الفخاخ خارج الخلية العدلات (NETs) هي هياكل ثلاثية الأبعاد ولدت من قبل المحببات العدلات حفز. وقد أصبح من الواضح في السنوات الأخيرة أن الـ NETs تشارك في مجموعة واسعة من الأمراض. وقد يكون للكشف عن الـ NETs في الأنسجة أهمية تشخيصية، ولذلك يلزم وضع بروتوكولات موحدة لوضع العلامات على مكونات الشبكة.
المحببات العدلات، وتسمى أيضا الكريات البيض متعددة الأشكال النووية (PMN) بسبب نواة الفصية، هي النوع الأكثر وفرة من الكريات البيض. وهي تنضج في نخاع العظم وتُطلق في الدم المحيطي، حيث تدور لمدة تنحو 6-8 ح. ومع ذلك، في الأنسجة، فإنها يمكن أن البقاء على قيد الحياة لعدة أيام. عن طريق الانحلال من خلال البطانة ، فإنها تترك مجرى الدم ، وتدخل الأنسجة ، وتهاجر نحو موقع العدوى بعد التدرجات الكيميائية. يمكن للالعدلات مكافحة الكائنات الحية الدقيقة الغازية عن طريق الفيروسيتو، وإزالة التحبيب، وتوليد الفخاخ خارج الخلايا العدلات (NETs). سيساعد هذا البروتوكول على الكشف عن الـ NETs في الأنسجة المضمنة بالبارافين. الـ NETs هي نتيجة لعملية تسمى NETosis، مما يؤدي إلى إطلاق المكونات النووية، الحبيبية، والسيتوبلازمية إما من العيش (NETosis الحيوية) أو الموت (NETosis الانتحارية) العدلات. في المختبر، تشكل الـ NETs هياكل تشبه السحابة، والتي تشغل مساحة أكبر عدة مرات من مساحة الخلايا التي نزلوا منها. العمود الفقري للNETs هو الكروماتين، والتي ترتبط بها مجموعة مختارة من البروتينات والببتيدات الناشئة من حبيبات والسيتوبلازم. وبالتالي، يتم الحفاظ على تركيز محلي عال من المركبات السامة بحيث يمكن للتكنولوجيات الجديدة التقاط وتعطيل مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض بما في ذلك البكتيريا والفطريات والفيروسات والطفيليات، في حين أن انتشار مكونات NET عالية النشاط مما يؤدي إلى الضرر في الأنسجة المجاورة محدودة. ومع ذلك، فقد أصبح من الواضح في السنوات الأخيرة أن الـ NETs، إذا تم توليدها بوفرة أو تطهيرها بشكل غير كاف، لديها إمكانات مرضية تتراوح بين أمراض المناعة الذاتية والسرطان. وهكذا، فإن الكشف عن الـ NETs في عينات الأنسجة قد يكون له أهمية تشخيصية، ويمكن أن يؤثر الكشف عن الـ NETs في الأنسجة المريضة على علاج المرضى. وبما أن عينات الأنسجة المضمنة بالبارافين هي العينة القياسية المستخدمة في التحليل المرضي، فقد طُلب إنشاء بروتوكول لتلطيخ الفلورسنت لمكونات الشبكة في الأنسجة المضمنة بالبارافين باستخدام الأجسام المضادة المتاحة تجارياً.
الفخاخ خارج الخلية العدلات (NETs) لديها بنية معقدة ثلاثية الأبعاد. كشف التحليل المجهري للمسح الإلكتروني عالي الدقة أنها تتألف من ألياف ناعمة يبلغ قطرها 15-20 نانومتر (كروماتين) مرصعة بمجالات كروية من > 25 نانومتر والتي يفترض أنها تتكون من مجموعة متنوعة من حوالي 30 الحبيبية والسيتوبلازمية البروتينات والببتيدات1،2. عندما يتم إنشاؤها في المختبر من العدلات المعزولة، يمكن تحديد NETs عن طريق تلطيخ اثنين أو أكثر من مكوناتها عن طريق الفلورة المناعية (على سبيل المثال، الهيستونات والعدلات elastase [NE]). في الكريات البيض متعددة الأشكال غير المحفزة (PMN)، تقع النغمات حصرا في النواة، في حين يتم احتواء NE في حبيبات. خلال NETosis، NE يدخل النواة، حيث يعالج النغمات3،4. تتميز الـ NETs بالتوطين المشترك للمكونات، والتي يتم فصلها بوضوح في العدلات غير المحفزة. وبما أنه لا توجد حالياً أجسام مضادة تكشف حصراً عن الepitopes اتّهيّة محددة من NET (أي لا تتفاعل مع العدلات السذاجة)، فإن الكشف عن التوطين المشترك لبروتينات العدلات في الـ NETs هو السبيل الوحيد لتحديد الـ NETs.
في الأنسجة، لا يمكن الكشف عن الـ NETs بواسطة البقع النسيجية التقليدية (على سبيل المثال، عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين/يوسين [H&E]، الذي يصور الـ NETs على أنه مسحة مزرق شاحبة منتشرة). فقط عندما وفيرة للغاية، NETs يمكن تمييزها بوضوح مع H & E تلطيخ، كما هو الحال في thrombi5. وبما أن الـ NETs منتشرة في حد ذاتها، يجب الحفاظ على بنية الأنسجة على النحو الأمثل، لذلك فإن المستحضرات بالتبريد التي هي عرضة للحث على تجميد القطع الأثرية هي دون المستوى الأمثل لتحليل الـ NETs في الأنسجة. بدلا من ذلك، وقد ثبت تثبيت الفورمالديهايد وتضمين البارافين للحفاظ على بنية NET في الأنسجة جيدا2. (المناعية)الفحص النسيجي لأقسام الأنسجة المضمنة بالبارافين هو الأسلوب القياسي للتحليل المرضي. كما يتم الحفاظ على الأنسجة في كتل البارافين حتى في درجة حرارة الغرفة (RT)، يمكن مقارنة عينات الأنسجة من العمل التشخيصي اليومي مع العينات التي تم إعدادها منذ سنوات، مع الأسئلة والتقنيات التي نشأت مؤخرا. لم يتم الكشف عن الـ NETs في الأنسجة حتى وقت قريب، وقد يؤدي التحليل المفصل لتكوين NET وإزالتها أثناء سير الأمراض إلى رؤى جديدة في مسببات الأمراض. استخدام الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين له ميزة لا تقدر بثمن للسماح بتحليل المواد الأرشيفية وإجراء دراسات بأثر رجعي6. ومما لا شك فيه أن هذه الفوائد تأتي بتكلفة. قبل التضمين في البارافين، يجب أن تكون الأنسجة الفورمالديهايد ثابتة، وجافة وساخنة فوق 50 درجة مئوية. هذه الإجراءات تحفز الفلورة الذاتية الأنسجة، فضلا عن إخفاء الظهارة.
للحد من القطع الأثرية التثبيت، يجب أن تبقى فترة التثبيت إلى الحد الأدنى، لذلك يجب أن لا يتجاوز حجم عينات الأنسجة مساحة 20 مم × 30 ملم مع سمك ~ 3 ملم. يتم إصلاح عينات من هذا الحجم تماما بعد حضانة بين عشية وضحاها في RT في الفورمالديهايد، تليها بشكل مثالي الجفاف المباشر وتضمين البارافين. بدلاً من ذلك، يمكن تخزين عينات ثابتة لمدة 1 أو 2 أيام في المخزن المؤقت. بالنسبة لدراسات الفلورة المناعية، ينبغي إعداد المثبت طازجًا من البارافورمالهايد المذاب في مخزن مؤقت مناسب (على سبيل المثال، المالحة المخزنة بالفوسفات [PBS] أو المالحة المترسبة [TBS]). أثناء التحضير المثبت، يجب أن تبقى درجة الحرارة أقل من 60 درجة مئوية لمنع تشكيل حمض الفورميك. الفورماين، وهو المثبت القياسية لعلم الأمراض، لا ينبغي أن تستخدم لأنه يحتوي على الميثانول، والألدهيدات الأخرى، الكيتونات، وحمض الفورميك. هذه الشوائب تؤدي إلى زيادة النعت اخفاء والأنسجة الذاتية كبيرة.
لعلامات المناعة الناجحة، يجب أن يعود إخفاء الظهارة في عملية تسمى استرداد مستضد. يتم تسخين أقسام الأنسجة في عازلة مناسبة، والتي يعتقد أن كسر جسور الميثيلين، حتى تصبح epitopes في متناول الأجسام المضادة7. للكشف عن الـ NETs، يفضل استرجاع الظهارة الناجم عن الحرارة (HIER) على طرق أخرى مثل استخدام الإنزيمات البروتيوليتيكية. بشكل روتيني، يتم وضع العلامات المناعية لأقسام البارافين مع جسم مضاد واحد متبوعاً بجسم مضاد ثانوي يحمل علامة بيروكسيداز، والذي يتم اكتشافه بالركيزة المعجّلة. بالمقارنة مع الفلورة المناعية، وأساليب الكشف المستندة إلى الإنزيم لديها أقل الدقة المكانية بسبب انتشار الركيزة يعجل، وعموما، الكشف في وقت واحد من أكثر من مستضد واحد محدود6.
كما لا توجد حاليا الأجسام المضادة التي ترتبط حصرا إلى NETs، ويستخدم هذا البروتوكول لتسمية اثنين من البروتينات، الهيستون 2B، وهو نووي، وelastase العدلات، والتي يتم توطينها في حبيبات. في العدلات غير المحفزة، يتم فصل هذه البروتينات، ولكن يتم توطينها في العدلات التي تمر بـ NETosis وفي NETs. ويمكن الكشف المتزامن عن مستضدين بهيئتين مضادتين رئيسيتين رُفعا في مضيفين مختلفين وأجسامان مضادتان ثانويتان خاصتان بالأنواع يحملان علامات مختلفة من الفلوروكروم. هذا التقرير هو توحيد للبروتوكول8 الذي نُشر سابقاً ويستخدم مزيجاً من أجساممضادة متاحة تجارياً تلطيخ مكونات NET بشكل موثوق به في الأنسجة المضمنة بالبارافين، الطازجة منها والأرشيفية على حد سواء، من أصل بشري ومورين.
مع تزايد الوعي بدور NETs خلال مسببات الأمراض9، الكشف عنها في الأنسجة من المرضى أو الحيوانات التجريبية تكتسب أهمية متزايدة. عينات الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين لديها عدد من المزايا بالمقارنة مع غيرها من المستحضرات الأنسجة (على سبيل المثال، أقسام من العينات المحفوظة بالتبريد). ومن الواضح أن الحفاظ على الأنسجة في العينات المضمنة بالبارافين متفوق، وبمجرد أن يتم دمجها، يتم الحفاظ على العينات لعقود، مما يتيح إجراء دراسات رجعية. للكشف عن الـ NETs، التي هي هياكل التخريم، حفظ عينة جيدة هو شرط مسبق يستبعد استخدام المواد المحمية بالتبريد، والتي هي عرضة لتلف الأنسجة بسبب تشكيل الكريستال الجليد التي يمكن أن تؤدي إلى القطع الأثرية تشبه شكليا شبكات.
للحفظ الأمثل، يجب إصلاح الأنسجة من الحيوانات التجريبية بعد وقت قصير من الموت، من الناحية المثالية عن طريق التسريب، لتجنب الانلل التلقائي. كما المثبتة، أعدت حديثا أو الحلول الطازجة من البارافورمالهايد في عازلة مناسبة مثل TBS أو خام PBS الأمثل. يتم تعريف هذا كيميائيا على النقيض من الاستعدادات formalin المستخدمة في الأنسجة القياسية، ويحفز أقل الأنسجة autofluorescence. على النقيض من ذلك، لا يتم إصلاح الأنسجة البشرية في كثير من الأحيان مباشرة بعد الختان، وكما المثبتة، وعادة ما يتم استخدام تخفيف 10٪ من formalin الذي يحتوي على 10٪ إلى 15٪ من الميثانول كمثبت لمنع البلمرة، فضلا عن حمض الفورميك، والألدهيدات الأخرى، والكيتونات . في كثير من الأحيان، يتم تخزين الأنسجة في هذا المثبت لفترات طويلة من الوقت قبل التضمين. يمكن أن تكون النتيجة الانلل التلقائي (اعتمادا على الوقت بين الختان والتثبيت)، وتشكيل مفرط من جسور الميثيلين بسبب الإفراط. تثبيت الفورمالديهايد يحفز تغييرات في الهيكل الثالثي للبروتينات عن طريق تشكيل جسور الميثيلين داخل وبين الجزيئية10. مكونات الخلايا غير البروتينية مثل الأحماض النووية والكربوهيدرات والدهون ليست ثابتة مباشرة، ولكن هائجة في شبكة البروتين ثلاثي ة الأبعاد. وللحصول على وضع العلامات الناجحة، يتعين كسر روابط الميثيلين لفضح الأوطاب في عملية استرجاع المستضد. ويتم ذلك عن طريق تسخين أقسام الأنسجة المثبتة على الشرائح المجهر في مناسبة الحرارة الناجمة عن مستضد المستضد العازلة (HIER العازلة)11. قامت دراستنا السابقة بتحليل تأثير درجة الحموضة ودرجة حرارة المخازن المؤقتة HIER على الكشف عن مكونات NET في الأنسجة المفبرة، ووجد أن المعالجة المسبقة الناجحة للأنسجة لمكون واحد غالبا ً ما تكون دون المستوى الأمثل للمكون الثاني8.
في هذه الأثناء، تم العثور على أن تسخين الأنسجة إلى 70 درجة مئوية في المخزن المؤقت HIER في درجة الحموضة من 9 هو حل وسط جيد لكثير من مكونات NET وسوف تحتفظ الحفاظ على الأنسجة جيدة، والتي غالبا ما تتعرض للخطر في درجات حرارة أعلى. ويُقترح استخدام وقت الاسترجاع المشار إليه كنقطة انطلاق، ولكن لا سيما مع عينات المحفوظات من بارامترات التثبيت غير المعروفة، يمكن أن تكون شدة التلطيخ غير مرضية. في هذه الحالة، يمكن إطالة أو ارتفاع درجة الحرارة أثناء إجراء الاسترجاع تحسين كفاءة تلطيخ. وهذا يمكن أن تؤثر أيضا على تلطيخ الهيستون 2B من الأجسام المضادة IgY المستخدمة في بروتوكولنا. كما هو مبين في الشكل 1، يمكن العثور على الكروماتين منزوع المكثف في العدلات التي تمر NETosis وكذلك في البقع NETs أقوى بكثير مع هذا الجسم المضاد مقارنة مع الكروماتين في العدلات يستريح. هذا ربما يرجع إلى تقييد الوصول إلى جزيء IgY 180 كيلودا إلى نوى مدمجة، وقد تختلف بعد زيادة الانتعاش الظهاري. وهذا قد يكثف كفاءة ملزمة حتى في مجالات الكروماتين المكثف، والتي سوف تؤدي إلى الفلورة أقوى في النوى العادية من العدلات وغيرها من الخلايا. الفرق في تلطيخ الكفاءة بين العدلات التي تمر NETosis والعدلات غير محفزيمكن أن تكون أقل وضوحا مما هو موضح في الشكل 1. ولا يزال من المقرر تحديد مناطق تكوين الشبكة من خلال التوطين المشترك لـ NE وH2B وDNA.
يمكن إجراء التثبيت أيضا أن يؤدي إلى الفلورة الذاتية كبيرة من الأنسجة، أساسا في الجزء المزرق / الأخضر من الطيف. من المهم تجنب معظم هذه الفلورة باستخدام مجموعات كافية من فلتر الفلورة الضيقة (المجال الواسع) أو إعدادات الكشف (البؤرة) التي تتطابق مع الحد الأقصى للانبعاثات من الفلوروكروم المستخدم مع الإثارة الزرقاء، على سبيل المثال، Cy2، Alexafluor 488- وفي الحالات القصوى من الفلورة الذاتية، ينبغي تجنب الجزء المزرق/الأخضر من الطيف. بدلاً من ذلك، يمكن الكشف عن إشارات الفلورة أسهل في الجزء الأحمر البعيد من الطيف (على سبيل المثال، الأجسام المضادة الثانوية المقترنة Cy 5 أو Alexafluor 635)، ولكن هذا يتطلب كاميرات سوداء/بيضاء غير مرشحة أو مجاهر بؤرية. وبما أن العين البشرية غير حساسة إلى حد ما تتجاوز 600 نانومتر، لا يمكن اكتشاف إشارات الفلورة الحمراء البعيدة باستخدام العين. وعلى أية حال، من المهم استخدام عناصر التحكم السلبية (مثل ضوابط سيرا/إيسوتيبي غير المناعية بدلاً من الأجسام المضادة الأولية أو حذف الأجسام المضادة الأولية) لتحديد أوقات التعرض المناسبة أو إعدادات الكاشف.
يمكن تحليل مقاطع الأنسجة من 1-2 ميكرومتر باستخدام مجاهر واسعة باستخدام أهداف 10x أو 20x. توفر هذه العدسات عمق بؤري كبير، لذلك (تقريبا) قسم الأنسجة بأكمله سيكون في التركيز. ويمكن استخدام هذا لمسح أقسام الأنسجة بسرعة لمناطق تكوين NET إذا كانت كبيرة بما فيه الكفاية (كما هو الحال في الشكل 1). التعريب المشترك للقنوات الخضراء (NE) والأحمر (H2B) والأزرق (DNA) يؤدي إلى تلطيخ أبيض يشير إلى مناطق تشكيل NET(الشكل 1G). بالنسبة للتكبيرات الأعلى، من الضروري وجود مجاهر مجهر ذات بؤرية أو واسعة مع deconvolution. ويبين الشكل 2 تفاصيل عينة التهاب الزائدة الدودية البشرية المستخدمة أيضاً في الشكل 1. في الشكل 2A، NE توطين إلى نقاط صغيرة (حبيبات) ، ولكن نسبة كبيرة خارج الخلية ، وغالبا ما تشكل المشارب التي تتداخل مع H2B(الشكل 2B) والحمض النووي(الشكل 2C). ينتج عن هذا التعريب المشترك تراكب أبيض يشير إلى NETs(الشكل 2D). ويمكن العثور على نمط مماثل جدا في قسم الرئة من فأر مصاب بالسل M. (الشكل 3).
وتتميز العينات المعروضة هنا بمناطق ذات درجة عالية من تكوين NET التي يمكن تحديدها حتى عند التكبير المنخفض. اعتمادا على كثافة الأنسجة والتحفيز ذات الصلة، تشكيل NET يمكن أن يكون أقل وضوحا بكثير، وصولا إلى تشكيل صافي من مجموعات صغيرة من العدلات (على سبيل المثال في التهاب عضلة القلب، انظر منشور سابق12). ويُعتقد أن هذا البروتوكول سيساعد على تعزيز المزيد من البحوث بشأن الـ NETs في الأنسجة، ونأمل أن يساعد في كشف الأدوار غير المعترف بها للأمراض غير المعترف بها في تكوين الأمراض أو الوقاية منها.
The authors have nothing to disclose.
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
embedding molds | Sakura | 4162 | |
embedding station | Microm | AP280 | |
ethanol | Roth | 9065.4 | |
filter paper, rolled | OCB | ||
forceps | Dumont | 7a | |
glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
glycerol | Roth | 3783.1 | |
HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
normal donkey serum | Merck | S30 | |
PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
scalpel | Braun | Fig.22 | |
Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
Tween 20 | Fluka | 93773 | |
water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |