嗜中性粒细胞外陷阱(NETs)是由刺激的中性粒细胞产生的三维结构。近年来,人们清楚地认识到,NET与各种各样的疾病有关。检测组织中的 NET 可能具有诊断相关性,因此需要标准化的 NET 组件标签协议。
中微粒细胞,也称为多态核白细胞(PMN),由于其叶状核,是最丰富的白细胞类型。它们在骨髓中成熟,并释放到外周血中,在那里循环约6~8小时;然而,在组织中,它们可以存活数天。通过内皮的分体,它们离开血流,进入组织,并在化学梯度后迁移到感染部位。嗜中性粒细胞可以通过噬菌体、脱粒和产生嗜中性粒细胞外陷阱(NETs)来对抗入侵的微生物。该协议将有助于检测石蜡嵌入组织中的NET。NETs 是称为 NETosis 的一个过程的结果,它导致核、粒状和细胞质成分从活的(重要的 NETosis)或死亡(自杀性 NETosis)嗜血杆菌中释放。在体外,NET形成云状结构,其空间比它们从细胞中产生的细胞大好几倍。NET的骨干是染色质,从颗粒和细胞质产生的蛋白质和肽的选择被束缚。因此,保持有毒化合物的高局部浓度,以便 NET 可以捕获和灭活各种病原体,包括细菌、真菌、病毒和寄生虫,同时扩散高度活跃的 NET 成分,从而导致邻近组织是有限的。然而,近年来,人们已经很明显地发现,NETs,如果大量产生或清除不足,确实有从自身免疫性疾病到癌症的病理潜力。因此,在组织样本中检测NET可能具有诊断意义,在病变组织中检测NET会影响患者的治疗。由于石蜡嵌入组织样本是用于病理分析的标准标本,因此寻求利用市售的抗体建立石蜡嵌入组织中NET成分的荧光染色方案。
嗜中性粒细胞外陷阱(NETs)具有复杂的三维结构。高分辨率扫描电子显微分析表明,它们由直径为 15–20 nm(染色质)的光滑纤维组成,球状域为 >25 nm,大概由大约 30 粒粒状和细胞质的分类组成蛋白质和肽1,2。当从分离的嗜中性粒细胞体外产生时,通过免疫荧光(例如,组蛋白和嗜中性粒细胞乳化酶[NE])染色来识别NET。在未刺激的多态核白细胞(PMN)中,组蛋白完全位于细胞核中,而NE则包含在颗粒中。在NETosis期间,NE进入细胞核,在那里它处理组蛋白3,4。NET的特点是成分的共定位,这些成分在未刺激的中性粒细胞中明显分离。由于目前不存在专门检测 NET 特异性表位的抗体(即,不要与幼性嗜中性粒细胞发生反应),因此检测 NET 中嗜中性粒细胞蛋白的共定位是识别 NET 的唯一方法。
在组织中,NET 很难被传统的组织学污渍检测出来(例如,通过染色血氧林/eosin [H&E],后者将 NET 描述为漫射淡蓝色色调)。只有当高度丰富时,NET 可以清楚地区分与 H&E 染色, 如在血栓5。由于NET本身是扩散的,组织结构必须得到最佳保存,因此容易诱发冷冻伪影的冷冻制剂对于组织内NET的分析则不理想。相反,甲醛固定和石蜡嵌入已被证明在组织井2中保持NET结构。(免疫-)石蜡嵌入组织各部分的组织学检查是病理分析的标准方法。由于石蜡块中的组织即使在室温 (RT) 下也能保存,因此日常诊断工作中的组织标本可以与几年前准备的标本进行比较,以及最近出现的问题和技术。组织中的NET直到最近才被发现,对疾病过程中的NET形成和去除的详细分析可能导致对发病机制的新见解。使用石蜡嵌入组织具有宝贵的优势,可以分析档案材料,并进行回顾性研究6。不可否认,这些好处是有代价的。在嵌入石蜡之前,组织必须固定甲醛,脱水并加热到50°C以上。这些程序诱导组织自荧光以及表位掩蔽。
为了限制固定伪影,固定时间应保持在最小,因此组织样本的大小不应超过 20 mm x 30 mm 的面积,厚度不应为 ±3 mm。这种大小的样品在甲醛的RT中过夜孵育后完全固定,理想情况下是直接脱水和石蜡嵌入。或者,固定样品可以在缓冲中储存1天或2天。对于免疫荧光研究,修复剂应从溶解在适当缓冲液中的甲醛中新鲜制备(例如,磷酸盐缓冲盐水 [PBS] 或 Tris 缓冲盐水 [TBS])。在固定制备过程中,温度必须保持在60°C以下,以防止甲酸的形成。FORMALin是病理学的标准固定剂,不应使用,因为它含有甲醇、其他醛、酮和甲酸。这些杂质导致表位掩蔽和显著的组织自荧光增加。
为了成功进行免疫标记,必须在称为抗原检索的过程中还原表位掩蔽。组织部分在适当的缓冲液中加热,据信会破坏亚甲桥,因此表皮变得可进入抗体7。对于 NET 的检测,热诱导表位检索 (HIER) 优先于其他方法,如使用蛋白解酶。通常,石蜡部分的免疫标记使用单个抗体进行,然后是带有过氧化物酶标记的二级抗体,该抗体用沉淀基质检测。与免疫荧光相比,基于酶的检测方法由于基质沉淀物扩散而具有较低的空间分辨率,而且通常同时检测一种以上的抗原是有限的。
由于目前不存在专门与NET结合的抗体,该协议用于标记两种蛋白质,即组蛋白2B(即核蛋白)和中性粒细胞器酶(在颗粒中局部化)。在未刺激的中性粒细胞中,这些蛋白质是分开的,但它们在进行NETosis的嗜中性粒细胞和NET中共同位置化。通过两种在不同宿主中升高的初级抗体和两种带有不同荧铬标签的物种特异性二级抗体,可以同时检测两种抗原。本报告是我们先前发布的协议8的标准化,它使用了两种市售的抗体的组合,这些抗体能够可靠地在石蜡嵌入的组织中染色人体内的NET成分,包括新鲜和存档的人类和鼠原成分。
随着人们对NET在发病机制9中的作用的认识日益提高,从患者或实验动物的组织中检测它们变得越来越重要。与其他组织制剂(例如冷冻保存的标本部分)相比,石蜡嵌入组织样本具有许多优点。石蜡嵌入样品中的组织保存明显优越,一旦嵌入,这些样品可保存数十年,从而进行逆行研究。对于NET的检测,这是丝状结构,良好的样品保存是排除使用冷冻材料的先决条件,因为冰晶形成容易造成组织损伤,从而在形态上产生类似形态的文物网。
为了获得最佳保存,实验动物的组织应在死亡后不久固定,最好是灌注,以避免自流。作为固定、新鲜制备或新鲜解冻的甲醛溶液,在适当的缓冲液(如 TBS 或 PBS 矿石)中最佳。这与用于标准组织学的正霉制剂相比,化学定义,并诱导较少的组织自荧光。相反,人体组织在切除后通常不会直接固定,作为固定,通常使用10%稀释的甲酸,其中含有10%至15%的甲醇作为稳定剂,以防止聚合,以及甲酸,其他醛和酮.通常,组织在嵌入前储存在这种固定剂中很长时间。其结果可以是自动解压(取决于切除和固定之间的时间),以及由于过度固定而过度形成亚甲桥。甲醛固定通过形成分子内和分子间亚甲桥10,诱导蛋白质的三级结构变化。核酸、碳水化合物和脂质等非蛋白质细胞成分不是直接固定的,而是固定在三维蛋白质网络中。为了成功贴标,在抗原检索过程中必须打破亚甲键以暴露表位。这是通过在适当的热诱导抗原检索缓冲液(HIER缓冲液)11中加热安装在显微镜上的组织部分来实现的。我们先前的研究分析了HIER缓冲液的pH值和温度对石蜡化组织NET成分检测的影响,发现对一个组分的成功组织预处理对于第二个组分8来说往往不理想。
同时,已经发现,在HIER缓冲液中加热到70°C的pH值为9对许多NET成分来说是一个很好的折衷,并且会保持良好的组织保存,这在较高温度下经常受到损害。建议以指定的检索时间为起点,特别是对于未知固定参数的档案标本,染色强度不能令人满意。在这种情况下,在检索过程中延长或升高温度可以提高染色效率。这也会影响我们协议中使用的IgY抗体的组蛋白2B染色。如图1所示,脱凝血染色质在进行NETosis的嗜中性粒细胞中以及NET的染色剂中比休息的嗜中性粒细胞中的染色质要强得多。这可能是由于180 kDa IgY分子对紧凑核的受限访问,在表位恢复增加后可能会有所不同。这也可能增强结合效率,即使在凝结染色质区域,这将导致神经粒细胞和其他细胞的正常核的荧光更强。患有NETosis的嗜中性粒细胞和非刺激性中性粒细胞之间的染色效率差异可能不如图1所示明显。NET形成区域仍将通过NE、H2B和DNA的共同定位来识别。
固定程序还可以诱导组织显著自荧光,主要在光谱的蓝/绿部分。使用足够的窄带通荧光滤波器集(广域)或探测器设置(共聚焦),与蓝色激发中使用的荧光铬的发射最大值相匹配,例如 Cy2、Alexafluor,避免大多数自荧光非常重要。488. 在自荧光的极端情况下,应避免光谱中的蓝色/绿色部分。相反,荧光信号可以在光谱的远红色部分(例如,与 Cy 5 或 Alexafluor 635 耦合的二级抗体)中更容易检测,但这需要无滤的黑色/白色摄像机或共聚焦显微镜。由于人眼在 600 nm 以外相当不敏感,因此很难用眼睛检测出远红色荧光信号。在任何情况下,使用阴性对照(例如,非免疫血清/等型对照,而不是初级抗体或省略原抗体)来确定适当的暴露时间或检测器设置)都很重要。
1⁄2 μm的组织部分可以使用10倍或20倍物镜使用广域显微镜进行分析。这些透镜提供较大的焦距,因此(几乎)整个组织部分将处于焦点位置。这可用于快速扫描组织部分的NET形成区域,如果它们足够大(如图1)。绿色 (NE)、红色 (H2B) 和蓝色 (DNA) 通道的共定位导致白色染色,指示 NET 形成区域(图 1G)。对于更高的放大倍率,需要具有反卷积的共聚焦或宽场显微镜。图2显示了也用于图1的人类附录炎标本的详细信息。在图2A中,NE本地化为小点(颗粒),但很大一部分是细胞外,经常形成与H2B(图2B)和DNA重叠的条纹(图2C)。这种共同定位导致一个白色覆盖,指示NET(图2D)。在感染M.结核病的小鼠的肺部部分可以发现一种非常相似的模式(图3)。
这里介绍的样本的特点是具有高NET形成的区域,即使在低放大倍率下也能识别。根据组织密度和相应的刺激,NET的形成可能不那么明显,一些净粒细胞小组的形成(例如,在心肌炎中,见上一份出版物12)。据认为,该协议将有助于促进对组织内内免疫特的更多研究,并希望有助于解开NET在疾病形成或预防中未被承认的作用。
The authors have nothing to disclose.
作者没有什么可透露的。
bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
embedding molds | Sakura | 4162 | |
embedding station | Microm | AP280 | |
ethanol | Roth | 9065.4 | |
filter paper, rolled | OCB | ||
forceps | Dumont | 7a | |
glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
glycerol | Roth | 3783.1 | |
HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
normal donkey serum | Merck | S30 | |
PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
scalpel | Braun | Fig.22 | |
Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
Tween 20 | Fluka | 93773 | |
water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |