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Developmental Biology

ट्रांसक्रिप्शन कारकों की प्रबल अभिव्यक्ति द्वारा मानव फाइब्रोब्लास्ट्स के हेमोजेनिक रिप्रोग्रामन

Published: November 4, 2019 doi: 10.3791/60112
Automatic Translation
1,2,3, 3, 4, 5,6, 1,2,3
1Molecular Medicine and Gene Therapy, Lund Stem Cell Center, Lund University, 2Wallenberg Center for Molecular, Lund University, 3Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 4Skolkovo Institute of Science and Technology, 5Department of Cell, Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

ERRATUM NOTICE

Summary

इस प्रोटोकॉल प्रतिलेखन कारकों GATA2, GFI1B और FOS hematopoietic स्टेम और संतति कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए लागू अभिव्यक्ति द्वारा मानव dermal फाइब्रोब्लास्ट्स में एक हेमोजेनिक कार्यक्रम के प्रेरण को दर्शाता है.

Abstract

मानव हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (एचएससी) के विनिर्देश अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र मायावी बने हुए हैं। इस जटिल विकास प्रक्रिया के अध्ययन में सीमाओं को पार करने के लिए इन विट्रो में मानव एचएससी उद्भव को पुन: लागू करने के लिए रणनीतियाँ आवश्यक हैं। यहाँ, हम एक सीधा सेल reprogramming दृष्टिकोण को रोजगार मानव dermal फाइब्रोब्लास्ट्स से hematopoietic स्टेम और संतति की तरह कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इन कोशिकाओं को एक हेमजेनिक मध्यवर्ती सेल प्रकार के माध्यम से पारगमन, endothelial-to-hematopoietic संक्रमण (EHT) HSC विनिर्देश की विशेषता के समान. Fibroblasts GATA2, GFI1B और FOS प्रतिलेखन कारकों के साथ transduction के माध्यम से हेमोजेनिक कोशिकाओं के लिए reprogrammed थे. तीन कारकों प्रेरित आकृतिक परिवर्तन, हेमेजेनिक और hematopoietic मार्करों और गतिशील EHT प्रतिलेखन कार्यक्रमों की अभिव्यक्ति का यह संयोजन. पुनर्प्रोग्रामित कोशिकाएं हेमेटोपोएटिक संतति उत्पन्न करती हैं और तीन महीने के लिए इम्यूनोन्यूमेसुविधा वाले चूहों को फिर से लोकप्रिय करती हैं। इस प्रोटोकॉल reprogramming के प्रारंभिक चरणों के दौरान GATA2 लक्ष्यों को परिभाषित करके यहाँ उदाहरण के रूप में मानव EHT प्रक्रिया के मशीनी विच्छेदन की दिशा में अनुकूलित किया जा सकता है. इस प्रकार, मानव हेमोजेनिक reprogramming उपन्यास मार्करों और मानव एचएससी उद्भव के नियामकों की पहचान करने के लिए एक सरल और पथ्य दृष्टिकोण प्रदान करता है. भविष्य में, फाइब्रोब्लास्ट्स में हेमोजेनिक भाग्य के वफादार प्रेरण प्रत्यारोपण के लिए रोगी-विशिष्ट एचएससी की पीढ़ी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

Introduction

निश्चित हीमैटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाएं (एचपीएससी) महाधमनी-गोनाड-मेसोनफ्रोस (एजीएम) क्षेत्र में उभरती हैं और हेमोजेनिक क्षमता के साथ एंडोथेलियल अग्रदूतों से प्लेसेंटा, एक एंडोथेलियल-टू-हेमेटोपोइटिक संक्रमण (ईएचटी)1, 2. हेमोजेनिक अग्रदूतों (एचपीएस) दोनों endothelial और hematopoietic मार्करों व्यक्त करते हैं, लेकिन उनकी सटीक पहचान मायावी बनी हुई है, विशेष रूप से मानव प्रणाली में. स्तनधारियों में अपेक्षाकृत संरक्षित प्रक्रिया होने के बावजूद, हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (एचएससी) विकास अभी भी मनुष्यों और माउस मॉडल3,4के बीच काफी अलग है। इसलिए, मानव एचएससी विकास को फिर से दोहराने के लिए इन विट्रो दृष्टिकोणों की आवश्यकता है।

एचएससी के लिए pluripotent स्टेम सेल (पीएससी) के भेदभाव, हालांकि आशाजनक, पिछले 20 वर्षों में सीमित सफलता मिली है, ज्यादातर उपलब्ध भेदभाव प्रोटोकॉल के कारण, जो गरीब engraftment के साथ आदिम hematopoietic जनक में परिणाम क्षमता5,6,7. वैकल्पिक रूप से, प्रत्यक्ष सेल reprogramming के तरीके कई सेल प्रकार से HSPC की तरह कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए लागू किया गया है, प्रतिलेखन कारकों का उपयोग (TFs)8,9. विशेष रूप से, तीन TFs, Gata2, Gfi1b और cFos के overexpression, एक परिभाषित phenotype के साथ एक HP मध्यवर्ती के माध्यम से HSPCs में परिवर्तित माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट्स (प्रोम1 + Sca-1 + CD34+CD45-)10. यह प्रक्रिया निश्चित हेमेटोपोइसिस के विनिर्देशन के दौरान भ्रूण और प्लेसेंटा में होने वाली EHT के समान थी। इस phenotype माउस प्लेसेंटा में HPs की आबादी की पहचान और अलगाव सक्षम है कि अल्पकालिक संस्कृति और पायदान सक्रियण के बाद क्रमिक प्रत्यारोपण एचएससी11उत्पन्न .

अब तक, कोई phenotype स्थापित किया गया है कि उनके अग्रदूतों से मानव HSCs अलग है, लेकिन कुछ अणुओं उभरते HSCs में व्यक्त किया जा करने के लिए जाना जाता है. Integrin alpha6 (ITGA6 या CD49f) अत्यधिक लंबी अवधि में व्यक्त किया जाता है HSCs repopulating, सबसे अपरिपक्व एचएससी कम्पार्टमेंट12में कोशिकाओं , और एंजियोटेन्सिन-रूपांतरण एंजाइम (ACE या CD143) भ्रूण रक्त बनाने के ऊतकों में CD34 नकारात्मक hematopoietic अग्रदूतों में मौजूद है13.

हाल ही में, हम तीन TFs, GATA2, FOS और GFI1B reprogram मानव dermal फाइब्रोब्लास्ट्स (HDFs) के मानव संस्करणों अल्पकालिक engraftment क्षमता14के साथ HPs में दिखा दिया है. reprogramming के प्रारंभिक चरणों में, GATA2 खुला chromatin संलग्न है और फाइब्रोब्लास्ट जीन को दबाने और endothelial और hematopoietic जीन को सक्रिय करने के लिए GFI1B और FOS भर्ती करता है. प्रेरित कोशिकाओं अत्यधिक CD49f और ऐस व्यक्त की है, और HSPC मार्कर CD34 व्यक्त कोशिकाओं का एक छोटा सा प्रतिशत निहित. CD9 जीन, जो HSCs15 में व्यक्त किया जाता है और HSC homing16के लिए महत्वपूर्ण है, GATA2 का एक सीधा लक्ष्य और reprogrammed कोशिकाओं14में सबसे ऊपर विनियमित जीन के बीच दिखाया गया था. CD9 इसलिए मानव निश्चित hematopois के HPs के लिए एक अतिरिक्त मार्कर का गठन हो सकता है.

इस प्रोटोकॉल में, हम GATA2, GFI1B और FOS के लागू अभिव्यक्ति के माध्यम से मानव फाइब्रोब्लास्ट्स से HSPC की तरह कोशिकाओं की पीढ़ी का वर्णन है, साथ ही क्रोमैटिन इम्यूनोप्रीसेप्शन के लिए एक अनुकूलित विधि (ChIP)-सेक्शन (सेक) विश्लेषण की शुरुआत में फिर से प्रोग्राम. TFs एक doxycycline (DOX) में एनकोडेड lentiviral वेक्टर (pFUW-tetO) है कि एक टेट्रासाइक्लिन प्रतिक्रिया तत्व (TRE) और एक न्यूनतम CMV प्रमोटर शामिल हैं, और एक साथ एक संरचक वेक्टर रिवर्स टेट्रासाइक्लिन युक्त ट्रांसड्यूस वेक्टर के साथ transduced थे transactivator प्रोटीन (PFUW-M2rtTA). जब DOX (टेट्रासाइक्लिन के अनुरूप) transduction के बाद जोड़ा जाता है, यह RTTA प्रोटीन जो टीआरई टीएफ प्रतिलेखन (टेट-ऑन सिस्टम) की अनुमति के साथ सूचना का आदान-देना करने के लिए बांधता है। प्रक्रिया को पूरा करने के लिए 25 दिनों की आवश्यकता है। ChIP-सेक प्रयोगों के लिए, HDFs GATA2 के टैग किए गए संस्करणों के साथ transduced थे (pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) और GFI1B (PLV-tetO-HA-GFI1B), प्लस pFUW-tetO-FOS और TF बाध्यकारी साइटों DOX पूरकता के बाद दो दिन विश्लेषण किया गया.

अंत में, मानव फाइब्रोब्लास्ट्स के हेमोजेनिक reprogramming मानव विकास hematopois अंतर्निहित तंत्र और भविष्य के नैदानिक आवेदन के लिए रोगी-विशिष्ट HSPCs के एक संभावित स्रोत का अध्ययन करने के लिए एक इनट्रो पथ्य प्रणाली प्रदान करता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल लुंड विश्वविद्यालय के मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था और व्यक्तिगत संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए.

1. अभिकर्मक तैयारी

  1. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) / 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के लिए, 20% FBS के साथ सोडियम pyruvate युक्त उच्च ग्लूकोज DMEM मिश्रण, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / मर्केटोथेनोल।
  2. पूर्ण DMEM के लिए, 10% FBS, 1% पेन/
  3. हेमेटोपोइटिक माध्यम के लिए, 10-6 एम हाइड्रोकॉर्टिसोन और 1% पेन/
  4. कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) का उपयोग करें।

2. मानव Dermal फाइब्रोब्लास्ट अलगाव

नोट: HDFs प्रमाणित आपूर्तिकर्ताओं से खरीदा जा सकता है (सामग्री की तालिका). उस मामले में, फाइब्रोब्लास्ट का विस्तार और उन्हें reprogramming प्रयोगों में सीधे उपयोग (अनुभाग 4). वैकल्पिक रूप से, HDFs दाताओं से अलग किया जा सकता है. यदि फाइब्रोब्लास्ट विभिन्न दाताओं से अलग हैं, तो प्रोटोकॉल के सभी चरणों में एक दूसरे से अलग नमूने रखें। प्रत्येक दाता की पहचान संख्या के साथ लेबल प्लेट/वेल्स और संग्रह ट्यूब।

  1. योग्य चिकित्सकों द्वारा प्रदर्शन 3 मिमी दौर त्वचा पंच बायोप्सी से HDFs प्राप्त करें।
  2. एक ऊतक संस्कृति के तीन कुओं कोट, इलाज 6 अच्छी तरह से प्लेट के साथ 500 $L 0.1% जिलेटिन और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट.
  3. शेष जिलेटिन समाधान को प्रेरित करें और प्रत्येक कुएं में DMEM/20% FBS के 750 $L जोड़ें। कुएं की पूरी सतह को मध्यम से ढक दिया जाना चाहिए।
  4. एक बाँझ 100 मिमी पेट्री डिश ढक्कन के अंदर की सतह के लिए DMEM/20% FBS के 1.5 एमएल जोड़ें और एक 5 एमएल serological पाइपेट की सहायता से ड्रॉप फैल.
  5. बाँझ संदंश के साथ ढक्कन पर माध्यम में त्वचा बायोप्सी रखें।
  6. नौ समान वर्गों में त्वचा बायोप्सी विच्छेदन, जगह में बायोप्सी पकड़ करने के लिए एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग कर और कटौती करने के लिए एक दूसरे स्केलपेल.
  7. नुकीले संदंश का उपयोग करके प्रति तीन बायोप्सी टुकड़े रखें। सुनिश्चित करें कि टुकड़े अच्छी तरह से नीचे करने के लिए देते हैं.
  8. टुकड़े के शीर्ष पर एक 22 मिमी कवरस्लिप रखना और कुछ दबाव लागू होते हैं।
  9. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,एक सप्ताह के लिए इनक्यूबेट करें। दैनिक कोशिकाओं की जाँच करें और वाष्पित माध्यम को बदलने के लिए हर 2 दिन में DMEM/20% FBS के 200 $L जोड़ें।
  10. एक सप्ताह के बाद, DMEM/20% FBS के 2 एमएल तक जोड़ें और हर 2 डिग्री 3 दिनों में माध्यम की जगह लें।
  11. 1:4 अनुपात पर मार्ग कोशिकाओं जब कुओं confluent हैं (के बारे में 4 "8 सप्ताह).
    1. 0.1% जिलेटिन लेपित ऊतक संस्कृति का इलाज 6 अच्छी प्लेटें तैयार करें।
    2. 80% संगम पर कुओं से Aspirate मध्यम और पीबीएस के 1 एमएल के साथ एक बार धो लो.
    3. बाँझ forceps के साथ कवरस्लिप निकालें और एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक नए कुएं में कवरस्लिप जगह, ऊतक पक्ष के साथ.
      नोट: कवरस्लिप से जुड़े हुए कक्षों को भी काटा जाएगा।
    4. वियोजन विलयन(सामग्री की सारणी)के 500 डिग्री सेल्सियस को अच्छी तरह से जोड़ें (कवरलिप्स के साथ कुएं सहित) और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5$ 10 मिनट के लिए 5% ब्व्2। जब कोशिकाएं कुएं के नीचे से उठने लगती हैं और वियोजन समाधान को निष्क्रिय कर दें। प्रत्येक अच्छी तरह से DMEM/20% FBS के 500 $L जोड़ने.
    5. सभी कुओं से फाइब्रोब्लास्टकोन को 15 एमएल शंकु नली में एकत्र कीजिए। शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए कुओं में अतिरिक्त माध्यम जोड़ें। 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रीफ्यूज।
    6. इस बीच, पहले जिलेटिन लेपित प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से DMEM/20% FBS के 500 $L जोड़ें.
    7. Aspirate मध्यम और DMEM के 6 एमएल में फाइब्रोब्लास्ट्स को फिर से शुरू /
    8. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए फाइब्रोब्लास्ट निलंबन के 500 $L जोड़ें (प्रति नमूना दो 6 अच्छी प्लेटें / 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर रात भर इनक्यूबेट कोशिकाओं ।
  12. अगले दिन, प्रत्येक अच्छी तरह से DMEM/20% FBS के 1 एमएल जोड़ें. DMEM/20% FBS के 2 एमएल के साथ मध्यम बदलें हर 2 $3 दिन जब तक कुओं 80% confluent हैं.
  13. तीन confluent कुओं के लिए धारा 2.11 दोहराएँ जब तक तीसरे मार्ग तक पहुँच गया है.
  14. confluent कुओं से फाइब्रोब्लास्ट फ्रीज (मार्ग 1 और 3).
    1. कुओं से प्रेरित माध्यम और पीबीएस के 1 एमएल के साथ एक बार धो लें।
    2. 2.11.4 और 2.11.5 चरणों में वर्णित के रूप में फाइब्रोब्लास्ट्स को अलग और एकत्र करें।
    3. एक हेमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना और 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर ट्यूब केन्द्रापसारक।
    4. अपकेंद्रण के बाद, aspirate मध्यम और 5 x 105 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व पर 10% DMSO के साथ FBS में फाइब्रोब्लास्ट्स पुन: निलंबित।
    5. एक ठंड कंटेनर का उपयोग कर -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेल निलंबन के 1 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को फ्रीज। लंबी अवधि के भंडारण के लिए -150 डिग्री सेल्सियस (तरल नाइट्रोजन) के लिए शीशियों ले जाएँ।

3. Lentiviral उत्पादन

  1. एक 100 मिमी ऊतक संस्कृति में HEK293T कोशिकाओं को बढ़ाएँ पूरा DMEM के 10 एमएल के साथ पकवान, 37 डिग्री सेल्सियस पर, 5% सीओ2,जब तक संगम तक पहुँच गया है.
  2. ट्रांसफेक्शन से पहले दिन, aspirate मध्यम और पीबीएस के 5 एमएल के साथ ध्यान से पकवान धो लो.
  3. पीबीएस को हटाने के बाद, 1.5 एमएल वियोजन समाधान जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 5 $ 10 मिनट केलिए 5 " 10 मिनट के लिए 5" 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को डिश से अलग करने के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह उपयोग करने से पहले दोनों पीबीएस और वियोजन समाधान गर्म करने के लिए सिफारिश की है, ताकि कोशिकाओं को एक थर्मल सदमे पीड़ित नहीं है.
  4. पूर्ण DMEM के 3 एमएल के साथ वियोजन समाधान निष्क्रिय करें और सेल निलंबन को 15 एमएल शंकु ट्यूब में स्थानांतरित करें। शेष संलग्न कोशिकाओं को हटाने और 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए इस मात्रा को स्थानांतरित करने के लिए पूरा DMEM के 5 एमएल के साथ पकवान धो लें।
  5. 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज सेल निलंबन।
  6. Aspirate supernatant और पकवान प्रति पूरा DMEM के 10 एमएल के एक अंतिम मात्रा में छह 100 मिमी ऊतक संस्कृति का इलाज व्यंजनों के बीच समान रूप से सेल गोली विभाजित. कोशिकाओं को लगभग 60% transfection के समय से अनुकूल होना चाहिए.
  7. अगले दिन, प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफेक्ट कोशिकाओं को निम्नानुसार घोला जा सकता है:
    नोट:     प्रोटोकॉल का यह हिस्सा एक 100 मिमी ऊतक संस्कृति में lentiviruses के उत्पादन का वर्णन करता है प्लाज्मिड मिश्रण प्रति पकवान का इलाज किया. एकाग्रता के लिए lentiviral supernatant की उच्च मात्रा प्राप्त करने के लिए, मिश्रण प्रति कम से कम चार 100 मिमी HEK293T सेल संस्कृति व्यंजन का उपयोग करें.
    1. एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में, तीन हस्तांतरण प्लाज्मिड के 10 डिग्री ग्राम एक साथ जोड़ें: pFUW-tetO-GATA2 के 3.33 डिग्री (Addgene प्लाज्मिड #125028)14, 3.33g pFUW-GFI1B (Addgene #125597)14 और 3.33 डिग्री के pFUW-TET-PLUS4,#125598 2nd पीढ़ी psPAX2 पैकेजिंग वेक्टर के 10 g गैग, पोल, टैट और रेव जीन (Addgene #12260) और pMD2.G लिफाफा वेक्टर के 5 डिग्री वीएसवी जी जीन एन्कोडिंग (Addgene #12259) एन्कोडिंग. 500 डिग्री सेल्सियस तक पानी जोड़ें।
    2. दो नए 15 एमएल शंकुट्यूबों में FUW-M2rtta प्लाज़्मिड (एडजीन #20342)17,PSPAX2 पैकेजिंग वेक्टर के 10 डिग्री ग्राम और pMD2.G लिफाफा वेक्टर के 5 डिग्री ग्राम प्रत्येक ट्यूब के लिए जोड़ें। 500 डिग्री सेल्सियस तक पानी जोड़ें। एक ट्यूब एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है.
    3. प्रत्येक ट्यूब में 2 एम कैसीएल2का 62.5 डिग्री सेल्सियस जोड़ा जाता है। अगले, एक पाश्चर पाइप्ट एक पाइप्ट नियंत्रक में डाला का उपयोग कर प्रत्येक मिश्रण में बुलबुले रिलीज। जबकि बुलबुले बन रहे हैं, N केpipette 500 $L, एन -बिस(2-hydroxyethyl)-2-एमिनोथेथेनेसल्फोनिक एसिड (बीईएस) बफर नमकीन (पीएच 7.1, 25 डिग्री सेल्सियस), एक P1000 पिपेट के साथ, पेस्टुर पाइपेट के खिलाफ ड्रॉप वार और मिश्रण पर।
    4. कम से कम 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट ट्यूब। मिश्रण कुछ समय के बाद थोड़ा बादल दिखाई देगा.
  8. इस बीच, HEK293T सेल व्यंजन से aspirate माध्यम (एक दिन पहले पारित) और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना पूरा DMEM के 10 एमएल जोड़ें. सावधान रहें और मध्यम धीरे जोड़ने के रूप में HEK293T कोशिकाओं अर्द्ध अनुकूल हैं.
  9. प्रत्येक व्यक्ति के मिश्रण (लगभग 1 एमएल) समान रूप से और ड्रॉप-वार अलग-अलग व्यंजन में वितरित करें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2में इनक्यूबेट करें।
  10. पूरा DMEM के 4 एमएल के साथ मध्यम बदलें, ऊष्मायन के बाद 24 एच. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर रात भर इनक्यूबेट । यदि उपलब्ध हो, तो इसके बजाय 32 डिग्री सेल्सियस, 5% ब्व्2 मेंइनक्यूबेट करें, क्योंकि कम तापमान lentiviral कणों के आधे जीवन में वृद्धि करेगा।
  11. 50 एमएल शंकु ट्यूब के लिए तीन बार lentiviral कणों के साथ supernatant लीजिए। इस बिंदु पर विभिन्न lentiviral कणों मिश्रण नहीं है. प्रत्येक डिश 12 एमएल मसूरीवायरल सुपरनेंट में परिणाम होगा। एक ही वायरल तैयारी के चार व्यंजन एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में फिट.
    चेतावनी:     एक biosafety स्तर-2 प्रयोगशाला में एक laminar प्रवाह हुड में lentiviral संग्रह प्रदर्शन lentiviral काम के लिए समर्पित है और जगह वायरल दूषित अपशिष्ट (ट्यूब, युक्तियाँ, व्यंजन) एक उपयुक्त कंटेनर में biohazardous सामग्री के लिए.
    1. पिछले ऊष्मायन के बाद पहला संग्रह 16 एच करो और पूरा DMEM के 4 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% सीओ2|
    2. एक ही ट्यूब के लिए पहले के बाद दूसरा संग्रह 8 ज मत करो, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर पूरा DMEM और इनक्यूबेट के 4 एमएल जोड़ें।
    3. तीसरे संग्रह 16 एच एक ही ट्यूब के लिए दूसरे के बाद करते हैं और बर्तन त्याग दें।
      नोट: प्रत्येक संग्रह के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर लेन्टिवायरल सुपरनेट्स स्टोर करें।
  12. एक साफ ट्यूब के लिए एक सेलूलोज़ एसीटेट झिल्ली (सामग्री की तालिका) के साथ एक 0.45 मीटर कम प्रोटीन बाइंडिंग फिल्टर का उपयोग कर प्रत्येक lentiviral supernatant फ़िल्टर करें।
  13. एक पुनरुज्जीवित सेलूलोज़ झिल्ली के साथ एक केन्द्रापसारक फिल्टर इकाई में फ़िल्टर किए गए सुपरनेंट की अधिकतम 15 एमएल जोड़ें (सामग्री की तालिका) और 25 मिनट के लिए 4,000 x g पर स्पिन, 4 डिग्री सेल्सियस पर। प्रवाह-थ्रू छोड़ें. मसूरी वायरस वाला एक चिपचिपा द्रव फिल्टर यूनिट में रहेगा।
  14. फिल्टर यूनिट के शीर्ष पर supernatant के 15 एमएल जोड़कर चरण 3.13 दोहराएँ, जब तक वहाँ कोई और अधिक lentiviral supernatant छोड़ दिया है.
    नोट: जब वहाँ केवल कुछ मिलीलीटर supernatant के ध्यान केंद्रित करने के लिए कर रहे हैं, कताई समय को कम करने के लिए 10 मिनट. यदि फिल्टर पर अभी भी अतिरिक्त तरल (गैर-विस्कस) है, तो अतिरिक्त 10 मिनट के लिए अपकेंद्रण।
  15. प्रत्येक प्रकार के केंद्रित मसूरीवायरस के प्रारंभिक अति-नाटेन्ट वॉल्यूम के आधार पर एलिकोट (50 डिग्री 200 डिग्री सेल्सियस) बनाएं और लंबी अवधि के भंडारण (1 डिग्री 2 वर्ष) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर या अल्पकालिक भंडारण (1 डिग्री 2 सप्ताह) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: केंद्रित या गैर केंद्रित lentiviruses भी ताजा इस्तेमाल किया जा सकता है. इसे कम करने के परिणाम के रूप में फिर से फ्रीज और thaw मत करो।

4. हेमोजेनिक रीप्रोग्रामिंग

नोट: रीप्रोग्रामिंग प्रयोगों को करने के लिए तीन (P3) या उच्चतर (P10 तक) की एक मार्ग संख्या के साथ HDFs का उपयोग करें।

  1. 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.1% जिलेटिन के 5 एमएल और इनक्यूबेट के साथ एक 100 मिमी ऊतक संस्कृति का इलाज पकवान कोट।
  2. 0.1% जिलेटिन लेपित पकवान में एक फाइब्रोब्लास्ट शीशी और प्लेट कोशिकाओं को Thaw. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर रात भर इनक्यूबेट । यदि आवश्यक हो, वांछित मार्ग और संगम तक पहुँच रहे हैं जब तक समय की एक लंबी अवधि के लिए फाइब्रोब्लास्ट का विस्तार।
  3. एक 6-वेल ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेट को 0.1% जिलेटिन समाधान के 500 डिग्री सेल्सियस के साथ कोट करें और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अतिरिक्त जिलेटिन निकालें।
  4. प्लेट HDFs प्रति प्लेट प्रति 150,000 कोशिकाओं के घनत्व पर (25,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से) अच्छी तरह से पूरा DMEM के 2 एमएल में. सेल लगाव की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  5. मीडियम को 2 एमएल पूर्ण DMEM प्लस 8 ग्राम/एमएल पॉलीब्रेन के साथ बदलें। एक नया microcentrifuge ट्यूब में पूल उत्पादित TF lentiviruses और M2rtTA का 1:1 अनुपात मिश्रण तैयार करें.
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, तीन TFs के लिए lentiviruses का पूल-उत्पादन किया जाता है, जो, लेखकों के हाथों में, उच्च reprogramming दक्षता में परिणाम. वैकल्पिक रूप से, यह एक मानक सेल लाइन पर, ुपीसीआर18द्वारा व्यक्तिगत lentiviral कणों की एक अनुमापन प्रदर्शन करने के लिए सुझाव दिया है। यह सह-परिवर्तन और हेमेजेनिक reprogramming के लिए इष्टतम संक्रमण (एमओआई) की बहुलता को पूरा करने के लिए आवश्यक व्यक्तिगत वायरस की मात्रा को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  6. एच.डी.एफ. को प्रति अच्छी तरह से 10 से 100 डिग्री सेल्सियस मसूर का मिश्रण वितरित करें। इस दिन है -2 reprogramming के.
    नोट: सेल व्यवहार्यता से समझौता किए बिना, कुशल reprogramming के लिए lentiviral मिश्रण के इष्टतम मात्रा को परिभाषित करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता है (अधिक विवरण के लिए अनुपूरक चित्र 1 देखें). अधिक से अधिक 7 मार्ग के साथ HDFs कम मार्ग के साथ कोशिकाओं की तुलना में वायरस की उच्च मात्रा की आवश्यकता हो सकती है.
  7. 16 ज ऊष्मायन के बाद, वायरस को हटा दें और पूर्ण DMEM जोड़ें। कोशिकाओं को 6 $8 h के लिए पुनर्प्राप्त करने की अनुमति दें.
  8. वसूली के बाद, aspirate मध्यम और 8 ग्राम / एमएल polybrene के साथ पूरा DMEM के 2 एमएल जोड़ें.
  9. चरण 4.6 में वर्णित के रूप में एक दूसरा transduction करो और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 16 एच के लिए 5% सीओ2। इस दिन -1 reprogramming का है. मसूरीवायरल मिश्रण को ट्रांसक्शन दोनों के लिए दिन -2 पर तैयार किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
  10. अगले दिन, वायरस को हटाने और पूरा DMEM जोड़ने के साथ पूरक 1 g/ इस reprogramming के 0 दिन है. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 48 एच के लिए 5% सीओ2।
  11. reprogramming के 2 दिन में, 1:2 अनुपात में प्रत्येक अच्छी तरह से विभाजित.
    1. पीबीएस के 1 एमएल के साथ मध्यम और धोने कोशिकाओं Aspirate.
    2. Aspirate पीबीएस और वियोजन समाधान के 500 डिग्री सेल्सियस के साथ कोशिकाओं को अलग. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 डिग्री 10 मिनट, 5% सीओ2इनक्यूबेट।
    3. पूर्ण DMEM के 1 एमएल के साथ वियोजन समाधान को निष्क्रिय करें और कोशिकाओं को शंकु नली में एकत्रित करें। 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    4. hematopoietic माध्यम में गोली resuspend (चरण 1.3 देखें), के साथ पूरक 1 g/mL DOX, और नए ऊतक संस्कृति में प्लेट कोशिकाओं का इलाज 6 अच्छी तरह से प्लेटें 0.1% जिलेटिन के साथ लेपित 2 एमएल प्रति अच्छी तरह से एक अंतिम मात्रा के लिए.
  12. रीप्रोग्रामिंग संस्कृतियों (25 दिनों) की अवधि के लिए सप्ताह में दो बार मध्यम (हेमाटोपोइटिक माध्यम प्लस DOX) बदलें।
  13. ब्राइटफील्ड या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा अलग-अलग समय बिंदुओं पर परिणामी पुनः प्रोग्राम की गई कोशिकाओं का विश्लेषण करें (पूरक चित्रा 2देखें), प्रवाह साइटोमेट्री, थोक और एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण, और के अधिग्रहण के लिए प्रत्यारोपण परख hematopoietic आकारिकी, endothelial और hematopoietic मार्करों की उपस्थिति, endothelial के अधिग्रहण /

5. Hemogenic Reprogramming के Onset पर ChIP-सेक विश्लेषण के लिए Fibroblast विस्तार का अनुकूलन

  1. प्लेट 300,000 HDFs (और lt;P8) में 0.1% जिलेटिन लेपित ऊतक संस्कृति का इलाज 6 अच्छी तरह से प्रति 2 एमएल की एक अंतिम मात्रा के लिए पूरा DMEM के साथ प्लेटें. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर रात भर इनक्यूबेट ।
  2. अगले दिन, पूरा DMEM के साथ मध्यम की जगह 8 g/mL polybrene के साथ पूरक.
  3. व्यक्तिगत कारकों के साथ कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करें: pFUW-tetO-FOS14, pLV-tetO-HA-GFI1B (एडजीन #125599)14 और pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 (एडजीन #125600)14 या तीन कारकों का एक पूल के साथ, प्लस FUW-M2rtTA 1:1 अनुपात पर। का प्रयोग करें 10 "20 $L कुल वायरस (व्यक्तिगत TF + M2rtTA या तीन TFs + M2rtTA). 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर रात भर इनक्यूबेट कोशिकाओं ।
    नोट: यह शर्त प्रति बारह 6 अच्छी प्लेटों का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है (प्रत्येक व्यक्ति TF और तीन TFs संयुक्त के लिए).
  4. lentiviruses निकालें और पहले transduction के बाद पूरा DMEM 16 एच जोड़ें. कोशिकाओं को 6 डिग्री 8 ज के लिए ठीक होने दें।
  5. कोशिकाओं को दूसरी बार एक बार संक्रमण करें जिसमें प्रति स्थिति वायरस की समान मात्रा होती है और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% ब्व्2पर इनक्यूबेट होता है।
  6. अगले दिन वायरस को हटाने और पूरा DMEM जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 24 ज के लिए 5% सीओ2।
  7. एक 0.1% जिलेटिन लेपित ऊतक संस्कृति में प्रत्येक अच्छी तरह से प्लेट एक पूर्ण DMEM के साथ 100 मिमी पकवान का इलाज 10 एमएल प्रति पकवान के अंतिम मात्रा में. यह लगभग एक 1:6 मार्ग का प्रतिनिधित्व करता है.
  8. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 6 दिनों के लिए बढ़ने की अनुमति दें।
  9. 6 दिन फिर से चढ़ाना के बाद, aspirate मध्यम और 1 g/ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कोशिकाओं, 2 दिनों के लिए 5% सीओ2।
  10. फाइब्रोब्लास्ट्स लीजिए और तीन TFs के जीनोमिक बाध्यकारी साइटों का विश्लेषण व्यक्तिगत रूप से या संयोजन में transduced, CHIP-सेक द्वारा 2 दिन DOX पूरकता14के बाद .
    नोट: अंतिम सत्तर-दो 100 मिमी व्यंजन 20 डिग्री 50 x 106 कोशिकाओं के बीच होते हैं, ChIP-सेक प्रयोगों और प्रतिकृति प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त.

Representative Results

एच.डी.एफ. का उपयोग करते हुए पुनः प्रोग्रामन प्रकिया का एक योजनाबद्ध निरूपण चित्र 1कमें दिखाया गया है। Fibroblasts वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त कर रहे हैं या मानव दाताओं से एकत्र और reprogramming के लिए पिछले इन विट्रो में विस्तार किया. चढ़ाना के बाद, कोशिकाओं GATA2, GFI1B और FOS (और M2rtTA) lentiviruses के साथ दो बार ट्रांसड्यूस कर रहे हैं, और doxycycline reprogramming के दिन 0 में जोड़ा जाता है। दूसरे दिन, कोशिकाओं को विभाजित कर रहे हैं और संस्कृति के 25 दिन तक hematopoietic माध्यम में चढ़ाया. पुन: क्रमादेशित कोशिकाओं इम्यूनो समझौता चूहों में प्रत्यारोपण सहित कई अनुप्रयोगों के लिए अलग अलग समय बिंदुओं पर उत्पन्न किया जा सकता है, शुद्ध सेल आबादी के एकल सेल आरएनए अनुक्रमण (scRNA-सेक) (दिन 2 unsorted, दिन 15 CD49f+ CD34 और दिन 25 CD49f+CD34+ कोशिकाओं), साथ ही साथ माइक्रोस्कोपी और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सेल सतह मार्करों CD49f, CD34, CD9 और CD143 के लिए. प्रतिनिधि साइटोमेट्री भूखंडों से पता चलता है कि reprogramming के 25 दिनों के बाद CD49f और CD9 (चित्र 1B, बाएं पैनल)दोनों को व्यक्त करने वाले पुनः प्रोग्रामकिए गए कक्षों का$17%है. डबल सकारात्मक कोशिकाओं के बहुमत CD143 व्यक्त ($86%), और एक छोटी सी आबादी एक्सप्रेस CD34 (0.9%), एक गतिशील hemogenic भाग्य प्रेरण का सुझाव. इन मार्करों M2rtTA में सक्रिय नहीं कर रहे हैं 25 दिनों के लिए सुसंस्कृत HDFs transducs (चित्र 1बी, सही पैनल). इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेज्स अनुलग्न और गोल कोशिकाओं में CD9 और CD143 की अभिव्यक्ति की पुष्टि करते हैं, जो इन मार्कर के लिए नकारात्मक होते हैं फाइब्रोब्लास्ट्स से आकृतिकेरूप से अलग (चित्र 1ब्)। मानव हेमजेनिक कालोनियों भी CD49f और CD3414व्यक्त करते हैं. HDFs के ScRNA-सेक विश्लेषण, दिन 2 unsorted कोशिकाओं, और दिन में शुद्ध reprogrammed कोशिकाओं 15 (CD49f+CD34- )और दिन 25 (CD49f+CD34+ )सीडी49f, CD9 और CD143 अभिव्यक्ति दिन 2 से दिन 25 में एक कदम की वृद्धि दिखा. CD49f और CD9 सकारात्मक कोशिकाओं reprogramming प्रक्रिया के दौरान पहले दिखाई देते हैं, दिन के बीच 2 और 15, यह दर्शाता है कि इन अणुओं जल्दी मानव hemogenesis के मार्करों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. CD143 व्यंजक दिन 15 में पता लगाया जा करने के लिए शुरू होता है और CD34 व्यक्त कक्षों केवल बाद में समय बिंदु (दिन 25) में पाए जाते हैं। सीडी34+ गर्भनाल रक्त (यूसीबी) कोशिकाओं को संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया गया (चित्र 1डी) .

चित्र 2A हेमोजेनिक रीप्रोग्रामिंग (दिन 2)के प्रारंभिक चरणों में ChIP-सेक विश्लेषण के लिए पर्याप्त संख्या में कक्ष जनरेट करने के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। सबसे पहले, HDFs मानक प्रोटोकॉल की तुलना में दो गुना अधिक घनत्व पर चढ़ाया जाता है (300,000 कोशिकाओं बनाम 150,000 प्रति प्लेट कोशिकाओं). transduction के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से एक 100 मिमी डिश कोशिकाओं DOX के साथ मध्यम पूरक से पहले 6 दिनों के लिए विस्तार करने की अनुमति में फिर से चढ़ाया है. कोशिकाओं DOX और परिणामी TF अभिव्यक्ति जोड़ने के बाद 2 दिन का विश्लेषण कर रहे हैं. चित्रा 2बी ITGA6 और ऐस के जीनोम नियामक क्षेत्रों के लिए बाध्यकारी GATA2 के जीनोम ब्राउज़र प्रोफाइल से पता चलता है जब कोशिकाओं को सह तीन कारकों (3TFs) या GATA2 व्यक्तिगत रूप से के साथ transduced हैं. GATA2 भी CD9 और CD34 जीन14के chromatin क्षेत्रों को खोलने के लिए बाध्य करता है.

Figure 1
चित्र 1: मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट्स में हेममोजेनिक भाग्य का प्रेरण। (ए)मानव dermal फाइब्रोब्लास्ट्स (HDFs) के हेमोजेनिक reprogramming के लिए प्रायोगिक रणनीति. त्वचा पंच बायोप्सी से Fibroblasts दाताओं से एकत्र कर रहे हैं, विस्तार और GATA2, GFI1B, FOS और M2rtTA lentiviruses के साथ transduced. Doxycycline (DOX) reprogramming के 0 दिन में संस्कृति के लिए जोड़ा जाता है और कोशिकाओं को दिन 25 तक कई समय बिंदुओं पर विश्लेषण कर रहे हैं. scRNA-सेक, एकल सेल आरएनए-सेक्विंग. FACS, फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छंटनी. (बी) गैटिंग रणनीति का उपयोग तीन प्रतिलेखन कारकों (3TFs) के साथ ट्रांसडक्शन के बाद 25 दिन में प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा हेमोजेनिक/हेमाटोपोइटिक मार्करों की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। साइटोमेट्री प्लॉट्स CD49f और CD9 के लिए डबल सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाते हैं, जो लाइव-सेल जनसंख्या (DAPI-नकारात्मक) में गेट किए गए हैं. डबल सकारात्मक आबादी के भीतर, CD143 और CD34 की अभिव्यक्ति दिखाया गया है. HDFs केवल एक ही संस्कृति की स्थिति के तहत M2rtTA वायरस के साथ transduced नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है. (ग)दिन 25 पुनर्प्रोग्रामित कालोनियों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों सीडी 9 (ऊपरी पैनल) और CD143 (कम पैनल) की अभिव्यक्ति की पुष्टि. कोशिकाओं को एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) के साथ दाग दिया गया था पीबीएस/2% एफबीएस में माउस सीरम के साथ पतला, 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट, 5% सीओ2,तीन बार धोया और पीबीएस/ चरण, चरण-ग्रेडिएंट कंट्रास्ट. स्केल बार्स - 50 डिग्री मी. (डी) विभिन्न समय बिंदुओं पर 253 कोशिकाओं का ScRNA-सेक विश्लेषण। ITGA6, CD9, ACE और CD34 की अभिव्यक्ति reprogramming के दौरान सक्रिय है. कोशिकाओं दिन 2 (अमिश्रित), दिन 15 (CD49f+CD34- )और दिन 25 (CD49f+CD34+ )में एकत्र कर रहे हैं. HDFs और CD34+ गर्भनाल रक्त (34 + UCB) कोशिकाओं के संदर्भ के रूप में उपयोग किया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: ChIP-सेक विश्लेषण के लिए मानव dermal फाइब्रोब्लास्ट्स का विस्तार. (क)पुनः प्रोग्रामिंग के दिन चिप-सेक के लिए ट्रांसड्यूसर मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट्स (एचडीएफ) की उच्च संख्या उत्पन्न करने के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल को दर्शाने वाली प्रायोगिक कार्यनीति। 300,000 कोशिकाओं 6 अच्छी तरह से प्लेटों में चढ़ाया और व्यक्तिगत कारकों के साथ दो बार transduced रहे हैं (PFUW-tetO-FOS, PLV-tetO-HA-GFI1B या PFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) या तीन कारकों का एक संयोजन (प्लस M2TArt). वायरस को हटाने के बाद, फाइब्रोब्लास्ट्स 100 मिमी व्यंजन में छह दिनों के लिए विस्तार कर रहे हैं। Doxycycline (DOX) दिन 0 में जोड़ा जाता है और कोशिकाओं DOX इसके अलावा के बाद दो दिन एकत्र कर रहे हैं. (बी)जीनोम ब्राउज़र प्रोफाइल ITGA6 और ऐस loci पर GATA2 बाध्यकारी साइटों (ग्रे बक्से) पर प्रकाश डाला तीन प्रतिलेखन कारकों (3TFs) या GATA2 के साथ अकेले के साथ transduction के दो दिन बाद. मैप किए गए रीडकीकी की कुल संख्या y-अक्ष पर प्रस्तुत की जाती है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Figure 1
अनुपूरक चित्र 1: कुशल हेमजेनिक reprogramming के लिए एक अनुकूलित lentiviral मात्रा को परिभाषित. केंद्रित की मात्रा में वृद्धि (10 से 100 जेडएल) पूल का उत्पादन lentiviral कणों (3TFs: GATA2, GFI1B और FOS) मानव dermal फाइब्रोब्लास्ट्स (HDFs) का अनुवाद करने के लिए उपयोग किया जाता है, M2rtTA के साथ 1:1 के अनुपात में, प्रोटोकॉल के चरणों 4.5 डिग्री 4.12 के साथ. Reprogrammed कोशिकाओं दिन 25 पर विश्लेषण कर रहे हैं हेमेजेनिक reprogramming के लिए transduction का एक इष्टतम मात्रा को परिभाषित करने के लिए, CD49f के प्रतिशत से दिया+CD9+ कोशिकाओं लाइव-सेल में gated (DAPI-नकारात्मक). सेल व्यवहार्यता दिन 25 पर जीवित कोशिकाओं की पूर्ण संख्या की मात्रा निर्धारित करके मूल्यांकन किया जा सकता है. HDFs M2rtTA (100 $L) के साथ transduced नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Figure 2
अनुपूरक चित्र 2: मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट्स के हेमोजेनिक पुनर्प्रोग्रामन के दौरान आकृति विज्ञान में परिवर्तन होता है। मानव Dermal Fibroblast (HDF) संस्कृतियों पहले transduction के दिन में छवि रहे हैं (दिन -2), जब DOX संस्कृतियों में जोड़ा जाता है (दिन 0), दो दिन (दिन 2) और पंद्रह दिन (दिन 15) DOX पूरकता के बाद, और प्रयोग के अंत बिंदु पर (दिन 25). दिन 15 और 25 में हेमोजेनिक कालोनियों पर प्रकाश डाला जाता है। स्केल बार्स ] 100 $m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस लेख में, एक विधि मानव फाइब्रोब्लास्ट्स से सीधे hematopoietic जनक कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए वर्णित है, जो एक HP सेल मध्यवर्ती के माध्यम से जाना, इसी तरह निश्चित HSCs14के लिए.

गैटा2, जीएफआई1बी और एफओएस को व्यक्तिगत उत्पादन पर पसंद किया गया था, क्योंकि हमारे हाथों में यह उच्च reprogramming क्षमता (अप्रकाशित डेटा) में परिणाम के पूल-उत्पादन। Retroviride परिवार के सदस्य के रूप में Lentiviruses, आम तौर पर सकारात्मक एकल फैला आरएनए19की दो प्रतियां होते हैं। वृद्धि हुई reprogramming दक्षता एक ही lentiviral कण में दो अलग transgenes की पैकेजिंग के कारण हो सकता है, तीन प्रतिलेखन कारकों के साथ सह transduced कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई है जिसके परिणामस्वरूप. इस प्रोटोकॉल की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, यह सेल मार्ग के आधार पर वायरस की पर्याप्त राशि के साथ HDFs स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक है reprogramming दक्षता और सेल व्यवहार्यता के बीच एक इष्टतम संतुलन प्राप्त करने के लिए, के रूप में चरण 4.6 में सिफारिश की. इसके अलावा, ताजा गैर केंद्रित वायरस इस्तेमाल किया जा सकता है. यह 3TFs पूल और M2rtTA के 0.5-3 एमएल के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए सिफारिश की है. इसके अलावा, सेल घनत्व आवेदन के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। 6-वेल प्लेट (चरण 4.4) प्रति 150 000 HDFs ने पुनप्रोग्रामित कोशिकाओं के FACS, ट्रांसप्लांटेशन और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण करने के लिए इष्टतम घनत्व प्रदान किया। ChIP-सेक प्रयोगों के लिए, और अधिक कोशिकाओं को शुरू से आवश्यक थे (चरण 5.1). यह रूपात्मक परिवर्तन के लिए नियमित रूप से कोशिकाओं की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है और प्रेरित hematopoietic कोशिकाओं के उद्भव का समर्थन करने के लिए सप्ताह में दो बार हेमेटोपोएटिक माध्यम की जगह। फीडर परतों में हेमेटोपोएटिक साइटोकिन्स या सह-संस्कृति के अलावा री-प्रोग्रामिंग दक्षता में वृद्धि हो सकती है।

इस विधि के साथ, हम नए hematopoietic मार्करों है कि गतिशील hemogenic reprogramming के दौरान व्यक्त कर रहे हैं की पहचान कर सकते हैं. CD9, जो अप करने के लिए दिखाया गया था प्रतिलिपि स्तर पर reprogrammed कोशिकाओं में विनियमित14,तेजी से CD49f और CD143 के साथ reprogramming के प्रारंभिक चरणों में सेल सतह पर व्यक्त की है, मानव HSC अग्रदूतों के एक उपन्यास मार्कर के रूप में सेवा. हम यह भी पता चलता है कि ITGA6 और ऐस HEmogenic reprogramming के प्रारंभिक चरणों के दौरान GATA2 के प्रत्यक्ष लक्ष्य हैं, CD9 और CD3414के अलावा, मानव हेमोजेनिक के बीच एक सीधा मशीनी लिंक प्रदान अग्रदूत फीनोटाइप और GATA2.

इस प्रणाली का एक लाभ अपेक्षाकृत सजातीय फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों के उपयोग में रहता है. जबकि पीएससी का आसानीसे विस्तार किया जाता है और इन का इन का इन का इन का विस्तार किया जाता है , वहीं विभेदकारी प्रोटोकॉल विषम जनसंख्या उत्पन्न करते हैं जिनमें हेमाटोपोएटिक संतति शामिल होती है , जो खराब5,6,7को घेरती है . इसके अलावा, पीएससी व्युत्पन्न HSPCs प्रत्यारोपण करते समय ट्यूमरीजनन का खतरा है, क्योंकि अलग-अलग पीएससी अभी भी भेदभाव प्रोटोकॉल को रोजगार देने के बाद भी संस्कृति में रह सकते हैं। फाइब्रोब्लास्ट्स के लिए वैकल्पिक रूप से, एचएससी के लिए सीधे reprogramming रक्त प्रतिबद्ध संतति20 और endothelial कोशिकाओं21के लिए लागू किया गया है। हालांकि, रक्त-प्रतिबंधित संतति कोशिकाओं के साथ शुरू करने से परिणामी एचएससी के चिकित्सीय अनुप्रयोग में बाधा आती है यदि रोगी उत्परिवर्तनों को वहन करता है जो स्टेम/प्रोजेक्टिव हेमेटोपोएटिक जनसंख्या को प्रभावित करताहै। एंडोथेलियल कोशिकाओं के मामले में, फाइब्रोब्लास्ट्स की तुलना में इन्हें प्राप्त करना अधिक कठिन होता है, और फीनोटाइप, फलन और संरचना के संदर्भ में एक बहुत विषम कोशिका जनसंख्या का गठन होता है, जो अंग-निर्भर23हैं। अन्य अध्ययनों में माउस फाइब्रोब्लास्ट्स engraftable hematopoietic संतति24,25 अभी तक, अभी तक, कोई अन्य प्रोटोकॉल मानव फाइब्रोब्लास्ट से HSPC की तरह कोशिकाओं की पीढ़ी का वर्णन में reprogramming में सफल रहा है.

यह दृष्टिकोण, औषधीय अवरोध, जीन नॉक-आउट, या नॉक-डाउन परमिट के साथ मिलकर व्यक्तिगत या कारकों के संयोजन को परिभाषित करने के लिए जो सीधे मानव एचएससी को प्रेरित करने के लिए आवश्यक हैं। हाल के आधार पर उच्च दक्षता स्क्रीनिंग के तरीके को रोजगार CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकियों HDFs में reprogramming से पहले, मानव निश्चित hematopoiesis के उपन्यास नियामकों को परिभाषित करने के लिए एक रोमांचक प्रयास का प्रतिनिधित्व करता है. भविष्य में, इस तरह के फाइब्रोब्लास्ट्स के रूप में गैर रक्त से संबंधित मानव सेल प्रकार reprogramming नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए स्वस्थ रोगी-पुच्छी hematopoietic संतान कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए एक मंच के रूप में काम करेंगे।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

Knut और ऐलिस Wallenberg फाउंडेशन, Lund विश्वविद्यालय और क्षेत्र Skne में चिकित्सा संकाय उदार वित्तीय सहायता के लिए स्वीकार कर रहे हैं. इस काम से ओले Engkvists Stiftelse (194-0694 से Filipe Pereira के लिए) और फंडाज़ो पैरा एक Ciencia ई Tecnologia (PTDC/BIM-MED/0075/2014 से Filipe Pereira के लिए पीएचडी छात्रवृत्ति) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और SFRH/BD/135725/2018 और SFRH/BD/51968/2012 रीता Alves को और आंद्रेई गोम्स) इस अध्ययन में भी NIH और NYSTEM (1R01HL119404 और C32597GG से Kateri ए मूर) से धन द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm low-protein binding filter, 150 mL Bottle Top Vacuum Filter Corning #430625
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich #M6250
Alexa Fluor 488 anti-human CD34 clone 581 BioLegend #343518
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human Angiotensin Converting Enzyme (CD143) clone BB9 BD Biosciences #557929
BES buffered saline Sigma-Aldrich #14280
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich #449709
Centrifugal filter unit, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich #UFC903096
Dissociation solution, TrypLE Express Enzyme (1x) no phenol red Gibco #12604-021
Doxycycline hyclate (DOX) Sigma-Aldrich #D9891
eBioscience CD49f (Integrin alpha 6) Monoclonal Antibody (eBioGoH3 (GoH3)), PE-Cyanine7 Invitrogen #25-0495-82
FUW-M2rtTA Addgene #20342
Gelatin from Porcine Skin Type A Sigma-Aldrich #G1890
Gibco L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific #25030-024
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) ThermoFisher Scientific #11140-035
Hematopoietic medium, MyeloCult H5100 STEMCELL Technologies #05150
Hexadimethrine bromide (polybrene) Sigma-Aldrich #H9268
Human Dermal Fibroblasts (HDFs) ScienCell #2320
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) GE Healthcare #SH30243.01
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) GE Healthcare #SV30160.03
HyClone Penicillin Streptomycin 100x Solution (Pen/Strep) GE Healthcare #SV30010
HyClone Phosphate Buffered Saline solution (PBS) GE Healthcare #SH30256.01 
Hydrocortisone STEMCELL Technologies #7904
Mouse serum Sigma-Aldrich #M5905
PE anti-human CD9 Antibody clone HI9a BioLegend #312105
pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 Addgene #125600
pFUW-tetO-FOS Addgene #125598
pFUW-tetO-GATA2 Addgene #125028
pFUW-tetO-GFI1B Addgene #125597
pLV-tetO-HA-GFI1B Addgene #125599
pMD2.G Addgene #12259
psPAX2 Addgene #12260

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 153 हेमेजेनिक reprogramming फाइब्रोब्लास्ट प्रतिलेखन कारक hematopoiesis hematopoietic स्टेम और संतति कोशिकाओं endothelial-to-hematopoietic संक्रमण

Erratum

Formal Correction: Erratum: Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors
Posted by JoVE Editors on 12/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors. The author affiliations were updated.

The second author affiliation was updated from:

2Wallenberg Center for Molecular, Lund University

to:

2Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University

ट्रांसक्रिप्शन कारकों की प्रबल अभिव्यक्ति द्वारा मानव फाइब्रोब्लास्ट्स के हेमोजेनिक रिप्रोग्रामन
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Silvério-Alves, R., Gomes, A.… More

Silvério-Alves, R., Gomes, A. M., Kurochkin, I., Moore, K. A., Pereira, C. F. Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors. J. Vis. Exp. (153), e60112, doi:10.3791/60112 (2019).

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