Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son estructuras tridimensionales generadas por granulocitos neutrófilos estimulados. En los últimos años ha quedado claro que los NET están implicados en una amplia variedad de enfermedades. La detección de NETs en el tejido puede tener relevancia diagnóstica, por lo que se requieren protocolos estandarizados para etiquetar los componentes NET.
Los granulocitos neutrófilos, también llamados leucocitos polimorfonucleares (PMN) debido a su núcleo lobulado, son el tipo más abundante de leucocitos. Maduran en la médula ósea y se liberan en la sangre periférica, donde circulan durante aproximadamente 6 x 8 h; sin embargo, en el tejido, pueden sobrevivir durante días. Por diapedesis a través del endotelio, salen del torrente sanguíneo, entran en los tejidos y migran hacia el sitio de una infección después de gradientes quimiotácticos. Los neutrófilos pueden combatir los microorganismos invasores por fagocitosis, desgranulación y generación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Este protocolo ayudará a detectar NETs en tejido incrustado en parafina. Los NET son el resultado de un proceso llamado NETosis, que conduce a la liberación de componentes nucleares, granulares y citoplasmáticos, ya sea de neutrófilos vivos (NETosis vital) o moribundos (NETosis suicida). In vitro, los NET forman estructuras similares a las nubes, que ocupan un espacio varias veces mayor que el de las células de las que descendieron. La columna vertebral de los NETs es la cromatina, a la que se unen una selección de proteínas y péptidos procedentes de gránulos y citoplasma. De este modo, se mantiene una alta concentración local de compuestos tóxicos para que los NET puedan capturar e inactivar una variedad de patógenos, incluyendo bacterias, hongos, virus y parásitos, mientras que la difusión de los componentes de LA NET altamente activos que conducen a daños en tejido vecino es limitado. Sin embargo, en los últimos años se ha hecho evidente que las NET, si se generan en abundancia o se borran insuficientemente, tienen un potencial patológico que va desde enfermedades autoinmunes hasta cáncer. Por lo tanto, la detección de NETs en muestras de tejido puede tener significación diagnóstica, y la detección de NETs en tejido enfermo puede influir en el tratamiento de los pacientes. Dado que las muestras de tejido incrustadoen de parafina son la muestra estándar utilizada para el análisis patológico, se buscó establecer un protocolo para la tinción fluorescente de componentes NET en tejido incrustado en parafina utilizando anticuerpos disponibles comercialmente.
Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) tienen una estructura tridimensional compleja. El análisis microscópico de escaneo electrónico de alta resolución reveló que consisten en fibras lisas con un diámetro de 15 a 20 nm (cromatina) salteada con dominios globulares de >25 nm que presumiblemente consisten en una variedad de aproximadamente 30 granulares y citoplasmáticas proteínas y péptidos1,2. Cuando se generan in vitro a partir de neutrófilos aislados, las NET se pueden identificar mediante la tinción de dos o más de sus componentes por inmunofluorescencia (por ejemplo, histonas y neutrófilos elastasa [NE]). En leucocitos polimorfonucleares no estimulados (PMN), las histonas se encuentran exclusivamente en el núcleo, mientras que NE está contenida en gránulos. Durante la NETosis, NE entra en el núcleo, donde procesa las histonas3,4. Los NET se caracterizan por la colocación de componentes, que están claramente separados en neutrófilos no estimulados. Dado que actualmente no existen anticuerpos que detecten exclusivamente epítopos específicos de NET (es decir, no reaccionan con neutrófilos ingenuos), la detección de la colocalización de proteínas neutrófilas en los NET es la única manera de identificar los NET.
En el tejido, las NET difícilmente pueden ser detectadas por las manchas histológicas convencionales (por ejemplo, manchando con hematoxilina/eosina [H&E], que representa los NET como un tinte azulado pálido difuso). Sólo cuando son muy abundantes, los NET se pueden distinguir claramente con la tinción de H&E, como en thrombi5. Dado que los NET son difusos per se, la estructura tisular tiene que ser preservada de manera óptima, por lo que las criopreparaciones que son propensas a inducir artefactos de congelación son subóptimas para el análisis de NETs en el tejido. En su lugar, se ha demostrado que la fijación de formaldehído y la incrustación de parafina conservan la estructura NET en el pozo de tejido2. (La inspección inmuno-)histológica de secciones de tejido incrustado en parafina es el método estándar para el análisis patológico. Como el tejido en bloques de parafina se conserva incluso a temperatura ambiente (RT), los especímenes de tejido del trabajo de diagnóstico diario se pueden comparar con muestras que se han preparado hace años, con preguntas y técnicas que han surgido recientemente. Los NET en el tejido no se han detectado hasta hace poco, y el análisis detallado de la formación y eliminación de redes de redes en el curso de las enfermedades puede dar lugar a nuevos conocimientos sobre la patogénesis. El uso de tejido incrustado en parafina tiene la ventaja inestimable de permitir el análisis de material de archivo y para llevar a cabo estudios retrospectivos6. Innegablemente, estos beneficios tienen un costo. Antes de incrustarlo en parafina, el tejido debe ser fijado por formaldehyde, deshidratado y calentado por encima de 50oC. Estos procedimientos inducen la autofluorescencia tisular, así como el enmascaramiento de epítopos.
Para limitar los artefactos de fijación, el tiempo de fijación debe mantenerse al mínimo, por lo que el tamaño de las muestras de tejido no debe exceder un área de 20 mm x 30 mm con un grosor de 3 mm. Las muestras de este tamaño se fijan completamente después de la incubación durante la noche en RT en formaldehído, idealmente seguidas de deshidratación directa e incrustación de parafina. Alternativamente, las muestras fijas se pueden almacenar durante 1 o 2 días en el búfer. Para estudios de inmunofluorescencia, el fijador debe prepararse recién a partir de paraformaldehído disuelto en un tampón adecuado (por ejemplo, solución salina con búfer de fosfato [PBS] o solución salina con tris tampón [TBS]). Durante la preparación fijadora, la temperatura debe mantenerse por debajo de 60 oC para evitar la formación de ácido fórmico. La formalina, que es un fijador estándar para la patología, no debe utilizarse ya que contiene metanol, otros aldehídos, cetonas y ácido fórmico. Estas impurezas conducen a un aumento del enmascaramiento del epítopo y a una autofluorescencia significativa del tejido.
Para un inmunoetiquetado exitoso, el enmascaramiento de epítopos tiene que revertirse en un proceso llamado recuperación de antígenos. Las secciones de tejido se calientan en un tampón adecuado, que se cree que rompe los puentes de metileno, por lo que los epítopos se vuelven accesibles a los anticuerpos7. Para la detección de NETs, la recuperación de epítopos inducidapor por calor (HIER) se prefiere a otros métodos como el uso de enzimas proteolíticas. Habitualmente, el inmunoetiquetado de las secciones de parafina se lleva a cabo con un único anticuerpo seguido de un anticuerpo secundario etiquetado con peroxidasa, que se detecta con un sustrato precipitante. En comparación con la inmunofluorescencia, los métodos de detección basados en enzimas tienen una resolución espacial más baja debido a la difusión del precipitado de sustrato, y generalmente, la detección simultánea de más de un antígeno está limitada6.
Como actualmente no existen anticuerpos que se unan exclusivamente a los NET, este protocolo se utiliza para etiquetar dos proteínas, la histona 2B, que es nuclear, y la aslostasa de neutrófilos, que se localiza en gránulos. En los neutrófilos no estimulados, estas proteínas se separan, pero se colocalizan en neutrófilos sometidos a NETosis y en NETs. La detección simultánea de dos antígenos se puede lograr con dos anticuerpos primarios criados en diferentes huéspedes y dos anticuerpos secundarios específicos de cada especie etiquetados con diferentes fluorocromos. Este informe es una estandarización de nuestro protocolo8 publicado anteriormente y utiliza una combinación de dos anticuerpos disponibles comercialmente que manchan de forma fiable los componentes de NET en tejido incrustado en parafina, tanto frescocomo como de archivo, de origen humano y murino.
Con la creciente conciencia del papel de las NETs durante la patogénesis9,su detección en el tejido de pacientes o animales experimentales está ganando cada vez más importancia. Las muestras de tejido incrustado en parafina tienen una serie de ventajas en comparación con otras preparaciones de tejido (por ejemplo, secciones de muestras crioconservadas). La preservación de tejidos en muestras incrustadas en parafina es claramente superior, y una vez incrustadas, las muestras se conservan durante décadas, lo que permite estudios retrógrados. Para la detección de NETs, que son estructuras de filigrana, una buena conservación de muestras es una condición previa que descarta el uso de material crioconservado, que es propenso a daños tisulares debido a la formación de cristales de hielo que pueden dar lugar a artefactos morfológicamente parecidos Redes.
Para una preservación óptima, el tejido de los animales experimentales debe fijarse poco después de la muerte, idealmente por perfusión, para evitar la autolisis. Como soluciones fijativas, recién preparadas o recién desawed de paraformaldehído en un tampón adecuado como TBS o PBS mineral óptimo. Esto se define químicamente en contraste con las preparaciones de formalina utilizadas para la histología estándar, e induce menos autofluorescencia tisular. Por el contrario, el tejido humano a menudo no se fija directamente después de la escisión, y como fijador, normalmente se utiliza una dilución del 10% de la formalina que contiene 10% a 15% de metanol como estabilizador para prevenir la polimerización, así como ácido fórmico, otros aldehídos y cetonas . A menudo, el tejido se almacena en este fijador durante largos períodos de tiempo antes de la incrustación. El resultado puede ser la autolisis (dependiendo del tiempo entre la escisión y la fijación), y la formación excesiva de puentes de metileno debido a la sobrefijación. La fijación de formaldehído induce cambios en la estructura terciaria de las proteínas mediante la formación de puentes de metileno intra eintermoleculares 10. Los componentes celulares no proteicos como los ácidos nucleicos, los carbohidratos y los lípidos no se fijan directamente, sino que se inmovilizan en la red de proteínas tridimensionales. Para un etiquetado exitoso, los enlaces de metileno deben romperse para exponer los epítopos en el proceso de recuperación de antígenos. Esto se logra calentando las secciones de tejido montadas en diapositivas de microscopio en un tampón de recuperación de antígenos inducido por calor adecuado (buffer HIER)11. Nuestro estudio anterior analizó la influencia del pH y la temperatura de los tampones HIER en la detección de componentes NET en tejido parafinado, y se encontró que el pretratamiento exitoso de tejidos para un componente a menudo es subóptimo para un segundo componente8.
Mientras tanto, se ha encontrado que calentar el tejido a 70 oC en tampón HIER a un pH de 9 es un buen compromiso para muchos componentes de la RED y conservará una buena preservación del tejido, que a menudo se ve comprometida a temperaturas más altas. Se propone utilizar el tiempo de recuperación indicado como punto de partida, pero especialmente con muestras de archivo de parámetros de fijación desconocidos, la intensidad de tinción puede ser insatisfactoria. En este caso, la prolongación o mayor temperatura durante el procedimiento de recuperación puede mejorar la eficiencia de la tinción. Esto también puede influir en la tinción histona 2B del anticuerpo IgY utilizado en nuestro protocolo. Como se muestra en la Figura 1,la cromatina descondensada se puede encontrar en neutrófilos sometidos a NETosis, así como en las manchas NETs mucho más fuertes con este anticuerpo en comparación con la cromatina en neutrófilos en reposo. Esto es probablemente debido al acceso restringido de la molécula IgY de 180 kDa a núcleos compactos y puede diferir después de una mayor recuperación del epítopo. Esto puede intensificar la eficiencia de unión incluso en áreas de cromatina condensada, lo que resultará en una fluorescencia más fuerte en los núcleos normales de los neutrófilos y otras células. La diferencia en la eficiencia de tinción entre los neutrófilos sometidos a NETosis y los neutrófilos no estimulados podría ser menos pronunciada de lo que se muestra en la Figura 1. Las áreas de formación de NET todavía se identificarían mediante la colocalización de NE, H2B y DNA.
El procedimiento de fijación también puede inducir una autofluorescencia significativa del tejido, principalmente en la parte azulada/verdosa del espectro. Es importante evitar la mayor parte de esta autofluorescencia mediante el uso de conjuntos adecuados de filtros de fluorescencia de paso de banda estrecho (campo ancho) o ajustes de detector (confocal) que coincidan con el máximo de emisión del fluorocromo utilizado con excitación azul, por ejemplo, Cy2, Alexafluor Alexafluor 488. En casos extremos de autofluorescencia, debe evitarse la parte azulada/verdosa del espectro. En su lugar, las señales de fluorescencia se pueden detectar más fácilmente en la parte roja del espectro (por ejemplo, anticuerpos secundarios acoplados a Cy 5 o Alexafluor 635), pero esto requiere cámaras blancas y negras sin filtros o microscopios confocales. Dado que el ojo humano es bastante insensible más allá de 600 nm, las señales de fluorescencia de extremo rojo difícilmente se pueden detectar usando oculares. En cualquier caso, es importante utilizar controles negativos (por ejemplo, controles de suero/isotipo no inmunes en lugar de anticuerpos primarios u omisión de anticuerpos primarios) para determinar los tiempos de exposición adecuados o la configuración del detector.
Las secciones de tejido de 1 x 2 m se pueden analizar con microscopios de campo ancho utilizando objetivos de 10x o 20x. Estas lentes proporcionan una gran profundidad focal, por lo que (casi) toda la sección del tejido estará enfocada. Esto se puede utilizar para escanear rápidamente secciones de tejido en busca de áreas de formación de REDES si son lo suficientemente grandes (como en la Figura 1). La colocación de los canales verde (NE), rojo (H2B) y azul (ADN) da como resultado una tinción blanca que indica áreas de formación NET(Figura 1G). Para aumentos más altos, son necesarios microscopios confocales o de campo ancho con desconvolución. La Figura 2 muestra los detalles del espécimen de apendicitis humana también utilizado para la Figura 1. En la Figura 2A,NE localiza en pequeños puntos (gránulos), pero una gran proporción es extracelular, a menudo formando rayas que se superponen con H2B(Figura 2B)y ADN(Figura 2C). Esta colocación da lugar a una superposición blanquecina que indica NETs (Figura 2D). Un patrón muy similar se puede encontrar en la sección pulmonar de un ratón infectado con M. tuberculosis (Figura 3).
Los especímenes presentados aquí se caracterizan por áreas con un alto grado de formación neta que se pueden identificar incluso con bajo aumento. Dependiendo de la densidad tisular y el estímulo respectivo, la formación de REDES puede ser mucho menos pronunciada, hasta la formación NET de pequeños grupos de neutrófilos (por ejemplo en la miocarditis, véase una publicación anterior12). Se cree que este protocolo ayudará a fomentar más investigaciones sobre las NETs en el tejido y, con suerte, ayudará a desentrañar roles no reconocidos de las NET en la formación o prevención de enfermedades.
The authors have nothing to disclose.
Los autores no tienen nada que revelar.
bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
embedding molds | Sakura | 4162 | |
embedding station | Microm | AP280 | |
ethanol | Roth | 9065.4 | |
filter paper, rolled | OCB | ||
forceps | Dumont | 7a | |
glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
glycerol | Roth | 3783.1 | |
HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
normal donkey serum | Merck | S30 | |
PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
scalpel | Braun | Fig.22 | |
Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
Tween 20 | Fluka | 93773 | |
water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |