Summary
嗜中性粒细胞外陷阱（NETs）是由刺激的中性粒细胞产生的三维结构。近年来，人们清楚地认识到，NET与各种各样的疾病有关。检测组织中的 NET 可能具有诊断相关性，因此需要标准化的 NET 组件标签协议。
Abstract
中微粒细胞，也称为多态核白细胞（PMN），由于其叶状核，是最丰富的白细胞类型。它们在骨髓中成熟，并释放到外周血中，在那里循环约6~8小时;然而，在组织中，它们可以存活数天。通过内皮的分体，它们离开血流，进入组织，并在化学梯度后迁移到感染部位。嗜中性粒细胞可以通过噬菌体、脱粒和产生嗜中性粒细胞外陷阱（NETs）来对抗入侵的微生物。该协议将有助于检测石蜡嵌入组织中的NET。NETs 是称为 NETosis 的一个过程的结果，它导致核、粒状和细胞质成分从活的（重要的 NETosis）或死亡（自杀性 NETosis）嗜血杆菌中释放。在体外，NET形成云状结构，其空间比它们从细胞中产生的细胞大好几倍。NET的骨干是染色质，从颗粒和细胞质产生的蛋白质和肽的选择被束缚。因此，保持有毒化合物的高局部浓度，以便 NET 可以捕获和灭活各种病原体，包括细菌、真菌、病毒和寄生虫，同时扩散高度活跃的 NET 成分，从而导致邻近组织是有限的。然而，近年来，人们已经很明显地发现，NETs，如果大量产生或清除不足，确实有从自身免疫性疾病到癌症的病理潜力。因此，在组织样本中检测NET可能具有诊断意义，在病变组织中检测NET会影响患者的治疗。由于石蜡嵌入组织样本是用于病理分析的标准标本，因此寻求利用市售的抗体建立石蜡嵌入组织中NET成分的荧光染色方案。
Introduction
嗜中性粒细胞外陷阱（NETs）具有复杂的三维结构。高分辨率扫描电子显微分析表明，它们由直径为 15–20 nm（染色质）的光滑纤维组成，球状域为 >25 nm，大概由大约 30 粒粒状和细胞质的分类组成蛋白质和肽1，2。当从分离的嗜中性粒细胞体外产生时，通过免疫荧光（例如，组蛋白和嗜中性粒细胞乳化酶[NE]）染色来识别NET。在未刺激的多态核白细胞（PMN）中，组蛋白完全位于细胞核中，而NE则包含在颗粒中。在NETosis期间，NE进入细胞核，在那里它处理组蛋白3，4。NET的特点是成分的共定位，这些成分在未刺激的中性粒细胞中明显分离。由于目前不存在专门检测 NET 特异性表位的抗体（即，不要与幼性嗜中性粒细胞发生反应），因此检测 NET 中嗜中性粒细胞蛋白的共定位是识别 NET 的唯一方法。
在组织中，NET 很难被传统的组织学污渍检测出来（例如，通过染色血氧林/eosin [H&E]，后者将 NET 描述为漫射淡蓝色色调）。只有当高度丰富时，NET 可以清楚地区分与 H&E 染色， 如在血栓5。由于NET本身是扩散的，组织结构必须得到最佳保存，因此容易诱发冷冻伪影的冷冻制剂对于组织内NET的分析则不理想。相反，甲醛固定和石蜡嵌入已被证明在组织井2中保持NET结构。（免疫-）石蜡嵌入组织各部分的组织学检查是病理分析的标准方法。由于石蜡块中的组织即使在室温 （RT） 下也能保存，因此日常诊断工作中的组织标本可以与几年前准备的标本进行比较，以及最近出现的问题和技术。组织中的NET直到最近才被发现，对疾病过程中的NET形成和去除的详细分析可能导致对发病机制的新见解。使用石蜡嵌入组织具有宝贵的优势，可以分析档案材料，并进行回顾性研究6。不可否认，这些好处是有代价的。在嵌入石蜡之前，组织必须固定甲醛，脱水并加热到50°C以上。这些程序诱导组织自荧光以及表位掩蔽。
为了限制固定伪影，固定时间应保持在最小，因此组织样本的大小不应超过 20 mm x 30 mm 的面积，厚度不应为 ±3 mm。这种大小的样品在甲醛的RT中过夜孵育后完全固定，理想情况下是直接脱水和石蜡嵌入。或者，固定样品可以在缓冲中储存1天或2天。对于免疫荧光研究，修复剂应从溶解在适当缓冲液中的甲醛中新鲜制备（例如，磷酸盐缓冲盐水 [PBS] 或 Tris 缓冲盐水 [TBS]）。在固定制备过程中，温度必须保持在60°C以下，以防止甲酸的形成。FORMALin是病理学的标准固定剂，不应使用，因为它含有甲醇、其他醛、酮和甲酸。这些杂质导致表位掩蔽和显著的组织自荧光增加。
为了成功进行免疫标记，必须在称为抗原检索的过程中还原表位掩蔽。组织部分在适当的缓冲液中加热，据信会破坏亚甲桥，因此表皮变得可进入抗体7。对于 NET 的检测，热诱导表位检索 （HIER） 优先于其他方法，如使用蛋白解酶。通常，石蜡部分的免疫标记使用单个抗体进行，然后是带有过氧化物酶标记的二级抗体，该抗体用沉淀基质检测。与免疫荧光相比，基于酶的检测方法由于基质沉淀物扩散而具有较低的空间分辨率，而且通常同时检测一种以上的抗原是有限的。
由于目前不存在专门与NET结合的抗体，该协议用于标记两种蛋白质，即组蛋白2B（即核蛋白）和中性粒细胞器酶（在颗粒中局部化）。在未刺激的中性粒细胞中，这些蛋白质是分开的，但它们在进行NETosis的嗜中性粒细胞和NET中共同位置化。通过两种在不同宿主中升高的初级抗体和两种带有不同荧铬标签的物种特异性二级抗体，可以同时检测两种抗原。本报告是我们先前发布的协议8的标准化，它使用了两种市售的抗体的组合，这些抗体能够可靠地在石蜡嵌入的组织中染色人体内的NET成分，包括新鲜和存档的人类和鼠原成分。
Protocol
组织协议由德国柏林索济阿莱斯的兰德桑特·格松海特（G0121/16）批准。实验是根据欧洲关于动物护理、福利和治疗的第2010/63/EU号指令进行的。
1. 固定、脱水、石蜡嵌入、切片、切片安装
- 通过在TBS（pH 7.4）中溶解甲醛，制备2%甲醛溶液。避免加热超过 60°C。冷却至RT.甲醛溶液可储存在-20°C。
- 将新鲜组织（此处：小鼠肺）放入带 TBS 的玻璃培养皿中。使用手术刀，将大小不超过 20 mm x 30 mm 的片断分解为尺寸不超过 20 mm x 3 mm 的部件。将试样浸入 TBS 中的 2% 甲醛溶液中。
注：固定剂的体积应至少是组织体积的20倍。 - 在 RT 上固定 8~20 小时，将试样转移到 TBS.放入盒式磁带中。
- 使用一系列乙醇脱水（70%，80%，90%，96%，100%，100%），每步持续1小时。
- 清除样品2x在100%二甲苯（二甲基苯），每个步骤1小时。
- 浸泡在石蜡2倍60°C（熔融温度54~56°C），每步1小时。
- 使用嵌入模具安装试样，使用盒底作为盖。
- 让石蜡凝固并去除嵌入模具。
- 准备3μm组织部分，并让他们漂浮在37°C水浴。
- 水面上的浮断部分浮到粘合玻璃滑梯上（材料表）。
- 在40°C下孵育玻璃玻片部分过夜，将组织粘结到玻璃上。
2. 补液、热诱导表位检索、染色、安装、微观分析
- 将部分放在机架中的玻璃滑片上，然后按照相反的顺序将它们浸入用于脱水和清除的介质中，每步为 5 分钟：2x 100% 二甲苯、乙醇系列（2x 100%、96%、90%、80%、70%）。
- 用温度控制的热板将水浴加热到 70°C。放置一个装满热诱导表位检索（HIER）缓冲液（pH 9;材料表），含有10%甘油作为温度缓冲液，放入水浴中。当 HIER 缓冲液达到 70°C 时，将带滑片的机架放入缓冲罐中。
- 在 70°C 下孵育幻灯片 120 分钟。
- 从水浴中取出罐子，让它冷却到RT。用去离子水冲洗3x部分，用TBS（pH 7.4）冲洗一次。
- 用卷制的滤纸或棉签小心地从滑片中去除液体，使部分保持水合。
- 使用疏水屏障笔在截面周围创建屏障。
- 在RT中孵育块在阻断缓冲液（1%牛血清白蛋白[BSA]，2%正常驴血清，5%冷水鱼明胶和洗涤剂[材料表]在TBS）30分钟，以防止非特异性结合。
- 在阻断缓冲液中以1μg/mL的浓度稀释原抗体。
注：对于人和小鼠NET，可以使用兔抗体对抗中性粒细胞酶和鸡抗体对抗组蛋白2B（材料表）。 - 将幻灯片放入潮湿室。去除阻塞缓冲液，在不清洗的情况下将稀释的原抗体加入至各部分，使用足够的体积防止干燥。用石蜡薄膜密封潮湿室，并在RT孵育过夜。
- 用 TBS 清洗第 3 节，每次 5 分钟。
- 在阻断缓冲液中制备二次抗体的工作溶液。为了检测原发抗体，使用驴中培养的二级抗体，并针对来自多个物种的血清蛋白进行预吸收（材料表）。用二级抗体的工作溶液覆盖组织部分。将滑梯转移到潮湿室，用石蜡薄膜密封。在 RT 孵育 1 小时。
注：驴抗兔与Cy2和驴抗鸡结合Cy3可以结合DNA计数器。 - 用 TBS 将部分 3 次洗涤 5 分钟，然后用去离子水清洗 5 分钟。
- 用安装介质（材料表）盖住部分，并应用盖玻璃，避免气泡形成。
- 让安装介质凝固，然后使用带适当带通滤波器或共聚焦显微镜的广域显微镜分析免疫荧光。
Representative Results
使用该协议，NET组件可以在石蜡嵌入组织中成功检测出人类和鼠原的石蜡嵌入组织。在未刺激的嗜中性粒细胞中，H2B完全位于颗粒中的细胞核和中性粒细胞酶中;因此，它们的荧光信号不会重叠。相反，在NETosis和NET形成后，NE、H2B和DNA部分地并网。如果图像为绿色、红色和蓝色信号，则共定位区域将描述为白色覆盖（图 1G、图 2D和图 3D）。也可以使用图像分析软件量化此叠加。来自对绿色、红色和蓝色为正的重叠信号的像素已用于创建图1G、图 2D和图3D中描绘 NET 区域的紫色叠加。图1和图2中的一些细胞有叶状核，但对NE呈阴性。据认为，这些细胞是嗜酸性粒细胞。
如果组织部分的厚度为2~3μm，可以使用10倍或20倍的物镜进行宽场显微镜分析。图 1中提供了一个示例，其中描述了为 NE（绿色）、H2B（红色）和 Hoechst 33342（蓝色）染色的人类尾炎组织。面板A、C、E和G来自包含NET的截面区域，而面板B、D、F和H来自同一部分的不同区域，其中含有大量嗜中性粒细胞（图1B，NE），但没有NET。具有大规模NET形成的区域即使在低放大倍率下也很容易找到，因为所有三个NET组件都同时进行局部化，通常位于细腻的细胞外结构中，在三个通道的叠加中显示为白色细胞外纤维（图1G）），图 1G中的紫色叠加。
两个组织区域的染色模式明显不同，NE包含在颗粒（图1B）和核DNA（图1F）。有趣的是，与含蚊帐的组织相比，H2B在富中性粒细胞地区的染色相当弱（图1D）。这可能是由于抗体的大小（IgY有180 kD，而IgG为150 kD），这可能阻止与完整核中的紧凑型染色质结合，而如果染色质与NET中的情况一样脱凝，则有利于接触H2B（图1C）。
对于更高的分辨率，必须使用共聚焦显微镜或具有反卷积的宽场显微镜来最小化失焦模糊。图 2描绘了来自同一人类尾炎标本的 NET 丰富区域。它是共聚焦堆栈的最大投影。NE（绿色，图2A）存在于颗粒中，但也富含细胞外，它与H2B（红色，图2B）和DNA（蓝色，图2C）共同位置。细胞外共定位导致白色颜色组合 （图 2D）。这些像素对于绿色、红色和蓝色表示正值，用于创建图 2D中显示 NET 的紫色叠加。
图3是小鼠肺部感染结核分枝杆菌（M.tb ）的中央部分的一个细节。抗原检索和染色条件与图1和图2相同。同样，所有三个NET组件的共定位在嗜中性粒细胞之间是白色区域，它被用来创建一个紫色层，指示图3D'中的NET。
补图1显示了染色的特异性，图1描述了可忽略的染色与对照抗体，补充图1A，B描绘了兔子非免疫血清（绿色）和鸡抗GFP IgY（红色）。图 1C，D显示仅用二级抗体染色，组合与图1、图2和图3所用相同。补充图1A，C显示了与图1和图2类似的人类附录炎的一部分。 补充图1B，D是小鼠肺组织，类似于图3。脱氧核糖核酸被霍奇斯特33342染色。刻度条表示 25 μm。
图1：人类尾炎样品石蜡部分的广域荧光显微镜。
面板 A、C、E 和 G 描绘了具有 NET 的组织区域，而面板 B、D、F 和 H 显示了同一部分的不同区域，该部分富含嗜中性粒细胞，但没有 NET 形成。染色是针对NE（A，B;绿色），H2B（C，D;红色）和DNA（E，F;蓝色）。图 1G，H表示所有三个通道的叠加。所有颜色的强度在 80 到 256 之间的像素表示 NE、H2B 和 DNA 的重叠染色区域，并且被视为来自 NET 或 NE嗜中性粒细胞，这些区域经历 NETosis。这些像素在G面板中被伪为紫色，形成大面积;在面板H'中，只找到小点。图像是使用20倍物镜用宽场显微镜拍摄的，比例尺代表25μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：人尾炎样本中NET成分的共聚焦荧光显微镜。
使用了图1中使用的相同组织部分。（A） 对NE进行染色， （B）描述 H2B， 和 （C） Hoechst 33342 染色 DNA.（D） 所有三个通道的叠加。所有三个信号的共定位在面板D'中为伪紫色。为此，使用 Volocity 6.3 检测了所有三种颜色中强度大于 80 的像素。紫色区域描绘了 NET 或嗜中性粒细胞经历 NETosis。图像以Z-stack的形式用共聚焦显微镜拍摄，并作为最大投影呈现。比例尺表示25μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：小鼠肺部感染M.tb的NET成分的共聚焦荧光显微镜。
它是一个细节，从一个完整的肺与大规模嗜中性粒细胞渗透的一部分的中央部分。（A） NE 染色， （B） H2B 染色， 和 （C） DNA 染色.（D） 所有三个通道的叠加。面板D'中的紫色叠加表示所有三种颜色的强度值为 >80 的像素，表示嗜中性粒细胞正在接受 NETosis 和 NET。这些图像被作为Z堆栈与共聚焦显微镜，并作为最大投影呈现。比例尺表示25μm。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图1：与不相关的原抗体染色控制。图1和图2和图3分别用于人体（A、C）和鼠组织（B、D），分别被不相关的原抗体（A、B）或无原抗体（C、D）染色。作为A组和B组控制的主要抗体，应用了非免疫兔和鸡IgY对GFP的血清。二级抗体与所有其他染色中所示相同，也用于C和D面板。正如所料，在所有条件下，都检测到可忽略不计的背景染色，说明用于图1、图2和图3的抗体的特异性。图像是用共聚焦显微镜拍摄的，DNA上沾有Hoechst 33342，比例尺代表25μm。请点击此处下载此图。
Discussion
随着人们对NET在发病机制9中的作用的认识日益提高，从患者或实验动物的组织中检测它们变得越来越重要。与其他组织制剂（例如冷冻保存的标本部分）相比，石蜡嵌入组织样本具有许多优点。石蜡嵌入样品中的组织保存明显优越，一旦嵌入，这些样品可保存数十年，从而进行逆行研究。对于NET的检测，这是丝状结构，良好的样品保存是排除使用冷冻材料的先决条件，因为冰晶形成容易造成组织损伤，从而在形态上产生类似形态的文物网。
为了获得最佳保存，实验动物的组织应在死亡后不久固定，最好是灌注，以避免自流。作为固定、新鲜制备或新鲜解冻的甲醛溶液，在适当的缓冲液（如 TBS 或 PBS 矿石）中最佳。这与用于标准组织学的正霉制剂相比，化学定义，并诱导较少的组织自荧光。相反，人体组织在切除后通常不会直接固定，作为固定，通常使用10%稀释的甲酸，其中含有10%至15%的甲醇作为稳定剂，以防止聚合，以及甲酸，其他醛和酮.通常，组织在嵌入前储存在这种固定剂中很长时间。其结果可以是自动解压（取决于切除和固定之间的时间），以及由于过度固定而过度形成亚甲桥。甲醛固定通过形成分子内和分子间亚甲桥10，诱导蛋白质的三级结构变化。核酸、碳水化合物和脂质等非蛋白质细胞成分不是直接固定的，而是固定在三维蛋白质网络中。为了成功贴标，在抗原检索过程中必须打破亚甲键以暴露表位。这是通过在适当的热诱导抗原检索缓冲液（HIER缓冲液）11中加热安装在显微镜上的组织部分来实现的。我们先前的研究分析了HIER缓冲液的pH值和温度对石蜡化组织NET成分检测的影响，发现对一个组分的成功组织预处理对于第二个组分8来说往往不理想。
同时，已经发现，在HIER缓冲液中加热到70°C的pH值为9对许多NET成分来说是一个很好的折衷，并且会保持良好的组织保存，这在较高温度下经常受到损害。建议以指定的检索时间为起点，特别是对于未知固定参数的档案标本，染色强度不能令人满意。在这种情况下，在检索过程中延长或升高温度可以提高染色效率。这也会影响我们协议中使用的IgY抗体的组蛋白2B染色。如图1所示，脱凝血染色质在进行NETosis的嗜中性粒细胞中以及NET的染色剂中比休息的嗜中性粒细胞中的染色质要强得多。这可能是由于180 kDa IgY分子对紧凑核的受限访问，在表位恢复增加后可能会有所不同。这也可能增强结合效率，即使在凝结染色质区域，这将导致神经粒细胞和其他细胞的正常核的荧光更强。患有NETosis的嗜中性粒细胞和非刺激性中性粒细胞之间的染色效率差异可能不如图1所示明显。NET形成区域仍将通过NE、H2B和DNA的共同定位来识别。
固定程序还可以诱导组织显著自荧光，主要在光谱的蓝/绿部分。使用足够的窄带通荧光滤波器集（广域）或探测器设置（共聚焦），与蓝色激发中使用的荧光铬的发射最大值相匹配，例如 Cy2、Alexafluor，避免大多数自荧光非常重要。488. 在自荧光的极端情况下，应避免光谱中的蓝色/绿色部分。相反，荧光信号可以在光谱的远红色部分（例如，与 Cy 5 或 Alexafluor 635 耦合的二级抗体）中更容易检测，但这需要无滤的黑色/白色摄像机或共聚焦显微镜。由于人眼在 600 nm 以外相当不敏感，因此很难用眼睛检测出远红色荧光信号。在任何情况下，使用阴性对照（例如，非免疫血清/等型对照，而不是初级抗体或省略原抗体）来确定适当的暴露时间或检测器设置）都很重要。
1⁄2 μm的组织部分可以使用10倍或20倍物镜使用广域显微镜进行分析。这些透镜提供较大的焦距，因此（几乎）整个组织部分将处于焦点位置。这可用于快速扫描组织部分的NET形成区域，如果它们足够大（如图1）。绿色 （NE）、红色 （H2B） 和蓝色 （DNA） 通道的共定位导致白色染色，指示 NET 形成区域（图 1G）。对于更高的放大倍率，需要具有反卷积的共聚焦或宽场显微镜。图2显示了也用于图1的人类附录炎标本的详细信息。在图2A中，NE本地化为小点（颗粒），但很大一部分是细胞外，经常形成与H2B（图2B）和DNA重叠的条纹（图2C）。这种共同定位导致一个白色覆盖，指示NET（图2D）。在感染M.结核病的小鼠的肺部部分可以发现一种非常相似的模式（图3）。
这里介绍的样本的特点是具有高NET形成的区域，即使在低放大倍率下也能识别。根据组织密度和相应的刺激，NET的形成可能不那么明显，一些净粒细胞小组的形成（例如，在心肌炎中，见上一份出版物12）。据认为，该协议将有助于促进对组织内内免疫特的更多研究，并希望有助于解开NET在疾病形成或预防中未被承认的作用。
Disclosures
这项工作的资金来源是马克斯·普朗克协会。我们感谢阿图罗·齐奇林斯基批判性地阅读手稿和菲利普·赛卡利的老鼠组织。
Acknowledgments
作者没有什么可透露的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
| cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
| donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
| embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
| embedding molds | Sakura | 4162 | |
| embedding station | Microm | AP280 | |
| ethanol | Roth | 9065.4 | |
| filter paper, rolled | OCB | ||
| forceps | Dumont | 7a | |
| glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
| glycerol | Roth | 3783.1 | |
| HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
| moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
| Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
| normal donkey serum | Merck | S30 | |
| PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
| paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
| paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
| petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
| rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
| racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
| scalpel | Braun | Fig.22 | |
| Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
| tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
| Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
| Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
| Tween 20 | Fluka | 93773 | |
| water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
| widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
| xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |
References
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