Summary
Nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETs) uyarılmış nötrofil granülositler tarafından oluşturulan üç boyutlu yapılardır. Son yıllarda NET'lerin çok çeşitli hastalıklara karıştıkları ortaya çıkmıştır. Dokudaki NET'lerin saptanması tanısal bir önemi olabilir, bu nedenle NET bileşenlerinin etiketlenmesi için standart protokoller gereklidir.
Abstract
Lobulated çekirdeğinden dolayı polimorfonükleer lökosit (PMN) olarak da adlandırılan nötrofil granülositler en bol lökosit türüdür. Kemik iliğinde olgunlaşırlar ve periferik kana salınırlar ve yaklaşık 6−8 saat boyunca dolaşırlar; ancak, doku, onlar gün boyunca yaşayabilir. Endotel yoluyla diapedezis ile, onlar kan dolaşımını terk, dokulara girmek, ve kemotaktik gradyanlar aşağıdaki bir enfeksiyon sitesine doğru göç. Nötrofiller fagosittoz, degranülasyon ve nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NeTs) üretimi ile istilacı mikroorganizmalarla savaşabilirler. Bu protokol parafin gömülü dokuda NETs tespit etmek için yardımcı olacaktır. NET'ler, nükleer, granüler ve sitoplazmik bileşenlerin canlı (hayati NETosis) veya ölmekten (intihar netosisi) nötrofillerden serbest bırakılmasına yol açan NETosis adlı bir sürecin sonucudur. In vitro, NETs bulut benzeri yapılar oluşturur, hangi bir boşluk birkaç kat daha büyük bir alan kaplar lar ki, indi hücrelerin birkaç kat daha büyük. NETs omurgası kromatin, hangi protein ve peptidler granül ve sitoplazma kaynaklanan bir seçim bağlı olduğu. Böylece, NET'lerin bakteriler, mantarlar, virüsler ve parazitler de dahil olmak üzere çeşitli patojenleri yakalayıp etkisiz hale getirebilmeleri için yüksek yerel toksik bileşikler konsantrasyonu korunurken, son derece aktif NET bileşenlerinin difüzyonu komşu doku sınırlıdır. Bununla birlikte, son yıllarda, nets, bolca üretilen veya yetersiz temizlenmiş, kanser otoimmün hastalıklararasında değişen patolojik potansiyele sahip olduğu ortaya çıkmıştır. Bu nedenle doku örneklerinde NET'lerin saptanması tanısal öneme sahip olabilir ve hastalıklı dokudaki NET'lerin saptanması hastaların tedavisini etkileyebilir. Parafin gömülü doku örnekleri patolojik analiziçin kullanılan standart örnek olduğundan, ticari olarak mevcut antikorlar kullanılarak parafin gömülü dokuda NET bileşenlerinin floresan boyanması için bir protokol oluşturulmuştur.
Introduction
Nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETs) karmaşık üç boyutlu bir yapıya sahiptir. Yüksek çözünürlüklü tarama-elektron mikroskobik analizi, 15−20 nm (kromatin) çapı 15−20 nm (kromatin) olan ve muhtemelen yaklaşık 30 tanecikli ve sitoplazmik bir çeşitlemeden oluşan >25 nm küresel etki alanları ile çivilenmiş pürüzsüz liflerden oluştuğunu ortaya çıkardı. proteinler ve peptidler1,2. İzole nötrofillerden in vitro olarak üretildiğinde, NET'ler iki veya daha fazla bileşeninin immünoresans (örn. histones ve nötrofil elastaz [NE]) ile boyanması ile tanımlanabilir. Uyarılmamış polimorfonükleer lökositlerde (PMN), histones sadece çekirdekte bulunurken, NE granüllerde bulunur. NETosis sırasında, NE çekirdek girer, buradahistones3,4işler. NET'ler, uyarılmamış nötrofillerde açıkça ayrılan bileşenlerin kolokalizasyonu ile karakterizedir. Şu anda net spesifik epitoponları sadece tespit eden antikorlar olmadığından (yani, naif nötrofillerle reaksiyona girme), NÖTROFIL proteinlerinin NÖTR'lerde kolokalizasyonunu saptamak NET'leri tanımlamanın tek yoludur.
Dokuda, NETs neredeyse konvansiyonel histolojik lekeler tarafından tespit edilebilir (örneğin, hematoksilin / eozin ile boyama tarafından [H & E], hangi yaygın bir soluk mavimsi karınca olarak NETs tasvir). Sadece çok bol olduğunda, NET NET H & E boyama ile ayırt edilebilir, trombositgibi 5. NET'ler tek başına yaygın olduğundan, doku yapısı en iyi şekilde korunmalıdır, bu nedenle dondurucu objeleri indükleme eğilimli kriyo-preparatlar dokudaki NET'lerin analizi için yetersizdir. Bunun yerine, formaldehit fiksasyonu ve parafin gömme doku da NET yapısını korumak için gösterilmiştir2. Parafin gömülü doku bölümlerinin (İmmüno-)histolojik incelemesi patolojik analiz için standart bir yöntemdir. Parafin bloklarında doku oda sıcaklığında bile korunduğundan (RT), günlük tanı çalışmalarından elde edilen doku örnekleri, yıllar önce hazırlanmış örneklerle karşılaştırılabilir, son zamanlarda ortaya çıkan sorular ve tekniklerle. Yakın zamana kadar dokudaki NET'ler tespit edilmemiştir ve hastalıkların seyri sırasında NET oluşumu ve çıkarılmasının ayrıntılı analizi patogeneze yeni kavrayışlara yol açabilir. Parafin gömülü doku kullanımı arşiv malzemesi analizi sağlamak ve retrospektif çalışmalar yapmak için paha biçilmez bir avantaja sahiptir6. Inkar edilemez, bu faydaların bir bedeli vardır. Parafin içine gömmeden önce, doku formaldehit sabit, susuz ve 50 °C üzerinde ısıtılmış olmalıdır. Bu işlemler doku otofloresans yanı sıra epitop maskeleme neden.
Fiksasyon yapılarını sınırlamak için fiksasyon süresi minimumda tutulmalıdır, böylece doku örneklerinin boyutu ~3 mm kalınlığında 20 mm x 30 mm'lik bir alanı geçmemelidir. Bu boyuttaki numuneler formaldehit te RT'de gece kuluçkadan sonra tamamen sabitlenir, ideal olarak doğrudan dehidratasyon ve parafin katıştırma ile takip edilir. Alternatif olarak, sabit numuneler arabellekte 1 veya 2 gün saklanabilir. İmmünofloresans çalışmaları için fiksatif, uygun bir tamponda çözünmüş paraformaldehitten (örn. fosfat tamponlu salin [PBS] veya Tris-tamponlu salin [TBS]) taze olarak hazırlanmalıdır. Fiksatif hazırlık sırasında, formik asit oluşumunu önlemek için sıcaklık 60 °C'nin altında tutulmalıdır. Patoloji için standart bir fiksatif olan formalin, metanol, diğer aldehitler, ketonlar ve formik asit içerdiğinden kullanılmamalıdır. Bu kirler artmış epitop maskeleme ve önemli doku otofloresanyol.
Başarılı immünetiketleme için, epitop maskeleme antijen alma denilen bir süreç içinde geri alılmalıdır. Doku bölümleri metilen köprüleri kırmak için inanılan uygun bir tampon, ısıtılır, bu yüzden epitops antikorlar için erişilebilir hale7. NETs tespiti için, ısı kaynaklı epitop alma (HIER) proteolitik enzimlerin kullanımı gibi diğer yöntemlere tercih edilir. Rutin olarak, parafin bölümlerinin immünetiketleme tek bir antikor ile birlikte peroksidaz etiketli sekonder antikor ile yapılır, çökeltici bir substrat ile tespit edilir. İmmünofluoresans ile karşılaştırıldığında, enzim tabanlı algılama yöntemleri substrat çökelti difüzyonu nedeniyle daha düşük bir mekansal çözünürlüğe sahip, ve genellikle, birden fazla antijen eşzamanlı algılamasınırlıdır 6.
Şu anda sadece NET'lere bağlanan antikorlar bulunmadığından, bu protokol iki proteini, nükleer histon 2B'yi ve granüllerde lokalize olan nötrofil elastazı etiketlemek için kullanılır. Uyarılmamış nötrofillerde bu proteinler ayrılır, ancak nötrofillerde NEToz ve NET'lerde birlikte lokalize olurlar. İki antijenin eşzamanlı olarak saptanması, farklı konaklarda yetiştirilen iki ana antikor ve farklı florokromlarla etiketlenmiş iki türe özgü ikincil antikorile elde edilebilir. Bu rapor, daha önce yayınlanmışprotokol 8'in bir standardizasyonudur ve insan ve minnet kökenli parafin gömülü dokuda NET bileşenlerini güvenilir bir şekilde lekeleyen iki adet ticari olarak mevcut antikorkombinasyonunu kullanmaktadır.
Protocol
Doku protokolleri Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Almanya (G0121/16) tarafından onaylandı. Deneyler, Hayvanların Bakımı, Refahı ve Tedavisi konusunda 2010/63/EU avrupa direktifi uyarınca yapılmıştır.
1. Fiksasyon, dehidratasyon, parafin gömme, kesit, kesit montajı
- TBS'de paraformaldehit eriterek %2 formaldehit çözeltisi hazırlayın (pH 7.4). 60 °C'nin üzerinde ısıtmadan kaçının. Cool to RT. Formaldehit çözeltisi -20 °C'de saklanabilir.
- TBS ile cam petri kabına taze doku (burada: fare akciğer) yerleştirin. Neşter ile 20 mm x 30 mm x 3 mm'yi geçmeyen parçalar halinde parçalandırın. TBS'de numuneyi %2 formaldehit çözeltisine daldırın.
NOT: Fiksatif hacmi doku en az 20x olmalıdır. - 8−20 h. Numuneleri TBS'ye aktarmak için RT'de sabitle.
- Dehidrat etanol bir dizi kullanarak (70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 100%), her adım 1 saat süren.
- Temiz numuneler 2x 100% ksilen (dimethylbenzene), her adım 1 saat.
- 60 °C'de (erime sıcaklığı 54−56 °C) parafin 2x ile ıslatın, her adım 1 saat.
- Gömme kalıpları kullanarak montaj örnekleri, bir kapak olarak kaset alt kullanın.
- Parafin katılamasına izin verin ve katıştırma kalıplarını çıkarın.
- 3 μm doku bölümleri hazırlayın ve onları 37 °C su banyosu üzerinde yüzer.
- Yapışkan cam slaytlar üzerine su yüzeyinde float bölümleri (Malzeme Tablosu).
- 40 °C'de bir gecede cam kaydıraklarda inküksiyon bölümleri ile dokuyu cama bağlar.
2. Rehidrasyon, ısıya bağlı epitop alma, boyama, montaj, mikroskobik analiz
- Raflarda cam slaytlar üzerine bölümleri yerleştirin ve dehidratasyon ve temizleme için kullanılan ortam içine daldırma, ters sırada, 5 dakika için her adım: 2x 100% ksilen, etanol serisi (2x 100%, 96%, 90%, 80%, 70%).
- Bir su banyosunu sıcaklık kontrollü bir sıcak plakaile 70 °C'ye ısıtın. Isıya bağlı epitop alma (HIER)-tampon (pH 9; Malzeme Tablosu), bir su banyosu içine, bir sıcaklık tampon olarak% 10 gliserol içeren. HIER tamponu 70 °C'ye ulaştığında, rafı kaydıraklı tampon kavanozuna yerleştirin.
- 70 °C'de 120 dk kuluçka yada kayıyor.
- Kavanozu su banyosundan çıkarın ve rt. Deiyonize su ile 3x ve bir kez TBS (pH 7.4) ile durulayın bölümleri soğumaya bırakın.
- Rulo filtre kağıdı veya pamuklu bezli kesitler arasındaki slaytlardan sıvıyı dikkatlice çıkararak bölümleri sulu bırakarak çıkarın.
- Hidrofobik bariyer kalemi olan bölümlerin etrafında bariyer oluşturun.
- Önleyici tamponda inküksiyon bölümleri (%1 büyükbaş serum albumin [BSA], %2 normal eşek serumu, %5 soğuk su balık jelatini ve deterjanlar[TabloTBS] tbs) 30 dakika boyunca spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için.
- Tamponlamanın engellenmesinde 1 μg/mL konsantrasyonda primer antikorları seyreltin.
NOT: İnsan ve fare NET'leri için nötrofil elastazve histon 2B'ye karşı tavuk antikorlarına karşı tavşan antikor kombinasyonu kullanılabilir (Malzeme Tablosu). - Slaytları nemli bir odaya yerleştirin. Engelleme tamponu kaldırın ve kurutmayı önlemek için yeterli hacim kullanarak bölümlere yıkamadan seyreltilmiş birincil antikorları ekleyin. Parafin film ile mühür nemli oda ve RT gecede kuluçka.
- Her biri 5 dakika boyunca TBS ile 3x yıkama bölümleri.
- Tampon engelleme ikincil antikorların çalışma çözeltisi hazırlayın. Primer antikorların saptanması için eşeğe yükseltilmiş ve birden fazla türden serum proteinlerine karşı önceden emilen ikincil antikorlar kullanın(Tablo Malzemeler). İkincil antikorların çalışma çözeltisi ile doku bölümlerini kapatın. Slaytları nemli odaya aktarın, parafin filmli mühürleyin. RT'de 1 saat kuluçka.
NOT: Cy2'ye konjuge eşek anti tavşanı ve Cy3'e konjuge eşek anti tavuk DNA karşıleği ile kombine edilebilir. - Yıkama bölümleri 3x 5 dk her TBS ile, sonra deiyonize su ile 5 dk için bir kez.
- Montaj ortamı(Malzeme Tablosu)ile kapak bölümleri ve kapak cam kabarcık oluşumu kaçınarak uygulayın.
- Montaj ortamı katılaşmaya izin verin, sonra uygun bant geçiş filtreleri veya konfokal mikroskop ile geniş alan lı bir mikroskop kullanarak immünoresans analiz edin.
Representative Results
Bu protokol kullanılarak NET bileşenleri parafin le gömülü dokuda hem insan hem de minnet kökenli olarak başarıyla tespit edilebilir. Uyarılmamış nötrofillerde, H2B sadece granüllerde çekirdek ve nötrofil elastaz bulunur; sonuç olarak, floresan sinyalleri örtüşmez. Buna karşılık, NET oluşumu sırasında ve net oluşumundan sonra, NE, H2B ve DNA kısmen kolokalize. Yeşil, kırmızı ve mavi sinyaller olarak resmedilirse, kolokalizasyon alanları beyazımsı bindirme olarak gösterilmiştir (Şekil 1G, Şekil 2D, ve Şekil 3D). Bu bindirme, görüntü çözümleme yazılımı kullanılarak da ölçülebilir. Şekil 1G' , Şekil 2D've Şekil 3D' de NET alanlarını gösteren mor bir bindirme oluşturmak için yeşil, kırmızı ve mavi için pozitif olan örtüşen sinyallerden gelen piksellerkullanılmıştır. Şekil 1 ve Şekil 2'deki bazı hücreler çekirdekleri lobulated var ama NE için negatif. Bu hücrelerin eozinofil granülositler olduğuna inanılmaktadır.
Doku kesitleri 2-3 μm kalınlığa sahipse, 10x veya 20x hedefleri kullanılarak geniş alan mikroskobu ile analiz edilebilir. Ne (yeşil), H2B (kırmızı) ve Hoechst 33342 (mavi) için boyanmış insan apandisit dokusunun bir bölümünü gösteren Şekil 1'debir örnek sunulmuştur. A, C, E ve G panelleri NET içeren bölümün bir alanından, B, D, F ve H panelleri aynı bölümün farklı bir alanından dır, bunlar çok sayıda nötrofil(Şekil 1B, NE) içerir, ancak NE T'ler içermez. Büyük NET oluşumu olan alanlar, üç NET bileşeni nin de kolokalize olduğundan, genellikle üç kanalın bindirmesinde beyazımsı hücre dışı lifler olarak görünen yaylı hücre dışı yapılarda kolayca bulunabilir(Şekil 1G ), Şekil 1G'dekimor kaplama.
Her iki doku bölgesinin boyama desenleri açıkça farklıdır, ne granüllerde(Şekil 1B)ve çekirdeklerde DNA bulunur(Şekil 1F). İlginçtir, H2B için boyama nötrofil açısından zengin alanlarda oldukça zayıftır(Şekil 1D) NET içeren doku(Şekil 1C)ile karşılaştırıldığında. Bu antikor boyutu nedeniyle olabilir (IgY 150 kD ile karşılaştırıldığında 180 kD IgG), bozulmamış çekirdeklerde kompakt kromatin bağlanmasını önleyebilir, Kromatin NETs olduğu gibi decondensis ise H2B erişim kolaylaştırılır iken(Şekil 1C).
Daha yüksek çözünürlük için odak dışı bulanıklığı en aza indirmek için confocal mikroskoplar veya deconvolution içeren geniş alan mikroskopları kullanılmalıdır. Şekil 2 aynı insan apandisit örneğinden NET açısından zengin bir alanı tasvir eder. Bir konfokal yığının maksimum projeksiyonudur. NE (yeşil, Şekil 2A)granüllerde bulunur, ancak hücre dışı olarak bol miktarda bulunur ve h2B (kırmızı, Şekil 2B)ve DNA (mavi, Şekil 2C)ile kolokalleşir. Hücre dışı kolokalizasyon beyazımsı bir renk kombinasyonu ile sonuçlanır (Şekil 2D). Yeşil, kırmızı ve mavi için pozitif olan bu pikseller, Şekil 2B'dekiNET'leri sunan mor bir bindirme oluşturmak için kullanılmıştır.
Şekil 3 Mycobacterium tuberculosis (M. tb)ile enfekte bir fare akciğer merkezi bir bölümün bir detaydır. Antijen alma ve boyama koşulları Şekil 1 ve Şekil 2ileaynıdır. Yine, her üç NET bileşeninin birlikte lokalizasyonu, Şekil 3D'deki NET'leri gösteren mor bir tabaka oluşturmak için kullanılan nötrofiller arasındaki beyazımsı alanlar olarak açıkçagörülebilir.
Boyama özgüllüğü Kontrol antikorları ile ihmal edilebilir boyama gösteren Ek Şekil 1gösterilmiştir, ve Ek Şekil 1A, B tavşan non-immün serum tasvir (yeşil) ve tavuk anti-GFP IgY (kırmızı). Şekil 1 C,D tek başına ikincil antikorlar ile boyama gösterir, kombinasyon Şekil 1kullanılan aynıdır, Şekil 2, ve Şekil 3. Ek Şekil 1A,C insan apandisitinin Şekil 1 ve Şekil 2'yebenzer bir bölümünü gösterir. Ek Şekil 1B,D, Şekil 3'ebenzer fare akciğer dokusudur. DNA, Hoechst 33342 ile lekelenmiş. Ölçek çubuğu 25 μm'yi temsil eder.
Şekil 1: İnsan apandisit örneğinin parafin bölümünün geniş alan floresan mikroskobu.
A, C, E ve G panelleri NET'li bir doku alanını tasvir ederken, B, D, F ve H panelleri nötrofiller açısından zengin ancak NET oluşumu olmayan aynı bölümün farklı bir alanını göstermektedir. Boyama NE(A,B; yeşil), H2B(C,D; kırmızı) ve DNA(E,F; mavi) karşıdır. Şekil 1G,H her üç kanalın bindirmetemsil eder. Tüm renklerde 80 ile 256 arasında şiddeti olan pikseller, NE, H2B ve DNA için üst üste binen boyama alanlarını temsil eder ve NETosis geçiren NÖTR'lerden veya nötrofillerden türemiş olarak kabul edilir. Bu pikseller, geniş bir alan oluşturdukları G panelindemor olarak sahte renklidirler; ve panel H', sadece küçük noktalar bulunur. Görüntüler 20x hedefi kullanılarak geniş alan lı bir mikroskopla çekildi ve ölçek çubuğu 25 μm'yi temsil ediyor.
Şekil 2: İnsan apandisit örneğinde NET bileşenlerinin konfokal floresan mikroskobu.
Şekil 1'de kullanılan doku bölümü kullanılmıştır. (A) NE'ye karşı boyama,(B) H2B tasviri ve (C) Hoechst 33342 DNA boyama. (D) Üç kanalın da yer kaplaması. Her üç sinyalin birlikte lokalizasyonu d panelinde sahte renkli mordur. Bunun için volocity 6.3 kullanılarak her üç renkte de yoğunluk >80 olan pikseller tespit edildi. Mor alan NETosis geçiren NETs veya nötrofiller tasvir eder. Görüntüler konfokal mikroskopi ile Z-yığınları olarak alındı ve maksimum projeksiyon olarak sunuldu. Ölçek çubuğu 25 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: M. tbile enfekte bir fare akciğerNET bileşenlerinin Konfokal floresan mikroskobu .
Bu masif nötrofil infiltrasyonu ile tam bir akciğer infiltrasyonu ile bir bölümünün orta kısmından bir detaydır. (A) NE boyama, (B) H2B boyama ve (C) DNA boyama. (D) Üç kanalın da yer kaplaması. D panelindeki mor kaplama, üç renkte de >80 yoğunluk değerlerine sahip pikselleri gösterir ve nötrofillerin NETosis ve NET'leri gösterir. Görüntüler konfokal mikroskoplu z-yığınları olarak alındı ve maksimum projeksiyon olarak sunuldu. Ölçek çubuğu 25 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: İlişkisiz primer antikorlarla boyama kontrolü. Şekil 1 ve Şekil 2'dekullanılan insan (A,C)ve üriner doku(B,D)ve Şekil 3sırasıyla, ilgisiz primer antikorlar(A,B)veya primer antikorlar olmadan(C,D)ile boyandı. A ve B panellerinde kontrol primer antikorlar olarak, aşısız tavşandan serum ve GFP'ye karşı bir tavuk IgY uygulandı. İkincil antikorlar diğer tüm boyamalarda gösterildiği gibi aynıydı ve C ve D panellerinde de kullanıldı. Beklendiği gibi, her koşulda, Şekil 1, Şekil 2ve Şekil 3için kullanılan antikorların özgüllüğünü gösteren ihmal edilebilir arka plan boyama saptandı. Görüntüler konfokal mikroskop la çekilmiş, DNA Hoechst 33342 ile boyanmış ve ölçek çubuğu 25 μm'yi temsil eder.
Discussion
Patogenez 9 sırasında NET'lerinrolü ne kadar farkındalık ile, hasta veya deneysel hayvanlardan doku da tespit giderek önem kazanıyor. Parafin gömülü doku örnekleridiğer doku preparatlarına göre bir takım avantajlara sahiptir (örn. kriyopreserved örneklerin bölümleri). Parafin gömülü örneklerde doku koruma açıkça üstündür, ve bir kez gömülü, örnekler retrograd çalışmalar sağlayan, onlarca yıl korunur. Filigran yapıları olan NET'lerin tespiti için iyi bir numune koruma, morfolojik olarak benzeyen eserlere yol açabilen buz kristali oluşumu nedeniyle doku hasarına yatkın olan kriyokorunmuş malzeme kullanımını ekarte eden bir ön koşuldur. Ağları.
Optimal koruma için, deneysel hayvanlardan doku ölümden kısa bir süre sonra sabit olmalıdır, ideal perfüzyon ile, otolizin önlemek için. TBS veya PBS cevheri optimal gibi uygun bir tampon paraformaldehit fiksatif, taze hazırlanmış veya taze çözülmüş çözeltiler olarak. Bu kimyasal standart histoloji için kullanılan formalin preparatları aksine tanımlanır, ve daha az doku otofloresans indükler. Buna karşılık, insan dokusu genellikle eksizyondan sonra doğrudan sabit değildir ve fiksatif olarak, normalde polimerizasyonu önlemek için bir stabilizatör olarak metanol% 10 ila % 15 içeren formalin% 10 seyreltme kullanılır, yanı sıra formik asit, diğer aldehitler, ve ketonlar . Genellikle, doku katıştırma önce uzun süre bu fiksatif saklanır. Sonuç otolizin (eksizyon ve fiksasyon arasındaki zamana bağlı olarak) ve aşırı fiksasyon nedeniyle metilen köprülerin aşırı oluşumu olabilir. Formaldehit fiksasyonu proteinlerin üçüncül yapısında, moleküler ve moleküler metilen köprülerinin oluşumu ile değişikliklere neden olur10. Nükleik asitler, karbonhidratlar ve lipidler gibi proteinsiz hücre bileşenleri doğrudan sabit lenmez, üç boyutlu protein ağında hareketsiz kalır. Başarılı etiketleme için, metilen bağları antijen alma sürecinde epitoplar ortaya çıkarmak için kırık olması gerekir. Bu uygun bir ısı kaynaklı antijen alma tampon (HIER tampon)11mikroskop slaytlar üzerine monte doku bölümleri ısıtma ile gerçekleştirilir. Önceki çalışmamızda parafinize dokuda NET bileşenlerinin tespiti üzerinde pH ve HIER tamponların sıcaklığının etkisi analiz, ve bir bileşen için başarılı doku önlat genellikle ikinci bir bileşen için suboptimal olduğu bulundu8.
Bu arada, 9 pH'da HIER tamponunda 70 °C'ye kadar olan dokuyu ısıtmanın birçok NET bileşeni için iyi bir uzlaşma olduğu ve genellikle daha yüksek sıcaklıklarda tehlikeye giren iyi doku korumasını koruyacağı tespit edilmiştir. Başlangıç noktası olarak belirtilen alma süresinin kullanılması önerilmektedir, ancak özellikle bilinmeyen fiksasyon parametrelerinin arşiv örneklerinde boyama yoğunluğu tatmin edici olmayabilir. Bu durumda, alma işlemi sırasında sıcaklığın uzatılması veya daha yüksek olması boyama verimliliğini artırabilir. Bu aynı zamanda protokolümüzde kullanılan IgY antikor histon 2B boyama etkileyebilir. Şekil 1'degösterildiği gibi, nötrofillerde de yoğuşma kromatin, netosis geçiren nötrofillerde ve nets lekelerinde bu antikorla dinlenmiş nötrofillerde kromatine göre çok daha güçlü bulunabilir. Bu muhtemelen kompakt çekirdekleri için 180 kDa IgY molekülün sınırlı erişim nedeniyle ve artan epitop kurtarma sonra farklı olabilir. Bu yoğunlaştırılmış kromatin alanlarda bile bağlayıcı verimliliği yoğunlaştırmak olabilir, nötrofiller ve diğer hücrelerin normal çekirdeklerinde güçlü floresan neden olur. NETosis geçiren nötrofiller ile uyarılmayan nötrofiller arasındaki boyama verimi farkı Şekil 1'degösterilenden daha az belirgin olabilir. NET oluşum alanları hala NE, H2B ve DNA'nın birlikte lokalizasyonu ile belirlenecek.
Fiksasyon prosedürü aynı zamanda özellikle spektrumun mavimsi/yeşilimsi kısmında, dokunun önemli otofloresansneden olabilir. Mavi ekstrasyon ile kullanılan florokromemisyon maksimum maç yeterli dar bandpass floresan filtre setleri (geniş alan) veya dedektör ayarları (confocal) kullanarak bu otofloresans çoğu önlemek için önemlidir, örneğin, Cy2, Alexafluor 488. Aşırı otofloresan gibi durumlarda spektrumun mavimsi/yeşilimsi kısmından kaçınılmalıdır. Bunun yerine floresan sinyalleri spektrumun uzak kırmızı kısmında daha kolay tespit edilebilir (örneğin, Cy 5 veya Alexafluor 635 ile birleşen ikincil antikorlar), ancak bu filtresiz siyah/beyaz kameralar veya konfokal mikroskoplar gerektirir. İnsan gözü 600 nm'nin ötesinde oldukça duyarsız olduğundan, çok kırmızı floresan sinyalleri göz küleri kullanılarak tespit edilemez. Her halükarda, uygun maruz kalma sürelerini veya dedektör ayarlarını belirlemek için negatif kontroller (örn. primer antikorlar yerine immün sera/isotip kontrolleri veya primer antikorları atlayarak) kullanmak önemlidir.
1−2 μm doku kesitleri 10x veya 20x hedefleri kullanılarak geniş alan mikroskopları ile analiz edilebilir. Bu lensler büyük bir odak derinliği sağlamak, bu yüzden (neredeyse) tüm doku bölümü odak olacak. Bu, doku kesitlerinin yeterince büyük olması durumunda NET oluşum alanları için hızlı bir şekilde tarar (Şekil 1'dekigibi) kullanılabilir. Yeşil (NE), kırmızı (H2B) ve mavi (DNA) kanallarının birlikte lokalizasyonu NET oluşum alanlarını gösteren beyaz bir lekelenme yle sonuçlanır (Şekil 1G). Daha yüksek büyütmeler için dekonvolution içeren konfokal veya geniş alanlı mikroskoplar gereklidir. Şekil 2, Şekil 1için de kullanılan insan apandisit örneğinin ayrıntılarını göstermektedir. Şekil 2A'da,NE küçük nokta (granüller) lokalize olur, ancak büyük bir kısmı hücre dışıdır ve genellikle H2B (Şekil 2B) ve DNA ile örtüşen çizgiler oluşturur (Şekil 2C). Bu kolokalizasyon, NET'leri gösteren beyazımsı bir bindirmeyle sonuçlanır (Şekil 2D). Çok benzer bir desen M. tüberküloz ile enfekte bir farenin akciğer bölümünde bulunabilir(Şekil 3).
Burada sunulan örnekler, düşük büyütmede bile tespit edilebilen yüksek net formasyonderecesine sahip alanlar ile karakterize dir. Doku yoğunluğuna ve ilgili uyaranlara bağlı olarak NET oluşumu çok daha az belirgin olabilir, nötrofillerin küçük gruplarının NET oluşumuna kadar (miyokarditörneğin, bir önceki yayına bakın12). Bu protokolün dokudaki NET'ler üzerinde daha fazla araştırmanın teşvik edilmesine yardımcı olacağına ve hastalıkların oluşumunda veya önlenmesinde NET'lerin tanınmayan rollerinin çözülmesine yardımcı olacağına inanılmaktadır.
Disclosures
Bu çalışmanın finansman kaynağı Max Planck Derneği'dir. Arturo Zychlinsky'ye makaleyi eleştirel bir şekilde okuduğu için ve Philippe Saikali'ye fare dokusu için teşekkür ederiz.
Acknowledgments
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
| cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
| donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
| embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
| embedding molds | Sakura | 4162 | |
| embedding station | Microm | AP280 | |
| ethanol | Roth | 9065.4 | |
| filter paper, rolled | OCB | ||
| forceps | Dumont | 7a | |
| glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
| glycerol | Roth | 3783.1 | |
| HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
| moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
| Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
| normal donkey serum | Merck | S30 | |
| PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
| paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
| paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
| petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
| rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
| racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
| scalpel | Braun | Fig.22 | |
| Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
| tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
| Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
| Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
| Tween 20 | Fluka | 93773 | |
| water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
| widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
| xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLOS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BioMed Central Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation. 84 (3), 300-306 (2004).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A.
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Cattoretti, G., et al. Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Journal of Pathology. 171 (2), 83-98 (1993).
- Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
- Weckbach, L. T., et al. Midkine drives cardiac inflammation by promoting neutrophil trafficking and NETosis in myocarditis. Journal of Experimental Medicine. 216 (2), 350-368 (2019).
