Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind dreidimensionale Strukturen, die durch stimulierte neutrophile Granulozyten erzeugt werden. In den letzten Jahren hat sich herabimsiert, dass NETs an einer Vielzahl von Krankheiten beteiligt sind. Der Nachweis von NETs im Gewebe kann diagnostische Relevanz haben, daher sind standardisierte Protokolle für die Kennzeichnung von NET-Komponenten erforderlich.
Neutrophile Granulozyten, auch polymorphonukleare Leukozyten (PMN) genannt, sind aufgrund ihres lobulierten Kerns die am häufigsten vorkommende Art von Leukozyten. Sie reifen im Knochenmark und werden in das periphere Blut freigesetzt, wo sie etwa 6 x 8 h zirkulieren; im Gewebe können sie jedoch tagelang überleben. Durch Diapedese durch das Endothel verlassen sie den Blutkreislauf, gelangen in Gewebe und wandern nach chemotaktischen Gradienten zur Infektion. Neutrophile können eindringende Mikroorganismen durch Phagozytose, Degranulation und Die Generierung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) bekämpfen. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, NETs in paraffinintegriertem Gewebe zu erkennen. NETs sind das Ergebnis eines Prozesses namens NETosis, der zur Freisetzung von kerntechnischen, körnigen und zytoplasmatischen Komponenten entweder aus lebenden (lebenswichtigen NETosis) oder sterbenden (suizidgefährdeten NETosis) Neutrophilen führt. In vitro bilden NETs wolkenähnliche Strukturen, die einen Raum einnehmen, der um ein Vielfaches größer ist als der der Zellen, von denen sie abgestiegen sind. Das Rückgrat von NETs ist Chromatin, an das eine Auswahl von Proteinen und Peptiden aus Granulat und Zytoplasma gebunden ist. Dadurch wird eine hohe lokale Konzentration toxischer Verbindungen aufrechterhalten, so dass NETs eine Vielzahl von Krankheitserregern, einschließlich Bakterien, Pilzen, Viren und Parasiten, erfassen und inaktivieren können, während die Diffusion der hochaktiven NET-Komponenten zu Schäden in benachbartes Gewebe begrenzt ist. Dennoch hat sich in den letzten Jahren gezeigt, dass NETs, wenn sie in Hülle und Fülle erzeugt oder unzureichend gerodet werden, pathologisches Potenzial haben, das von Autoimmunerkrankungen bis hin zu Krebs reicht. So kann der Nachweis von NETs in Gewebeproben eine diagnostische Bedeutung haben, und der Nachweis von NETs in krankem Gewebe kann die Behandlung von Patienten beeinflussen. Da paraffineingebettete Gewebeproben die Standardprobe für die pathologische Analyse sind, wurde versucht, ein Protokoll für die fluoreszierende Färbung von NET-Komponenten in paraffin-eingebettetem Gewebe unter Verwendung kommerziell erhältlicher Antikörper zu erstellen.
Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) haben eine komplexe dreidimensionale Struktur. Hochauflösende Rasterelektronen-Mikroskopische Analysen ergaben, dass sie aus glatten Fasern mit einem Durchmesser von 15 bis 20 nm (Chromatin) bestehen, die mit Kugeldomänen von >25 nm besetzt sind, die vermutlich aus einem Sortiment von etwa 30 körnigen und zytoplasmischen Proteine und Peptide1,2. Wenn in vitro aus isolierten Neutrophilen erzeugt, können NETs durch Färbung von zwei oder mehr ihrer Komponenten durch Immunfluoreszenz (z. B. Histonen und neutrophile Elastase [NE]) identifiziert werden. In nicht stimulierten polymorphonuklearen Leukozyten (PMN) befinden sich Histonen ausschließlich im Kern, während NE in Granulaten enthalten ist. Während der NETosis tritt NE in den Kern ein, wo es Histonen3,4verarbeitet. NETs zeichnen sich durch kolokalisierung von Komponenten aus, die in unstimulierten Neutrophilen klar getrennt sind. Da derzeit keine Antikörper existieren, die ausschließlich NET-spezifische Epitope detektieren (d. h. nicht mit naiven Neutrophilen reagieren), ist die Detektion der Kolokalisierung neutrophiler Proteine in NETs die einzige Möglichkeit, NETs zu identifizieren.
Im Gewebe können NETs durch herkömmliche histologische Flecken kaum nachgewiesen werden (z.B. durch Färbung mit Hämatoxylin/Eosin [H&E], das NETs als diffuseblasse bläuliche Färbung darstellt). Nur wenn es reichlich vorhanden ist, können NETs deutlich mit H&E-Färbung unterschieden werden, wie z. B. in Thrombi5. Da NETs per se diffus sind, muss die Gewebestruktur optimal erhalten werden, so dass Kryopräparate, die anfällig für Gefrierartefakte sind, für die Analyse von NETs im Gewebe suboptimal sind. Stattdessen hat sich gezeigt, dass formaldehydfixierung und Paraffineinbettung die NET-Struktur im Gewebe gut2erhalten. (Immun-)histologische Untersuchung von Abschnitten des paraffineingebetteten Gewebes ist die Standardmethode für die pathologische Analyse. Da Gewebe in Paraffinblöcken auch bei Raumtemperatur (RT) konserviert wird, können Gewebeproben aus der täglichen diagnostischen Arbeit mit Proben verglichen werden, die vor Jahren vorbereitet wurden, mit Fragen und Techniken, die vor kurzem entstanden sind. NETs im Gewebe wurden bis vor kurzem nicht nachgewiesen, und eine detaillierte Analyse der NETZbildung und -entfernung im Verlauf von Krankheiten kann zu neuen Erkenntnissen über die Pathogenese führen. Die Verwendung von Paraffin-eingebettetem Gewebe hat den unschätzbaren Vorteil, die Analyse von Archivmaterial zu ermöglichen und retrospektive Studien durchzuführen6. Zweifellos haben diese Vorteile ihren Preis. Vor der Einbettung in Paraffin muss Gewebe formaldehydfixiert, dehydriert und über 50 °C erhitzt werden. Diese Verfahren induzieren Gewebe-Autofluoreszenz sowie Epitop-Maskierung.
Um Fixierungsartefakte zu begrenzen, sollte die Fixationszeit auf ein Minimum beschränkt werden, so dass die Größe von Gewebeproben eine Fläche von 20 mm x 30 mm mit einer Dicke von 3 mm nicht überschreiten sollte. Proben dieser Größe werden nach der nächtlichen Inkubation bei RT in Formaldehyd vollständig fixiert, idealerweise gefolgt von direkter Dehydrierung und Paraffineinbettung. Alternativ können feste Proben für 1 oder 2 Tage im Puffer gelagert werden. Für Immunfluoreszenzstudien sollte das Fixierungsmittel frisch aus Paraformaldehyd gelöst in einem geeigneten Puffer (z. B. phosphatgepufferter Salin [PBS] oder Tris-gepufferter Salin [TBS]) hergestellt werden. Während der fixativen Zubereitung muss die Temperatur unter 60 °C gehalten werden, um die Bildung von Ameisensäure zu verhindern. Formalin, ein Standardfixativ für Pathologie, sollte nicht verwendet werden, da es Methanol, andere Aldehyde, Ketone und Ameisensäure enthält. Diese Verunreinigungen führen zu erhöhter Epitopmaskierung und signifikanter Gewebe-Autofluoreszenz.
Für eine erfolgreiche Immunetikettierung muss die Epitopmaskierung in einem Prozess, der als Antigenabruf bezeichnet wird, rückgängig gemacht werden. Gewebeabschnitte werden in einem geeigneten Puffer erhitzt, der Methylenbrücken brechen soll, so dass Epitope für die Antikörper zugänglich werden7. Für den Nachweis von NETs wird der wärmeinduzierte Epitopabruf (HIER) anderen Methoden wie der Verwendung proteolytischer Enzyme vorgezogen. Routinemäßig wird die Immunkennzeichnung von Paraffinabschnitten mit einem einzigen Antikörper durchgeführt, gefolgt von einem peroxidase-markierten Sekundärantikörper, der mit einem ausfällenden Substrat nachgewiesen wird. Im Vergleich zur Immunfluoreszenz weisen enzymbasierte Detektionsmethoden aufgrund der Diffusion des Substrats eine geringere räumliche Auflösung auf, und im Allgemeinen ist der gleichzeitige Nachweis von mehr als einem Antigen begrenzt6.
Da derzeit keine Antikörper existieren, die ausschließlich an NETs binden, wird dieses Protokoll verwendet, um zwei Proteine zu kennzeichnen, Histon 2B, das kernnukleare, und neutrophile Elastase, die in Granulat lokalisiert ist. Bei nicht stimulierten Neutrophilen werden diese Proteine getrennt, aber sie werden in Neutrophilen, die sich einer NETosis unterziehen, und in NETs kolokalisiert. Der gleichzeitige Nachweis von zwei Antigenen kann mit zwei primären Antikörpern erreicht werden, die in verschiedenen Wirten und zwei artspezifischen sekundären Antikörpern mit unterschiedlichen Fluorchromen aufgezogen werden. Dieser Bericht ist eine Standardisierung unseres zuvor veröffentlichten Protokolls8 und verwendet eine Kombination von zwei kommerziell erhältlichen Antikörpern, die NET-Komponenten in paraffinintegriertem Gewebe, sowohl frisch als auch archivalisch, menschlichen und murinen Ursprungs zuverlässig färben.
Mit dem wachsenden Bewusstsein für die Rolle von NETs bei der Pathogenese9gewinnt deren Nachweis im Gewebe von Patienten oder Versuchstieren zunehmend an Bedeutung. Paraffin-eingebettete Gewebeproben haben eine Reihe von Vorteilen im Vergleich zu anderen Gewebepräparaten (z. B. Abschnitte von kryokonservierten Proben). Die Gewebekonservierung in paraffin-eingebetteten Proben ist deutlich überlegen, und sobald sie eingebettet sind, werden die Proben jahrzehntelang konserviert, was retrograde Studien ermöglicht. Für den Nachweis von NETs, die filigrane Strukturen sind, ist eine gute Probenkonservierung eine Voraussetzung, die die Verwendung von kryokonserviertem Material ausschließt, das anfällig für Gewebeschäden aufgrund der Eiskristallbildung ist, die zu Artefakten führen kann, die morphologisch ähneln Netze.
Zur optimalen Konservierung sollte Gewebe von Versuchstieren kurz nach dem Tod, idealerweise durch Perfusion, fixiert werden, um eine Autolyse zu vermeiden. Als fixative, frisch zubereitete oder frisch aufgetaute Paraformaldehydlösungen in einem geeigneten Puffer wie TBS oder PBS Erz optimal. Dies ist chemisch definiert im Gegensatz zu Formalin präparaten Präparaten für Standard-Histologie verwendet, und induziert weniger Gewebe-Autofluoreszenz. Im Gegensatz dazu wird menschliches Gewebe oft nicht direkt nach der Exzision fixiert, und als fixative, in der Regel wird eine 10% Verdünnung von Formalin verwendet, die 10% bis 15% Methanol als Stabilisator enthält, um Polymerisation zu verhindern, sowie Ameisensäure, andere Aldehyde und Ketone . Oft wird das Gewebe in diesem Fixativ für längere Zeit vor der Einbettung gespeichert. Das Ergebnis kann die Autolyse (abhängig von der Zeit zwischen Exzision und Fixierung) und übermäßige Bildung von Methylenbrücken aufgrund der Überfixierung sein. Formaldehydfixierung induziert Veränderungen in der tertiären Struktur von Proteinen durch Bildung von intra- und intermolekularen Methylenbrücken10. Nicht-proteinhaltige Zellbestandteile wie Nukleinsäuren, Kohlenhydrate und Lipide werden nicht direkt fixiert, sondern im dreidimensionalen Proteinverbund immobilisiert. Für eine erfolgreiche Kennzeichnung müssen Methylenbindungen gebrochen werden, um die Epitope bei der Antigenrückgewinnung freizulegen. Dies wird durch Erhitzen von Gewebeabschnitten erreicht, die in einem geeigneten wärmeinduzierten Antigen-Abrufpuffer (HIER-Puffer) auf Mikroskopschlitten montiert sind11. Unsere vorherige Studie analysierte den Einfluss von pH und Temperatur von HIER-Puffern auf den Nachweis von NET-Komponenten in paraffiniertem Gewebe, und es wurde festgestellt, dass eine erfolgreiche Gewebevorbehandlung für eine Komponente oft für eine zweite Komponente suboptimal ist8.
Inzwischen hat sich herausgestellt, dass das Erhitzen des Gewebes auf 70 °C im HIER-Puffer bei einem pH-Wert von 9 ein guter Kompromiss für viele NET-Komponenten ist und eine gute Gewebekonservierung behält, die oft bei höheren Temperaturen beeinträchtigt wird. Es wird vorgeschlagen, die als Ausgangspunkt angegebene Abrufzeit zu verwenden, aber insbesondere bei Archivproben unbekannter Fixierungsparameter kann die Färbeintensität unbefriedigend sein. In diesem Fall kann die Verlängerung oder höhere Temperatur während des Abrufvorgangs die Färbeeffizienz verbessern. Dies kann auch die Histon 2B Färbung des in unserem Protokoll verwendeten IgY-Antikörpers beeinflussen. Wie in Abbildung 1dargestellt, findet sich dekondensiertes Chromatin bei Neutrophilen, die sich einer NETosis unterziehen, sowie bei NETs Flecken, die mit diesem Antikörper viel stärker sind als bei Chromatin in ruhenden Neutrophilen. Dies ist wahrscheinlich auf den eingeschränkten Zugang des 180 kDa IgY Moleküls zu kompakten Kernen zurückzuführen und kann sich nach erhöhter Epitoprückgewinnung unterscheiden. Dies kann die Bindungseffizienz auch in Bereichen von kondensiertem Chromatin verstärken, was zu einer stärkeren Fluoreszenz in normalen Kernen von Neutrophilen und anderen Zellen führen wird. Der Unterschied in der Färbeeffizienz zwischen Neutrophilen, die sich einer NETosis unterziehen, und nicht stimulierten Neutrophilen könnte weniger ausgeprägt sein als in Abbildung 1dargestellt. Bereiche der NET-Bildung würden noch durch die Kolokalisierung von NE, H2B und DNA identifiziert.
Das Fixierungsverfahren kann auch eine signifikante Autofluoreszenz des Gewebes induzieren, vor allem im bläulich/grünen Teil des Spektrums. Es ist wichtig, den größten Teil dieser Autofluoreszenz zu vermeiden, indem sie geeignete schmale Bandpass-Fluoreszenzfiltersätze (Weitfeld) oder Detektoreinstellungen (konfokad) verwenden, die dem Emissionsmaximum des fluorchromen Fluorchroms entsprechen, das bei blauer Anregung verwendet wird, z. B. Cy2, Alexafluor 488. In extremen Fällen der Autofluoreszenz sollte der bläulich-grüne Teil des Spektrums vermieden werden. Stattdessen können Fluoreszenzsignale im weit roten Teil des Spektrums leichter erkannt werden (z. B. sekundäre Antikörper, die an Cy 5 oder Alexafluor 635 gekoppelt sind), aber dies erfordert filterlose Schwarz-Weiß-Kameras oder konfokale Mikroskope. Da das menschliche Auge jenseits von 600 nm eher unempfindlich ist, können weit rote Fluoreszenzsignale mit dem Okular kaum erkannt werden. In jedem Fall ist es wichtig, negative Kontrollen (z. B. nicht-immune Sera/Isotyp-Kontrollen anstelle von primären Antikörpern oder auslassenden Primärantikörpern) zu verwenden, um geeignete Expositionszeiten oder Detektoreinstellungen zu bestimmen.
Gewebeabschnitte von 1 x 2 m können mit Weitfeldmikroskopen mit 10- oder 20-fachen Objektiven analysiert werden. Diese Linsen bieten eine große Brenntiefe, so dass (fast) der gesamte Gewebebereich im Fokus stehen wird. Dies kann verwendet werden, um Gewebeabschnitte schnell nach Bereichen der NET-Bildung zu scannen, wenn sie ausreichend groß sind (wie in Abbildung 1). Die Kolokalisierung der grünen (NE), roten (H2B) und blauen (DNA) Kanäle führt zu einer weißen Färbung, die Bereiche der NET-Bildung anzeigt (Abbildung 1G). Für höhere Vergrößerungen sind konfokale oder weiträumige Mikroskope mit Dekonvolution notwendig. Abbildung 2 zeigt Details der menschlichen Appendicitis-Probe, die auch für Abbildung 1verwendet wird. In Abbildung 2Alokalisiert NE kleine Punkte (Granulat), aber ein großer Teil ist extrazellulär, oft bilden Streifen, die sich mit H2B (Abbildung 2B) und DNA überlappen (Abbildung 2C). Diese Kolokalisierung führt zu einem weißlichen Overlay, das NETs angibt (Abbildung 2D). Ein sehr ähnliches Muster findet sich im Lungenbereich einer mit M. tuberculosis infizierten Maus (Abbildung 3).
Die hier vorgestellten Proben zeichnen sich durch Bereiche mit einem hohen NET-Bildungsgrad aus, die auch bei geringer Vergrößerung identifiziert werden können. Je nach Gewebedichte und jeweiligen Stimulus kann die NET-Bildung viel weniger ausgeprägt sein, bis hin zur NET-Bildung kleiner Gruppen von Neutrophilen (z. B. bei Myokarditis siehe vorherige Publikation12). Es wird angenommen, dass dieses Protokoll dazu beitragen wird, mehr Forschung über NE im Gewebe zu fördern und hoffentlich bei der Entschlüsselung unerkannter Rollen von NETs bei der Bildung oder Prävention von Krankheiten zu helfen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren haben nichts zu verraten.
bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
embedding molds | Sakura | 4162 | |
embedding station | Microm | AP280 | |
ethanol | Roth | 9065.4 | |
filter paper, rolled | OCB | ||
forceps | Dumont | 7a | |
glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
glycerol | Roth | 3783.1 | |
HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
normal donkey serum | Merck | S30 | |
PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
scalpel | Braun | Fig.22 | |
Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
Tween 20 | Fluka | 93773 | |
water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |