As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas tridimensionais geradas por granulócitos estimulados de neutrófilos. Tornou-se claro nos últimos anos que as redes estão envolvidas em uma grande variedade de doenças. A detecção de redes no tecido pode ter relevância diagnóstica, sendo necessários protocolos padronizados para a rotulagem de componentes NET.
Os granulócitos de neutrófilos, também chamados de leucócitos polimorfonucleares (PMN) devido ao seu núcleo lobulado, são o tipo mais abundante de leucócitos. Eles amadurecem na medula óssea e são liberados para o sangue periférico, onde circulam por cerca de 6 − 8 h; no entanto, no tecido, eles podem sobreviver por dias. Por diapedese através do endotélio, eles deixam a corrente sanguínea, entram nos tecidos e migram para o local de uma infecção após gradientes Quimiotáticos. Neutrófilos podem combater microrganismos invasores por fagocitose, degranulação e geração de armadilhas extracelulares de neutrófilos (Nets). Este protocolo ajudará a detectar as redes no tecido parafina-encaixado. As redes são o resultado de um processo chamado NETosis, que leva à liberação de componentes nucleares, granulados e citoplasmáticos, seja de neutrófilos vivos (NETosis vital) ou moribundos (NETosis suicida). In vitro, redes formam estruturas semelhantes à nuvem, que ocupam um espaço várias vezes maior do que as células a partir das quais eles descendem. A espinha dorsal das redes é a cromatina, à qual uma seleção de proteínas e peptídeos originários de grânulos e citoplasma estão ligados. Dessa forma, uma alta concentração local de compostos tóxicos é mantida para que as redes possam capturar e inativar uma variedade de patógenos, incluindo bactérias, fungos, vírus e parasitas, enquanto a difusão dos componentes NET altamente ativos que levam a danos em tecido vizinho é limitado. No entanto, nos últimos anos, tornou-se evidente que as redes, se geradas em abundância ou apuradas insuficientemente, têm potencial patológico variando de doenças auto-imunes a câncer. Assim, a detecção de redes em amostras de tecido pode ter significância diagnóstica, e a detecção de redes em tecido doente pode influenciar no tratamento dos pacientes. Desde que as amostras de tecido parafina-encaixadas são o espécime padrão usado para a análise patológica, procurou-se estabelecer um protocolo para a mancha fluorescente de componentes líquidos no tecido parafina-encaixado usando anticorpos comercialmente disponíveis.
As armadilhas extracelular de neutrophil (redes) têm uma estrutura tridimensional complexa. Varredura de alta resolução-elétron-a análise microscópica revelou que consistem em fibras lisas com um diâmetro de 15 − 20 nanômetro (Chromatin) enchido com os domínios globular de > 25 nanômetro que consistem presumivelmente de uma variedade de aproximadamente 30 granulados e citoplasmáticos proteínas e peptídeos1,2. Quando gerados in vitro a partir de neutrófilos isolados, as redes podem ser identificadas por coloração de dois ou mais de seus componentes por imunofluorescência (por exemplo, histonas e elastase de neutrófilos [NE]). Em leucócito polimorfonucleares não estimulados (PMN), os histonas são situados exclusivamente no núcleo, quando o ne for contido nos grânulo. Durante a netose, ne entra no núcleo, onde processa histonas3,4. As redes são caracterizadas por colocalização de componentes, que são claramente separados em neutrófilos não estimulados. Uma vez que atualmente não existem anticorpos que detectam exclusivamente resumos específicos da net (ou seja, não reagem com neutrófilos ingênuos), detectar a colocalização de proteínas de neutrófilos em redes é a única maneira de identificar as redes.
No tecido, as redes dificilmente podem ser detectadas por manchas histológicas convencionais (por exemplo, por coloração com hematoxilina/eosina [H & E], que retrata as redes como um tinge azulado pálido difuso). Somente quando altamente abundante, as redes podem claramente ser distinguidas com a mancha de H & E, tal como nos trombos5. Uma vez que as redes são difusas por si, a estrutura do tecido tem que ser preservada de forma otimizada, então as criopreparações que são propensas a induzir artefatos congelantes são suboptimal para análise de redes no tecido. Em vez disso, a fixação de formaldeído e a incorporação de parafina mostraram preservar a estrutura líquida no poço de tecido2. (Immuno-) a inspeção histológica das seções do tecido parafina-encaixado é o método padrão para a análise patológica. Como o tecido em blocos de parafina é conservado mesmo à temperatura ambiente (RT), espécimes de tecido do trabalho diagnóstico diário podem ser comparados com espécimes que foram preparados anos atrás, com perguntas e técnicas que surgiram recentemente. As redes no tecido não foram detectadas até recentemente, e a análise detalhada da formação e da remoção líquidas durante o curso das doenças pode conduzir aos introspecções novas na patogénese. O uso de tecido embebido em parafina tem a vantagem inestimável para permitir a análise do material arquivístico e realizar estudos retrospectivos6. Inegavelmente, esses benefícios têm um custo. Antes de incorporar em parafina, o tecido tem que ser formaldeído-fixo, desidratado e aquecido acima de 50 ° c. Estes procedimentos induzem o autofluorescence do tecido assim como o mascaramento do epítopo.
Para limitar os artefatos de fixação, o tempo de fixação deve ser mantido ao mínimo, de modo que o tamanho das amostras de tecido não deve exceder uma área de 20 mm x 30 mm com ~ 3 mm de espessura. Amostras deste tamanho são completamente fixas após a incubação durante a noite em RT em formaldeído, idealmente seguido por desidratação direta e incorporação de parafina. Alternativamente, as amostras fixas podem ser armazenadas por 1 ou 2 dias em buffer. Para estudos de imunofluorescência, o fixador deve ser preparado recentemente a partir de paraformaldeído dissolvido em um tampão adequado (por exemplo, salina tamponada com fosfato [PBS] ou solução salina tampão Tris [TBS]). Durante a preparação fixativa, a temperatura deve ser mantida abaixo de 60 ° c para evitar a formação de ácido fórmico. Formalina, que é um fixador padrão para a patologia, não deve ser utilizado uma vez que contém metanol, outros aldeídos, cetonas e ácido fórmico. Estas impurezas conduzem ao mascaramento aumentado do epítopo e ao autofluorescence significativo do tecido.
Para o immunolabelling bem sucedido, o mascaramento do epítopo tem que ser revertido em um processo chamado recuperação do antígeno. As seções do tecido são heated em um amortecedor apropriado, que seja acreditado para quebrar pontes de metileno, assim que os resumos tornam-se acessíveis aos anticorpos7. Para a deteção das redes, a recuperação calor-induzida do epítopo (hier) é preferida a outros métodos tais como o uso de enzimas proteolíticas. Rotineiramente, imunomarcação de seções da parafina é realizado com um único anticorpo seguido por um anticorpo secundário peroxidase-etiquetado, que seja detectado com um substrato precipitantes. Comparado à imunofluorescência, os métodos de deteção enzima-baseados têm uma definição espacial mais baixa devido à difusão do precipitado da carcaça, e geralmente, a deteção simultânea de mais de um antígeno é limitada6.
Como atualmente não existem anticorpos que se ligam exclusivamente a redes, este protocolo é usado para rotular duas proteínas, histona 2B, que é nuclear, e elastase neutrofínica, que está localizada em grânulos. Em neutrófilos não estimulados, estas proteínas são separadas, mas são colocalizadas em neutrófilos submetidos a NETosis e em redes. A deteção simultânea de dois antígenos pode ser conseguida com dois anticorpos preliminares levantados em anfitriões diferentes e em dois anticorpos secundários espécie-específicos etiquetados com os fluorochromes diferentes. Este relatório é uma padronização de nosso protocolo previamente publicado8 e usa uma combinação de dois anticorpos comercialmente disponíveis que mancham confiantemente componentes líquidos no tecido parafina-encaixado, fresco e Archival, da origem humana e murino.
Com a consciência crescente do papel das redes durante a patogénese9, sua deteção no tecido dos pacientes ou dos animais experimentais está ganhando a importância crescente. Amostras de tecido embebido em parafina têm uma série de vantagens em comparação com outras preparações teciduais (por exemplo, secções de espécimes criopreservados). A preservação do tecido em amostras parafina-encaixadas é claramente superior, e uma vez encaixada, as amostras são preservadas por décadas, permitindo estudos retrógrados. Para a deteção das redes, que são estruturas filigrana, a boa conservação da amostra é uma condição prévia que governa para fora o uso do material cryopreservado, que é dano de tecido propenso devido à formação do cristal de gelo que pode dar a ascensão aos artefatos que assemelham-se morfològica Redes.
Para a preservação óptima, o tecido dos animais experimentais deve ser fixado logo após a morte, idealmente pela perfusão, para evitar a autólise. Como soluções fixative, recentemente preparadas ou recentemente descongelado do paraformaldeído em um amortecedor apropriado como o minério de TBS ou de PBS ideal. Isto é quimicamente definido em contraste com preparações de formalina utilizados para a histologia padrão, e induz menos autofluorescência tecidual. Em contraste, o tecido humano muitas vezes não é fixado diretamente após a excisão, e como fixador, normalmente uma diluição de 10% de formalina é utilizada, que contém 10% a 15% de metanol como um estabilizador para prevenir a polimerização, bem como o ácido fórmico, outros aldeídos e cetonas . Frequentemente, o tecido é armazenado neste fixador para quantidades prolongadas de tempo antes de incorporar. O resultado pode ser a autólise (dependendo do tempo entre a excisão e a fixação), e a formação excessiva de pontes de metileno devido à superfixação. A fixação do formaldehyde induz mudanças na estrutura terciária das proteínas pela formação de pontes intra e inter-molecular do metileno10. Componentes de células não proteicas como ácidos nucleicos, carboidratos e lipídios não são fixados diretamente, mas imobilizados na rede de proteínas tridimensionais. Para a rotulagem bem sucedida, as ligações de metileno têm de ser quebradas para expor os epítopos no processo de recuperação do antígeno. Isto é conseguido pelo aquecimento de seções do tecido montadas em corrediças do microscópio em um amortecedor calor-induzido apropriado da recuperação do antígeno (tampão de HIER)11. Nosso estudo anterior analisou a influência do pH e da temperatura de buffers HIER na detecção de componentes NET no tecido paraffinizado, e verificou-se que o pré-tratamento tecidual bem-sucedido para um componente, muitas vezes, é suboptimal para um segundo componente8.
Entretanto, verificou-se que o aquecimento do tecido para 70 ° c no tampão HIER em um pH de 9 é um bom compromisso para muitos componentes NET e manterá boa preservação do tecido, que é muitas vezes comprometida em temperaturas mais elevadas. Propõe-se usar o tempo de recuperação indicado como ponto de partida, mas especialmente com espécimes de arquivamento de parâmetros de fixação desconhecidos, a intensidade de coloração pode ser insatisfatória. Neste caso, a prolongação ou maior temperatura durante o procedimento de recuperação pode melhorar a eficiência de coloração. Isso também pode influenciar a coloração de histona 2B do anticorpo IgY usado em nosso protocolo. Como mostrado na Figura 1, a cromatina desdensed pode ser encontrada em neutrófilos submetidos a netosis, bem como em manchas de redes muito mais fortes com este anticorpo em comparação com cromatina em neutrófilos em repouso. Isto é provavelmente devido ao acesso restrito da molécula de 180 kDa IgY aos núcleos compactos e pode diferir após a recuperação aumentada do epítopo. Isso pode intensificar a eficiência vinculativa mesmo em áreas de cromatina condensada, o que resultará em fluorescência mais forte em núcleos normais de neutrófilos e outras células. A diferença na eficiência de coloração entre neutrófilos submetidos a netose e neutrófilos não estimulados pode ser menos pronunciada do que a descrita na Figura 1. Áreas de formação líquida ainda seriam identificadas pela colocalização de NE, H2B e DNA.
O procedimento de fixação também pode induzir autofluorescência significativa do tecido, principalmente na parte azulada/esverdeada do espectro. É importante evitar a maior parte dessa autofluorescência usando conjuntos de filtros de fluorescência de bandpass estreito adequado (amplo campo) ou configurações de detector (confocal) que correspondem ao máximo de emissão do fluorocromo usado com excitação azul, por exemplo, Cy2, Alexafluor 488. em casos extremos de autofluorescência, deve-se evitar a parte azulada/greenish do espectro. Em vez disso, os sinais de fluorescência podem ser detectados mais facilmente na parte vermelha distante do espectro (por exemplo, anticorpos secundários acoplados a Cy 5 ou Alexafluor 635), mas isso requer câmeras preto/branco sem filtro ou microscópios confocais. Desde que o olho humano é um pouco insensível além de 600 nanômetro, os sinais vermelhos distantes da fluorescência podem mal ser detectados usando oculars. Em qualquer caso, é importante usar controles negativos (por exemplo, soros não imunes/controles isotipos em vez de anticorpos primários ou omitindo anticorpos primários) para determinar os tempos de exposição adequados ou as configurações do detector.
As seções do tecido do μm 1 − 2 podem ser analisadas com os microscópios do largo-campo usando 10x ou 20x objetivos. Estas lentes fornecem uma grande profundidade focal, assim (quase) a seção inteira do tecido estará no foco. Isto pode ser usado para escanear rapidamente seções do tecido para áreas da formação líquida se são suficientemente grandes (como em Figura 1). A colocalização dos canais verde (NE), vermelho (H2B) e azul (DNA) resulta em coloração branca indicando áreas de formação líquida (Figura 1G). Para maiores ampliações, microscópios confocais ou de campo largo com desvolução são necessários. A Figura 2 mostra detalhes da amostra de apendicite humana também utilizada para a Figura 1. Na Figura 2a, a ne localiza-se em pequenos pontos (grânulos), mas uma grande proporção é extracelular, muitas vezes formando listras que se sobrepõem com H2B (Figura 2b) e DNA (Figura 2C). Essa colocalização resulta em uma sobreposição esbranquiçada indicando redes (Figura 2D). Um padrão muito semelhante pode ser encontrado na seção pulmonar de um camundongo infectado por M. tuberculosis (Figura 3).
Os espécimes aqui apresentados são caracterizados por áreas com alto grau de formação líquida que podem ser identificadas mesmo em baixa ampliação. Dependendo da densidade tecidual e respectivo estímulo, a formação líquida pode ser muito menos pronunciada, até a formação líquida de pequenos grupos de neutrófilos (para um exemplo de miocardite, ver uma publicação anterior12). Acredita-se que este protocolo vai ajudar a promover mais pesquisas sobre redes de tecidos e esperamos ajudar a desvendar os papéis não reconhecidos de redes na formação ou prevenção de doenças.
The authors have nothing to disclose.
Os autores não têm nada a revelar.
bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
embedding molds | Sakura | 4162 | |
embedding station | Microm | AP280 | |
ethanol | Roth | 9065.4 | |
filter paper, rolled | OCB | ||
forceps | Dumont | 7a | |
glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
glycerol | Roth | 3783.1 | |
HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
normal donkey serum | Merck | S30 | |
PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
scalpel | Braun | Fig.22 | |
Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
Tween 20 | Fluka | 93773 | |
water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |