好中球細胞外トラップ(NET)は、刺激された好中球顆粒球によって生成される三次元構造である。近年、NETが多種多様な疾患に関与していることが明らかになりました。組織内のNETの検出は診断上の関連性を持つ可能性があるため、NETコンポーネントを標識するための標準化されたプロトコルが必要です。
好中球顆粒球は、その基調核による多形核白血病(PMN)とも呼ばれ、最も豊富なタイプの白血病細胞である。彼らは骨髄で成熟し、末梢血に放出され、そこで約6−8時間循環する。しかし、組織では、彼らは何日も生き残ることができます。内皮を通してダイアペデス症を起用することにより、血流を離れ、組織に入り、化学的勾配に続く感染部位に向かって移動する。好中球は、性細胞減少、脱顆粒、好中球細胞外トラップ(NET)の生成によって侵入微生物と戦うことができます。このプロトコルは、パラフィン埋め込み組織のNETを検出するのに役立ちます。NETsはNETosisと呼ばれるプロセスの結果であり、生きている(重要なNETosis)または死ぬ(自殺NETosis)好中球から核、粒状、細胞質の成分の放出につながる。インビトロでは、NETsは雲状の構造を形成し、それらが降りてくる細胞の数倍の大きさの空間を占めています。NETsのバックボーンはクロマチンで、顆粒と細胞質に由来するタンパク質とペプチドの選択が結合している。それによって、NETが細菌、真菌、ウイルス、寄生虫を含む様々な病原体を捕捉し、不活性化できるように、高い局所濃度の有毒化合物が維持され、損傷につながる活性の高いNET成分の拡散隣接する組織は限られています。しかし、近年、NETが豊富に発生したり、不十分にクリアされたりすると、自己免疫疾患からがんに至るまで病理学的な可能性を持つことが明らかになっています。したがって、組織サンプル中のNETの検出は診断上の意義を有し、疾患組織におけるNETの検出は患者の治療に影響を及ぼす可能性がある。パラフィン埋め込み組織サンプルは病理学的分析に用いられる標準的な標本であるため、市販の抗体を用いてパラフィン埋め込み組織におけるNET成分の蛍光染色のためのプロトコルを確立することが求められた。
好中球細胞外トラップ(NET)は複雑な三次元構造を持つ。高解像度の走査電子顕微鏡解析では、直径15~20nm(クロマチン)の滑らかな繊維で構成され、約30粒状および細胞質の品揃えで構成されていると考えられており、>25 nmの球状ドメインがちりばされている。タンパク質およびペプチド1,2.単離された好中球からインビトロで生成された場合、NETsは免疫蛍光(例えば、ヒストンおよび好中球エラスターゼ[NE])によって2つ以上の成分の染色によって同定することができる。未刺激型多原発性白血病(PMN)では、ヒストンは核内のみに位置し、NEは顆粒に含まれる。NETosisの間に、NEは核に入り、そこでヒストン3、4を処理する。NETは、刺激されていない好中球で明確に分離された成分のコローカライズによって特徴付けされます。現在、NET特異的エピトープを排他的に検出する抗体は存在しないため(すなわち、ナイーブ好中球と反応しない)、NETsにおける好中球タンパク質のコローカリゼーションを検出することがNETsを同定する唯一の方法である。
組織では、NETsは従来の組織学的染色(例えば、ヘマトキシリン/エオシン[H&E]で染色することによって、NETsを拡散淡い青みを帯びた色合いとして描写する)によって検出されにくい。非常に豊富な場合にのみ、NETは血栓5のようなH&E染色と明確に区別することができます。NETはそれ以上の拡散であるため、組織構造を最適に保存する必要があるため、凍結アーティファクトを誘発しやすいクライオ製剤は、組織内のNETの分析に最適ではありません。その代わりに、ホルムアルデヒド固定およびパラフィン埋め込みは、組織ウェル2におけるNET構造を維持することが示されている。(免疫-)パラフィン埋め込み組織のセクションの組織学的検査は、病理学的分析のための標準的な方法である。パラフィンブロック内の組織は室温(RT)でも保存されるため、毎日の診断作業の組織標本は、数年前に調製された標本と比較することができ、最近生じた疑問や技術を使用します。組織内のNETは最近まで検出されておらず、疾患の過程でNETの形成と除去の詳細な分析は、病因に関する新たな洞察につながる可能性があります。パラフィン埋め込み組織の使用は、アーカイブ材料の分析を可能にし、遡及的研究を行うために非常に貴重な利点を有する6.間違いなく、これらの利点はコストがかかります。パラフィンに埋め込む前に、組織はホルムアルデヒド固定、脱水、50°C以上の加熱されす必要があります。これらの手順は、組織の自己蛍光だけでなく、エピトープマスキングを誘発する。
固定アーティファクトを制限するには、固定時間を最小限に抑える必要がありますので、組織サンプルのサイズは、20 mm x 30 mm の面積を超えてはなりません (厚さ~3 mm)。このサイズのサンプルは、ホルムアルデヒドでRTで一晩インキュベーションした後に完全に固定され、理想的には直接脱水およびパラフィン埋め込みが続く。または、固定サンプルをバッファに1日または2日間保存することもできます。免疫蛍光研究のために、固定剤は、適切なバッファーに溶解したパラホルムアルデヒド(例えば、リン酸緩衝生理食べ物[PBS]またはトリスバッファー生理食べ物[TBS])から新たに調製されるべきである。固定調製中は、ギ酸の形成を防ぐために温度を60°C以下に保つ必要があります。病理の標準的な固定剤であるホルマリンは、メタノール、他のアルデヒド、ケトン、ギ酸を含むので使用しないでください。これらの不純物は、エピトープマスキングの増加および重要な組織自己蛍光につながる。
免疫標識を成功させるためには、エピトープマスキングを抗原検索と呼ばれるプロセスで元に戻す必要があります。組織切片は、メチレン橋を壊すと考えられている適切なバッファーで加熱されているので、エピトープは抗体7にアクセス可能になる。NETの検出のために、熱誘発エピトープ検索(HIER)は、プロテオ溶解酵素の使用などの他の方法に好ましい。日常的に、パラフィン切片の免疫標識は、単一の抗体で行われ、続いてペルオキシダーゼ標識二次抗体が、沈殿基板で検出される。免疫蛍光と比較して、酵素系検出方法は、沈殿物の拡散による空間分解能が低く、一般に、複数の抗原の同時検出は6である。
現在、NETに排他的に結合する抗体は存在しないため、このプロトコルは、核であるヒストン2Bと顆粒に局在する好中球エラスターゼの2つのタンパク質に標識するために使用されます。非刺激性好中球では、これらのタンパク質は分離されますが、NETosisを受けている好中球とNETsで共局在化します。2つの抗原の同時検出は、異なる宿主で発生した2つの一次抗体と、異なるフルオロクロムで標識された2種特異的二次抗体で達成することができる。このレポートは、以前に公開されたプロトコル8の標準化であり、ヒトおよびマウス起源のパラフィン埋め込み組織のNET成分を確実に染色する2つの市販抗体の組み合わせを使用しています。
病因9の間にNETsの役割に対する意識が高まるにつれて、患者または実験動物からの組織における検出の重要性が高まっている。パラフィン埋め込み組織サンプルは、他の組織製剤(例えば、凍結保存標本のセクション)と比較して多くの利点を有する。パラフィン埋め込みサンプル中の組織保存は明らかに優れ、一度埋め込まれると、サンプルは何十年も保存され、逆行研究が可能になります。繊細構造であるNETの検出のために、良好なサンプル保存は、凍結保存材料の使用を除外する前提条件であり、氷結晶形成による組織損傷を引き起こしやすい形態的に類似した人工物を生じやすい。ネット。
最適な保存のために、実験動物からの組織は、自己リシスを避けるために、理想的には灌流によって、死後まもなく固定されるべきである。固定剤として、最適なTBSまたはPBS鉱石のような適切なバッファーでパラホルムアルデヒドの新鮮な、または新たに解凍された溶液。これは、標準的な組織学に使用されるホルマリン製剤とは対照的に化学的に定義され、より少ない組織自己蛍光を誘導する。対照的に、ヒト組織は切除後に直接固定されることが多く、固定剤として、通常、重合を防ぐための安定剤としてメタノールの10%~15%を含むホルマリンの10%希釈が利用され、ギ酸、他のアルデヒド、ケトンが挙げられる。.多くの場合、組織は埋め込む前に長時間この固定剤に保存されます。結果は、自己解起(切除と固定の間の時間に応じて)、およびオーバーフィックスによるメチレンブリッジの過剰な形成することができます。ホルムアルデヒド固定は、内および分子間メチレンブリッジ10の形成によってタンパク質の三次構造の変化を誘発する。核酸、炭水化物、脂質などの非タンパク質細胞成分は、直接固定されるのではなく、三次元タンパク質ネットワークに固定化されます。ラベリングを成功させるためには、抗原検索の過程でエピトープを露出させるためにメチレン結合を分解する必要があります。これは、適切な熱誘発抗原検索バッファー(HIERバッファー)11内の顕微鏡スライドに取り付けられた組織セクションの加熱によって達成される。我々の前回の研究では、パラフィン化組織におけるNET成分の検出に対するHIERバッファーのpHおよび温度の影響を分析し、1つの成分に対する組織前処理の成功は、しばしば第2の成分8に対して最適ではないことが判明した。
一方、9のpHでHIERバッファーで組織を70°Cに加熱することは、多くのNET成分にとって良好な妥協であり、より高い温度でしばしば損なわれる良好な組織保存を保持することが分かっています。出発点として示された検索時間を使用することが提案されていますが、特に未知の固定パラメータのアーカイブ標本では、染色強度が不十分な場合があります。この場合、検索手順中の温度の延長またはより高い温度は、染色効率を向上させることができる。これはまた、我々のプロトコルで使用されるIgY抗体のヒストン2B染色に影響を与えることができる。図1に示すように、凝縮されたクロマチンは、NETosisを受けている好中球およびNETsの染色において、休息中の好中球のクロマチンと比較して、この抗体ではるかに強い染色を見つけることができます。これはおそらく、コンパクトな核への180 kDa IgY分子のアクセスが制限されているため、エピトープ回収の増加後に異なる可能性があります。これは凝縮クロマチンの領域でも結合効率を強める可能性があり、好中球および他の細胞の正常な核においてより強い蛍光をもたらす。NETosisを受けている好中球と非刺激性好中球の間の染色効率の違いは、図1に示されているよりも顕著でなく、顕著である可能性がある。NET形成の領域は、NE、H2B、およびDNAの共局在によって依然として同定されるであろう。
固定手順はまた、主にスペクトルの青みがかった/緑がかった部分で、組織の重要な自己蛍光を誘発することができます。この自己蛍光のほとんどを避けることは、青色の励起で使用されるフルオロクロムの放出最大値(例えば、Cy2、アレクサフルー)に一致する適切な狭いバンドパス蛍光フィルタセット(ワイドフィールド)または検出器設定(共焦点)を使用して、この自己蛍光のほとんどを避けるために重要です。488. 自己蛍光の極端な場合、スペクトルの青みがかった/緑がかった部分は避けるべきです。代わりに、蛍光信号はスペクトルの遠い部分(例えば、Cy5またはAlexaFluor 635に結合された二次抗体)で容易に検出できますが、これにはフィルターレスの白黒カメラまたは共焦点顕微鏡が必要です。人間の目は600nmを超えるかなり無感覚であるため、遠く赤色蛍光シグナルは眼を用いて検出することはほとんどできない。いずれにせよ、適切な露光時間または検出器の設定を決定するために、陰性コントロール(例えば、一次抗体の代わりに非免疫型/アイソタイプコントロール)を使用することが重要です。
1−2 μmの組織切片は10xまたは20xの目的を使用して広視野顕微鏡によって分析することができる。これらのレンズは、大きな焦点深さを提供するので、(ほぼ)組織セクション全体が焦点になります。これは、NET形成の領域が十分に大きい場合に組織セクションを迅速にスキャンするために使用できます (図 1のように)。緑(NE)、赤色(H2B)、青(DNA)チャネルの共局在化は、NET形成の領域を示す白色染色をもたらす(図1G)。高倍率を高めるには、デコンボリューションを伴う共焦点顕微鏡または広視野顕微鏡が必要です。図2は、図1にも使用されるヒト虫垂炎標本の詳細を示す。図2Aでは、NEは小さなドット(顆粒)に局局所化するが、大部分は細胞外であり、H2B(図2B)およびDNA(図2C)と重なるストライプを形成することが多い。このコローカライズの結果、NETs (図 2D)を示す白っぽいオーバーレイが発生します。M.結核に感染したマウスの肺部にも非常によく似たパターンが見られます(図3)。
ここで提示される標本は、低倍率でも同定できるNET形成度の高い領域を特徴とする。組織密度およびそれぞれの刺激に応じて、NET形成は、好中球の小さなグループのNET形成まで、はるかに顕著であり得る(例えば心筋炎の例では、以前の出版物12を参照)。このプロトコルは、組織内のNETに関するより多くの研究を促進し、うまくいけば、病気の形成または予防におけるNETの認識されていない役割の解明に役立つと考えられています。
The authors have nothing to disclose.
著者は何も開示していない。
bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
embedding molds | Sakura | 4162 | |
embedding station | Microm | AP280 | |
ethanol | Roth | 9065.4 | |
filter paper, rolled | OCB | ||
forceps | Dumont | 7a | |
glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
glycerol | Roth | 3783.1 | |
HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
normal donkey serum | Merck | S30 | |
PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
scalpel | Braun | Fig.22 | |
Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
Tween 20 | Fluka | 93773 | |
water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |