2+3Cu(I) die salzbrückende Struktur ist, die mit nur minimaler struktureller Umlagerung erfolgreich von der Lösung in die Gasphase übertragen werden kann.

Das theoretische LJ CCS von 209 x 6 x2, berechnet mit dem Sigma-Programm36 für komplexe 3c, abgestimmt mit dem IM-MS gemessenen CCS, was darauf hindeutet, dass 3c [amb22H +3Cu(I)]+ Konformation bei pH 3.0-6.0 darstellt. Bei einem pH-Wert von >6 wurde dieser Komplex jedoch von IM-MS nicht beobachtet, wahrscheinlich weil eine weitere Deprotonation seiner1 (pKa= 6,0) zu einem insgesamt neutralen Komplex führt. Sobald die Imidazoleum-Gruppe von Seinem1 deprotoniert ist, kann 3Cu(I)-Koordination zu den überbrückenden Tholatgruppen von Cys2 und Cys6 sowie N1 und N5 seiner1 und Seiner5umwandeln. bzw. (3a).

Die pH-Abhängigkeit von amb4 Cu(I/II)-Bindungs- und Redoxaktivität
Die IM-MS- und B3LYP-Techniken wurden verwendet, um die Cu(II) und pH-Titrationen von amb4 (Abbildung 1C) zu untersuchen und Monomer-, Dimer-, Trimmer- und Tetramerkomplexe von amb4 mit bis zu drei Cu(I)-Ionen oder zwei Cu(II) ) Ionen für jede Monomer-Untereinheit39. Die Komplexe enthielten auch eine Reihe von Disulfidbrücken, und diese Produkte wurden unabhängig davon hergestellt, ob die Cu(II)-Reaktionen mit amb4 in anaeroben oder aeroben wässrigen Lösungen durchgeführt wurden.

Mit der IM-MS-Technik wurde gezeigt, dass diese einzelnen Arten getrennt und quantifiziert werden konnten, auch wenn sie aufgrund von Unterschieden in ihren Ankunftszeiten überlappende Isotopenmuster hatten (Abbildung 4). Die Identifizierung und Quantifizierung dieser eng verwandten Arten ist eine Aufgabe, die keine andere instrumentelle oder analytische Technik erfüllen kann. Diese IM-MS-Studien liefern einen erheblichen Einblick in die pH-abhängigen Redoxreaktionen und identifizierten genau die Anzahl der inter- oder intramolekularen Disulfidbrücken, die Anzahl der Cu(I) oder Cu(II)-Ionen und die Anzahl der Deprotonationsstellen in jedem der Komplexe ( Abbildung 5).

Darüber hinaus ermöglichte die Messung der Komplexe CCS auch die Bestimmung der einzelnen Arten konformen Größe, die mit einer umfangreichen B3LYP/LanL2DZ-Suche verwendet wurde, um Konforme mit Strukturen zu lokalisieren, die mit den richtigen molekularen Stoichiometrie und CCS gemessen mit IM-MS. Durch diese Methode wurde die Cu(I/II) Koordination der verschiedenen Komplexe identifiziert. Die Reaktionen zwischen Cu(II) und amb4 umfassten die Bildung von Dimern, Trimmern und Tetrameren, die je nach pH-Wert der Lösung entweder Cu(I) oder Cu(II) koordinierten.

Bei leicht sauren Lösungen (pH = 3,0–6,0) beispielsweise gebundenen sie in erster Linie Cu(I)-Ionen und wurden nicht oxidiert, während sie in leicht basismäßigen Lösungen (pH = 8,0–11,0) hauptsächlich Cu(II)-Ionen gebunden und von allen Cys oxidiert wurden, die Disulfid bildeten. Anleihen (Abbildung 6). Das B3LYP/LanL2DZ stellte fest, dass die Cu(I)-Ionen linear waren und von den Thiolate- und Imidazol-Gruppen überbrückt wurden, während die Cu(II)-Ionen durch verzerrte T-förmige oder quadratische planare Geometrien durch ein Imidazol sowie die deprotonierten Rückgratstickstoffe von Amidgruppen.

IM-MS-Analyse von mb-OB3b
Die IM-MS-Studien19,40 von mb-OB3b (Abbildung 1D) zeigten, dass Cu(I)-frei mb-OB3b in der Gasphase als drei negativ geladene Arten existiert: [mb-OB3b-H]– ,[mb-OB3b–2H]2–und [mb-OB3b–3H] 3–, im Einklang mit dem erwarteten Lösungsphasenverhalten. Einzelne Metallionentitrationen wurden19 durchgeführt, um die Metallionenselektivität von mb-OB3b zu bestimmen. Abbildung 7 zeigt die Ergebnisse der ausgewählten Metallionentitrationen und zeigt, dass die scheinbare Bindungsselektivität von mb-OB3b als drei Hauptgruppen kategorisiert werden kann: 1) Cu(I) und Ag(I); 2) Ni(II), Zn(II) und Co(II); und 3) Pb(II), Fe(II) und Mn(II). Diese Reihenfolge der verbindlichen Selektivität war in allgemeiner Übereinstimmung mit der Reihenfolge, die in den Fluoreszenzlöschexperimenten19 und der isothermen Titrationskalorimetrie18gefunden wurde.

Vergleich von mb-OB3b und amb 7 Metallbindungsselektivität
Die scheinbare Bindungsselektivität von mb-OB3b wurde mit der Bindungsselektivität von amb7 bei einem pH-Wert von 7 verglichen. Die Amb7 wurde mit der gleichen Aminosäuresequenz wie mb-OB3b entwickelt, aber mit den beiden Enethiol-Oxazolon-Gruppen durch zwei His-Cys-Gruppen ersetzt. Die amb7 (Abbildung 1E) hat eine einzige Disulfidbindung zwischen Cys6 und Cys12. Die Ergebnisse der Bildung negativ geladener Komplexe (Abbildung 8) zeigten, dass amb7 die bevorzugte Bindungsselektivität für Ni(II) und Zn(II) (60%), gefolgt von Co(II) und Pb(II) (40%) bevorzugte. Darüber hinaus gab es etwa 20% Cu(II) Bindung. Es gab entweder eine Spur oder keineAmb-7-Bindung von Ag(I), Mn(II) oder Fe(II). Dies im Vergleich zur bevorzugten Bindungsselektivität von mb-OB3b von über 90 % für die Cu(I) und Ag(I)-Bindung.

Figure 1
Abbildung 1: Primärstrukturen der alternativen Methanobactin (Amb) und Methanobactin (mb-OB3b) Peptide. (A) Acetyl-Seine1-Cys2-Gly3-Pro4-Seine5-Cys6 (amb1); (B) Acetyl-Seine1-Cys2-Tyr3-Pro4-Seine5-Cys6 (amb2); (C) Acetyl-Seine1-Cys2-Gly3-Ser4-Tyr5-Pro6-Seine7-Cys8-Ser9 (amb4); (D) 1-(N-[mercapto-(5-oxo-2-(3-methylbutanoyl)oxazol-(Z)-4-yliden)methyl]-Gly1–Ser2–Cys3–Tyr4)-pyrrolidin-2-yl-(mercapto-[5-oxo-oxazol-(Z)-4-yliden]methyl)-Ser5 –Cys6–Met7 (mb-OB3b); und (E) acetyl-Leu1-Seine2-Cys3-Gly4-Ser5-Cys6-Tyr7-Pro8-Seine9-Cys10-Ser11-Cys12-Met 13 (amb7). Schattierung zeigt die: 2His-2Cys oder Enethiol-OxazolonIconBindungsstellen ( ); Prolin oder PyrrolidinIconScharniere ( ); Acetyl oder MethylbutanolGruppe N-terminus (Icon); und Tyrosin, das die Metallionenkoordination über eine zweite LösungshülleIconstabilisieren kann ( ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Mittlere relative Intensitäten des alternativen Methanobactins (amb1) Acetyl-Sein1-Cys2-Gly3-Pro4-Seine5-Cys6 und metallgebundenen Komplex (amb1+X) (wo X = Cu oder Zn). Die Beobachtungen wurden bei negativen und positiven Ionenmassenspektrometrieanalysen der 1:1-Molarenverhältnislösung von amb:XCl2 über den pH-Bereich von 3,0–11,0 gemacht. Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen des Mittelwerts sowohl der relativen Intensität als auch des pH-Wertes von drei replizierten pH-Titrationsexperimenten an. Die 1:1-Molarenlösung von amb:CuCl2 führte zur Oxidation von amb (ambox) mit Cys2 und Cys6und bildete eine Disulfidbrücke. (A) Negative Ionenanalyse von amb:CuCl2, die [ambox'H]' und [ambox'3H+Cu(II)]zeigt. (B) Positive Ionenanalyse von amb:CuCl2 zeigt [ambox]+ und [ambox+Cu(I/II)]+; der Oxidationszustand von Cu im Komplex war pH-abhängig, da [ambox+Cu(I)]+;  unter einem pH-Wert von 8 und [ambox-H+Cu(II)]+; über einem pH-Wert von 8. (C) Negative Ionenanalyse von amb:ZnCl2 zeigt [amb]n- und [amb+Zn(II)]n. (D) Positive Ionenanalyse von amb:ZnCl2 zeigt [amb]n+ und [amb+Zn(II)]n+. Diese Zahl wurde einer früheren Veröffentlichung20entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Vorgeschlagene Strukturen von [amb2+3Cu(I)]+ unter Verwendung von energieschwächsten und geometrieoptimierten Strukturen, die sich aus der Theorieebene B3LYP/LanL2DZ befinden. (A) 3 Cu(I)-Koordination über N1n5 seiner1 und Seine5 und Tholat-Bridging-Thiolate-Gruppen von Cys2 und Cys6 mit einem theoretischen Querschnitt von 217 x 6. (B) Abbildung der Überbrückungskoordination nN 1n Nund Thiolate. (C) Salzbrückenstruktur, die die 3 Cu(I)-Koordination über Carboxylatklemme (Cys6), N5und Thiolate-Überbrückung mit einem theoretischen Querschnitt von 209 x 6 x2zeigt. (D) Abbildung des Carboxylat-Terminals, N5, und Thiolate-Brückenkoordinierung. Die Bindungsabstände A, B, C, D, E und F werden in der Einheit von . Diese Zahl wurde einer früheren Veröffentlichung37entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: IM-MS-Analyse von Produkten der 1:1-Mischung von amb4:Cu(II) bei pH = 4.4.  (A) Extrahierte Isotopenmuster für die Arten [amb4-2H+3Cu(I)]+, [Durchmesser44H+6Cu(I)]2+,[triamb4-6H+9Cu(I)]3+ und [tetraamb4x 8H+12Cu(I)]4+. (B) Integration der extrahierten Ankunftszeiten von [amb4-2H+3Cu(I)]+, [Durchmesser4x 4H+6Cu(I)]2+,[triamb4-6H+9Cu(I)]3+ und [tetraamb4x 8H+12Cu(I)]4+ wurden verwendet, um ihre relative Intensität zu berechnen. Um die prozentualen relativen Intensitäten zu berechnen, wurde die Summe des integrierten Bereichs für alle extrahierten Arten für jeden Titrationspunkt verwendet, um sich auf die Prozentskala zu normalisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Änderung des Isotopenmusters für singly Cu(I/II) gebundenamb4 beobachtet während der pH-Titration von Moläquivalenten von Cu(II):amb4 bei pH = 4,04, 6,02 und 9,98. Bei pH = 4,04 entspricht das experimentelle Ergebnis in erster Linie dem Isotopenmodell für [amb4+Cu(I)]+. Bei pH = 6,02 erfolgt eine Verschiebung von -2 m/z, was die Bildung der Disulfidbrücke (dargestellt als Oxidation von amb4ox)und Übereinstimmung mit dem Isotopenmuster für [amb4ox+Cu(I)]+bedeutet. Bei pH = 9,98 erfolgt eine weitere Verschiebung von -1 m/z, was cu(II)-Bindung bedeutet und die Entfernung eines Protons zur Aufrechterhaltung des +1-Ladezustands, der dann dem Isotopenmuster für [amb4ox-H+Cu(II)]+entspricht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Ändern der relativen Intensitäten der Identitäten der Cu(I/II)-Komplexe des Monomers, Dimers und Trimmers von amb4 über den pH-Bereich von 3,0–11,0.  (A) Monomer mit einem Cu(I/II)-Ion, (B) Dimer mit 2 Cu(I/II)-Ionen und (C) Trimer mit 3 Cu(I/II)-Ionen. Die Bildunterschriften sehen, wie viele Disulfidbindungen in dem Komplex vorhanden waren. Diese Zahl wurde einer früheren Veröffentlichung39entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Prozentsatz der Bildung der Cu(I), Ag(I), Zn(II), Ni(II), Co(II), Mn(II), Pb(II) oder Fe(II)-Komplexe von Methanobactin. Beobachtet während der einzelnen MetallionenTitrationen von Methanobactin. Es sei darauf hingewiesen, dass die Cu(I)-Bindung aus der Hinzufügung von Cu(II) und Fe(II) bindung durch die Hinzufügung von Fe(III) resultierte. Diese Zahl wurde einer früheren Veröffentlichung19entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Vergleich des Prozentsatzes von Cu(I/II), Ag(I), Zn(II), Ni(II), Co(II), Mn(II), Pb(II) oder Fe(II) Chelation durch mb-OB3b und amb7 bei pH = 7. Der Vergleich dient der Bildung negativ geladener Ionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary File
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Discussion

Kritische Schritte: Erhaltung von Lösungsphasenverhalten zur Untersuchung über ESI-IM-MS
Native ESI-Instrumenteinstellungen müssen verwendet werden, um die Peptide Stoichiometrie, Ladezustand und Konformationsstruktur zu erhalten. Für native Bedingungen müssen die Bedingungen in der ESI-Quelle wie Kegelspannungen, Temperaturen und Gasströme optimiert werden. Außerdem müssen die Drücke und Spannungen in der Quelle, Falle, Ionenmobilität und Übertragungs-Reisewellen (insbesondere die DC-Falle-Bias, die die Einspritzspannung in die IM-Zelle steuert) auf ihre Einflüsse auf Ladungszustands- und Ionenmobilitätsverteilungen überprüft werden.

Im Folgenden sind die typischen Betriebsbedingungen, die in dieser Arbeit verwendet wurden. Die wässrigen Peptidproben wurden mit einer stumpfen Nasenspritze mit einer 10-Ml-Min-1-Durchflussrate, einer Kapillarspannung von 2,0 kV für positive Ionen (+) oder 1,8 kV für negative Ionen (-), 130 °C Quelltemperatur, 250 °C-Desolvation, 20 V-Probenahmekonus und 4,0 V Extraktionskegel. Der IM-Abschnitt wurde mit 6,0 V Eingangsspannung zur Fallzelle mit einem Argondruck von 2,25 x 10x 2 mbar mit einem Durchfluss von 1,5 ml/min betrieben. Die Spannung zum Einspritzen von Ionen (Trap DC Bias) in die IM-Zelle wurde auf 12 V eingestellt, um eine Dissoziation von Ionen zu vermeiden, da sie zunächst mit dem Stickstoffpuffergas kollidierten. Die IM-Zelle trennte Ionen basierend auf ihrer Ladung und Kollisionsquerschnitt und nutzte einen 0,52 mbar Stickstoffdruck und 20,0 ml minmin 1 Durchfluss. Der IM wurde mit geschwungenen Geschwindigkeiten von 12,0–20,0 V (+) oder 8,0–30,0 V ()- Und 800–1.500 ms 1 (+) oder 250–1.000 ms ()- Geschwindigkeiten für jeden Sweep durch die Zelle der IM-Reisewelle betrieben. Die Transferzelle wurde mit dem gleichen Argondruck wie die Trapzelle betrieben und führte die im aufgelösten Ionen zum orthogonalen Zeit-Flug-Massen-zu-Ladungs-Analysator. Die Ionen-Mobilitäts-Massenspektren wurden durch Die Synchronisation der gated Freisetzung von Ionen in die IM-Zelle mit dem Massen-zu-Ladungs-Analysator des Fluges erfasst.

Unter Verwendung nativer ESI-Bedingungen werden Lösungsphaseneigenschaften wie Ladezustand und Konformationszustand während der IM-MS-Analysen konserviert. Beispielsweisestanden die bei den IM-MS-Analysen20beobachtetenLadezustände von mb-OB3b und ambs in engem Zusammenhang mit den in der Lösungsphase40erwarteten Ladungszuständen. Das mb-OB3b-Peptid ist tetraprotisch und bildet während der IM-MS-Analyse40nur negativ geladene Ionen, ob Cu(I)-gebunden oder Cu(I)-frei, da es den C-Terminus (pKa < 1.7), zwei Enethioloxazolongruppen (pKa = 5.0 und 9.7) und Tyr-Gruppe (pKa = 11,0)42. Die Ambs in ihrer voll protonierten Form haben eine Gesamtladung von +2 wegen der C-Terminus (pKa 2), zwei His (pKa = 6.0), zwei Cys (pKa = 8.3) und Tyr (pKa = 11.0) Sites19,41. So bilden sie in der Regel positiv geladene Ionen bei einem pH-Wert von <6 und negativ geladene Ionen bei einem pH-Wert von >6.

Die ambs zeigten auch ein klares pH-abhängiges Cu(I/II)-Bindungsverhalten und Eine Redoxaktivität, bei der Die Cu(I)-Bindung bei einem niedrigen pH-Wert bei einem höheren pH-Wert auf Cu(II)-Bindung übergeht. Die Cu(I/II)-Reaktionen umfassten die Bildung der oxidierten Ambart (Ambox ), die Disulfidbindungen und verschiedene Multimere und mehrere Cu(I/II)-Bindung enthielten (Abbildung 5 und Abbildung 6). Diese Redoxreaktionen sind zeitabhängig und es wurde gezeigt, dass je länger das Zeitintervall (bis zu 210 min) zwischen Probenvorbereitung und IM-MS-Analysen dauerte, desto mehr oxidierte Produkte wurden beobachtet37. Daher ist auch eine sorgfältige Berücksichtigung der Reaktionszeitabhängigkeit von der Beobachtung von Produkten erforderlich.

Einschränkungen: IM-MS und theoretische Kollisionsquerschnitte identifizieren, welche Art der Koordination jedes Metallion bevorzugt
Zur Interpretation der IM-MS m/z- und CCS-Daten wurde eine umfangreiche Suche auf der B3LYP/LanL2DZ-Theorieebene durchgeführt. Geometrieoptimierte Konformatoren mit unterschiedlichen Koordinationsstellen wurden zwischen ihrer vorhergesagten freien Energie und der Vereinbarung mit dem CCS verglichen, gemessen von IM-MS. Die molekulare Modellierung dieser Peptide und ihrer Komplexe wird durch die Art der elektronischen Strukturberechnungen, die auf diese relativ großen Systeme angewendet werden können. Andere Methoden, die untersucht oder empfohlen wurden, sind Arbeiten von Truhlar et al.43, die herausfanden, dass M05-2X die beste DFT-Funktion war und PM7 und MNDO/d gute NDDO-halbempirische Methoden für Zn(II)-haltige Verbindungen44waren. Diese Peptide haben einen großen Konformationsraum und gründliche Untersuchungen zur Lokalisierung der untersten Energiekonformer müssen den Vergleich der verschiedenen Metall-Chelat-Standorte, verschiedene reine Cis- und Transpeptidbindungen, Salzbrücken, Wasserstoffbindung und Wechselwirkung zwischen der aromatischen Tyr-Seitengruppe und dem Metallkation.

Bedeutung für bestehende Methoden: Cu(I/II) und andere ausgewählte Metallionenbindung im Vergleich zwischen mb-OB3b und ambs
Röntgenkristallographie und NMR-Spektroskopie sind die gebräuchlichsten Techniken zur Bestimmung der atomaren Auflösung der tertiären Peptidenstruktur. Röntgenkristallographie-Studien von Metallopeptiden sind jedoch aufgrund von Problemen mit der Kristallisation dieser Komplexeselten 45. NMR eignet sich auch nicht für die Interpretation einer Probe, bei der eng verwandte einzelne Oligopeptidarten vorhanden sind46. Daher sind IM-MS und DFT molekulare Modellierung alternative Techniken zur Untersuchung von Peptidreaktionen, insbesondere solche, die aus komplexen Redox- und Cu(I/II)-bindenden Reaktionen20,37,40 , 47. Die Stärke von IM-MS besteht darin, dass es jedes der Produkte auflösen und seine molekulare Zusammensetzung identifizieren kann, indem es gleichzeitig ihre m/z- und Ankunftszeiten misst, die sich auf die Stoitorimetrie, den Protonationszustand und die Konformationsstruktur beziehen.

Zum Beispiel wird der mb-OB3b eine Vielzahl von Metallionen chelatieren, und seine Selektivität zu jedem Ionen wurde durch die IM-MS Metallionentitrationen angezeigt (Abbildung 7). Die Ergebnisse zeigten die mb-OB3b Präferenz für die Bindung von Cu(I) und Ag(I), während die Ergebnisse bei einem pH-Wert von 7 mit amb7verglichen wurden. Abbildung 8 zeigt amb7 bevorzugt chelatische Zn(II) und Ni(II). Im Allgemeinen zeigten die amb-Studien, dass die Ersetzung der beiden Enethiol-Oxazolone durch 2His-2Cys die Cu(I/II)-Bindung nicht ausschloss, aber sie führte zu einer mehrfachen Cu(I)-Bindung über linear-überbrückte Koordination (Abbildung 3) im Gegensatz zur mononuklearen Cu(I) Bindung der Tetraederkoordination von mb-OB3b48. Die Cu(II)-Reduktion wurde auch durch Thioloxidation und Disulfidbrückenbildung im Gegensatz zur bestehenden Disulfidbrücke in apo-mb-OB3b und dem hohen Reduktionspotenzial für kupferbelastete mb-OB3b vermittelt, was die starke Präferenz für Cu(I) 49 unterstützt. .

Zukünftige Anwendungen
Weitere IM-MS-Studien mit Amb-Peptiden sind im Gange, in denen ihre primäre Sequenz durch Ersetzen der His oder Cys durch Gly oder Asp modifiziert wird, während der Tyr-Rückstand entweder durch Gly oder Phe ersetzt wird. Diese Studien werden auch in 10,0 mM Ammoniumacetat durchgeführt, wobei der pH-Wert mit Ammoniumhydroxid modifiziert wird (für pH = 7, 8 und 9), um die gesamte Ionenstärke für jede Probe konstant zu halten. Diese Ergebnisse werden in Kürze veröffentlicht.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Dieses Material basiert auf Arbeiten, die von der National Science Foundation unter 1764436, NSF-Instrumentenunterstützung (MRT-0821247), Welch Foundation (T-0014) und Rechenressourcen des Department of Energy (TX-W-20090427-0004-50) und L3 Communications unterstützt werden. . Wir danken der Bower-Gruppe der University of California - Santa Barbara für die gemeinsame Nutzung des Sigma-Programms und Ayobami Ilesanmi für die Demonstration der Technik im Video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Chemie Ausgabe 151 2His-2Cys Motiv Methanobactin Peptidtertiärstruktur Histidin-Ladezustand Cystein-Ladezustand Salzbrücke B3LYP/LanL2DZ Ionengröße skaliert Lennard-Jones Kollisionsquerschnitte
Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie-Techniken zur Bestimmung der Struktur und Mechanismen der Metallionenerkennung und Redox-Aktivität von Metallbindungsoligopeptiden
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Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe,… More

Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).

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