Neutrofila extracellulära fällor (NETs) är tredimensionella strukturer som genereras av stimulerade neutrofila granulocyter. De senaste åren har det blivit tydligt att nät är inblandade i en mängd olika sjukdomar. Detektering av nät i vävnad kan ha diagnostisk relevans, så standardiserade protokoll för märkning av netto komponenter krävs.
Neutrofila granulocyter, även kallad polymorfonukleära leukocyter (PMN) på grund av deras lobulated kärna, är den vanligast förekommande typen av leukocyter. De mognar i benmärgen och släpps ut i perifert blod, där de cirkulerar i ca 6 − 8 h; men i vävnad, de kan överleva i dagar. Genom diapedesis genom endotelet, de lämnar blodet, ange vävnader, och migrera mot platsen för en infektion efter kemotaktisk gradienter. Neutrofiler kan bekämpa invaderande mikroorganismer genom fagocytos, degranulering, och generering av neutrofila extracellulära fällor (nät). Detta protokoll kommer att bidra till att upptäcka nät i paraffin-inbäddade vävnad. NETs är resultatet av en process som kallas Netos, vilket leder till frisättning av nukleära, granulat, och cytoplasmiska komponenter antingen från levande (Vital NETosis) eller döende (suicidnetos) neutrofiler. In vitro-nät bildar molnliknande strukturer, som upptar ett utrymme flera gånger större än de celler som de härstammade från. Ryggraden i NETs är kromatin, som ett urval av proteiner och peptider som härrör från granulat och cytoplasma är bundna. Därmed upprätthålls en hög lokal koncentration av giftiga föreningar så att näten kan fånga upp och inaktivera en mängd olika patogener, inklusive bakterier, svampar, virus och parasiter, medan spridningen av de högaktiva netto komponenterna leder till skador i angränsande vävnad är begränsad. Under de senaste åren har det dock blivit uppenbart att näten, om de genereras i överflöd eller inte tillräckligt, har patologiska möjligheter som sträcker sig från autoimmuna sjukdomar till cancer. Sålunda kan detektering av nät i vävnadsprover ha diagnostisk betydelse, och upptäckten av nät i sjuk vävnad kan påverka behandlingen av patienter. Eftersom paraffin-inbäddade vävnadsprover är standardpreparat som används för patologisk analys, försökte man upprätta ett protokoll för fluorescerande färgning av netto komponenter i paraffin-inbäddad vävnad med hjälp av kommersiellt tillgängliga antikroppar.
Neutrofila extracellulära fällor (nät) har en komplex tredimensionell struktur. Högupplöst skanning-elektron Mikroskopisk analys visade att de består av släta fibrer med en diameter på 15 − 20 nm (kromatin) överdel med klotformig domäner > 25 nm som förmodligen består av ett sortiment av ca 30 granulat och cytoplasmiska proteiner och peptider1,2. När det genereras in vitro från isolerade neutrofiler, kan nät identifieras genom färgning av två eller flera av deras komponenter genom immunofluorescens (t. ex. histoner och neutrofila elastase [Ne]). I ostimulerade polymorfonukleära leukocyter (PMN), histoner ligger uteslutande i kärnan, medan Ne finns i granulat. Under netosis, kommer Ne in i kärnan, där den bearbetar histoner3,4. NETs kännetecknas av samlokalisering av komponenter, som är tydligt åtskilda i ostimulerade neutrofiler. Eftersom det för närvarande inte finns några antikroppar som enbart detekterar NETTOSPECIFIKA epitoper (dvs. inte reagerar med naiva neutrofiler), är det enda sättet att identifiera nät att detektera
I vävnad kan nät knappast upptäckas genom konventionella histologiska fläckar (t. ex. genom färgning med hematoxylin/Eosin [H & E], som skildrar nät som en diffus blek blåaktig nyans). Endast när mycket riklig, nät kan tydligt särskiljas med H & E färgning, såsom i Trombi5. Eftersom näten är diffusa måste vävnadsstrukturen bevaras optimalt, så Cryo-preparat som är benägna att inducera frys artefakter är suboptimala för analys av nät i vävnad. Istället har formaldehydfixering och paraffin inbäddning visats bevara nätstrukturen i vävnad väl2. (Immuno-) histologisk inspektion av delar av paraffin-inbäddad vävnad är standardmetoden för patologisk analys. Eftersom vävnad i paraffinblock bevaras även vid rumstemperatur (RT), kan vävnadsprover från dagligt diagnostiskt arbete jämföras med prover som har förberetts för åratal sedan, med frågor och tekniker som nyligen har uppstått. Nät i vävnad har inte upptäckts förrän nyligen, och detaljerad analys av netto bildning och avlägsnande under sjukdomsförloppet kan leda till nya insikter i patogenes. Användningen av paraffin-inbäddade vävnad har den ovärderliga fördelen att möjliggöra analys av arkivmaterial och genomföra retrospektiva studier6. Onekligen, dessa fördelar kommer till en kostnad. Innan inbakning i paraffin, vävnad måste formaldehyd-fast, dehydratiserad och upphettas över 50 ° c. Dessa förfaranden framkalla vävnad autofluorescence samt epitop maskering.
För att begränsa fixeringsartefakter, bör fixeringstid hållas till ett minimum, så storleken på vävnadsproverna bör inte överstiga en yta på 20 mm x 30 mm med ~ 3 mm tjocklek. Prover av denna storlek är helt fixerade efter övernattning inkubering vid RT i formaldehyd, helst följt av direkt uttorkning och paraffin inbäddning. Alternativt kan fasta prover lagras i 1 eller 2 dagar i bufferten. För immunofluorescenstest bör fixativ beredas nypreparerad från PARAFORMALDEHYD upplöst i en lämplig buffert (t. ex. fosfatbuffrad saltlösning [PBS] eller Tris-buffrad saltlösning [TBS]). Under fixativ beredning skall temperaturen hållas under 60 ° c för att förhindra bildandet av myrsyra. Formalin, som är en standard fixativ för patologi, bör inte användas eftersom det innehåller metanol, andra aldehyder, ketoner, och myrsyra. Dessa föroreningar leder till ökad epitop maskering och betydande vävnad autofluorescence.
För lyckad immunolabelling, epitop maskering måste återställas i en process som kallas antigen hämtning. Vävnad sektioner värms upp i en lämplig buffert, som tros bryta metylenblått broar, så epitoper bli tillgängliga för antikropparna7. För detektion av nät, värmeinducerad epitop hämtning (HIER) är att föredra framför andra metoder såsom användning av proteolytiska enzymer. Rutinmässigt, immunolabelling av paraffin sektioner utförs med en enda antikropp följt av en peroxidasmärkt sekundär antikropp, som upptäcks med ett utfällning substrat. Jämfört med immunofluorescens, enzymbaserade detektionsmetoder har en lägre rumslig upplösning på grund av diffusion av substratet fällningen, och i allmänhet, samtidig detektion av mer än en antigen är begränsad6.
Som för närvarande finns inga antikroppar som uteslutande binder till nät, detta protokoll används för att märka två proteiner, Histon 2b, som är kärnkraft, och neutrofila elastase, som är lokaliserad i granulat. I ostimulerade neutrofiler separeras dessa proteiner, men de är samlokaliserade i neutrofiler som genomgår Netos och i nät. Samtidig detektion av två antigener kan uppnås med två primära antikroppar som är uppburna i olika värdar och två artspecifika sekundära antikroppar märkta med olika fluorochromes. Denna rapport är en standardisering av vår tidigare publicerade protokoll8 och använder en kombination av två kommersiellt tillgängliga antikroppar som tillförlitligt fläcken netto komponenter i paraffin-inbäddade vävnad, både färskt och arkivering, av mänskligt och murina ursprung.
Med ökad medvetenhet om NETs roll under patogenesen9ökar deras upptäckt i vävnad från patienter eller försöksdjur allt större betydelse. Paraffin-inbäddade vävnadsprover har ett antal fördelar jämfört med andra vävnadspreparat (t. ex. delar av kryopreserverade prover). Vävnaden bevaras i paraffin-inbäddade prover är klart överlägsen, och när inbäddade, proverna bevaras i årtionden, möjliggör retrograd studier. För detektering av nät, som är filigran strukturer, är bra prov bevarande en förutsättning att utesluta användningen av kryopreserverat material, som är benägna att vävnadsskada på grund av is Crystal formation som kan ge upphov till artefakter morfologiskt liknar Nät.
För optimal bevarande bör vävnad från försöksdjur fastställas kort efter döden, helst genom perfusion, för att undvika autolys. Som fixativ, nyberedda eller nyligen upptinade lösningar av PARAFORMALDEHYD i en lämplig buffert som TBS eller PBS malm optimal. Detta är kemiskt definierade i motsats till formalin preparat som används för standard histologi, och inducerar mindre vävnad autofluorescence. Däremot är mänsklig vävnad ofta inte fast direkt efter excision, och som fixativ, normalt en 10% utspädning av formalin utnyttjas som innehåller 10% till 15% av metanol som en stabilisator för att förhindra polymerisation, liksom myrsyra, andra aldehyder, och ketoner . Ofta lagras vävnaden i denna fixativ för längre tid före inbäddning. Resultatet kan vara autolys (beroende på tiden mellan excision och fixering), och överdriven bildandet av metylenblått broar på grund av överfixering. Formaldehydfixering inducerar förändringar i den tertiära strukturen av proteiner genom bildandet av intra-och Inter-molekylär metylenblått broar10. Icke-proteinhaltiga cellkomponenter som nukleinsyror, kolhydrater och lipider fixeras inte direkt, utan immobiliseras i det tredimensionella protein nätverket. För en lyckad märkning måste metylenobligationer brytas för att avslöja epitoper i processen för antigen hämtning. Detta åstadkoms genom upphettning av vävnads sektioner monterade på Mikroskop glas i en lämplig värmeinducerad antigen hämtningsbuffert (HIER buffert)11. Vår tidigare studie analyserade påverkan av pH och temperatur av HIER buffertar på detektion av netto komponenter i paraffinized vävnad, och det konstaterades att framgångsrik vävnad förbehandling för en komponent ofta är suboptimala för en andra komponent8.
Under tiden har det visat sig att upphettning av vävnaden till 70 ° c i HIER buffert vid ett pH på 9 är en bra kompromiss för många netto komponenter och kommer att behålla god vävnad bevarande, som ofta äventyras vid högre temperaturer. Det föreslås att den hämtningstid som anges som utgångspunkt ska användas, men särskilt med arkivexemplar av okända fixeringsparametrar kan färgintensiteten vara otillfredsställande. I detta fall kan förlängning av eller högre temperatur under hämtnings proceduren förbättra Färgnings effektiviteten. Detta kan också påverka Histon 2b-färgning av den IGY-antikropp som används i vårt protokoll. Som visas i figur 1, dekondenserad kromatin finns i neutrofiler som genomgår Netos samt i nät fläckar mycket starkare med denna antikropp jämfört med kromatin i vilande neutrofiler. Detta beror förmodligen på begränsad tillgång till 180 kDa IgY molekylen till kompakta kärnor och kan variera efter ökad epitop återhämtning. Detta kan intensifiera bindande effektivitet även i områden med kondenserad kromatin, vilket kommer att resultera i starkare fluorescens i normala kärnor av neutrofiler och andra celler. Skillnaden i infärgnings effektivitet mellan neutrofiler som genomgår Netos och icke-stimulerade neutrofiler kan vara mindre uttalad än den som avbildas i figur 1. Områden med netto bildning skulle fortfarande identifieras genom en samtidig lokalisering av NE, H2B och DNA.
Fixeringsproceduren kan också inducera betydande autofluorescence av vävnaden, främst i den blåaktiga/grönaktiga delen av spektrumet. Det är viktigt att undvika det mesta av denna autofluorescence genom att använda adekvata smala bandpass fluorescensfilter set (Wide-fält) eller detektor inställningar (konfokal) som matchar utsläpp maximalt av fluorkrom används med blå excitation, e.g., Cy2, AlexaFluor 488 i extrema fall av autofluorescence bör den blåaktiga/grönaktiga delen av spektrumet undvikas. I stället kan fluorescens-signaler upptäckas lättare i den avlägsna röda delen av spektrumet (t. ex. sekundära antikroppar kopplade till CY 5 eller AlexaFluor 635), men detta kräver filterless svartvita kameror eller konfokala Mikroskop. Eftersom det mänskliga ögat är ganska okänsligt bortom 600 Nm, mycket röda fluorescens signaler kan knappast upptäckas med hjälp av oculars. I vilket fall som helst är det viktigt att använda negativa kontroller (t. ex. icke-Immunsera/isotype-kontroller i stället för primära antikroppar eller utelämna primära antikroppar) för att fastställa lämpliga exponeringstider eller detekterings inställningar.
Vävnadsdelar på 1 − 2 μm kan analyseras med brett fält Mikroskop med hjälp av 10X eller 20x mål. Dessa linser ger ett stort fokaldjup, så (nästan) hela vävnaden avsnitt kommer att vara i fokus. Detta kan användas för att snabbt Skanna vävnad sektioner för områden av netto bildning om de är tillräckligt stora (som i figur 1). De gröna (NE), röda (H2B) och blåa (DNA) kanalernas samlokalisering ger en vit färgning som anger områden med netto bildning (figur 1G). För högre förstoringar, konfokala eller wide-fält Mikroskop med deconvolution är nödvändiga. Figur 2 visar detaljer om humant blindtarmsinflammation preparat som också används för figur 1. I figur 2Alokaliserar Ne till små prickar (granulat), men en stor del är extracellulära, ofta bildar ränder som ÖVERLAPPAR med H2B (figur 2b) och DNA (figur 2C). Denna colocalization resulterar i en vitaktig overlay som indikerar nät (figur 2D). Ett mycket liknande mönster finns i lung delen av en mus infekterad med M. tuberkulos (figur 3).
Exemplaren presenteras här kännetecknas av områden med en hög grad av netto bildning som kan identifieras även vid låg förstoring. Beroende på vävnad densitet och respektive stimulans, kan netto bildningen vara mycket mindre uttalad, ner till netto bildningen av små grupper av neutrofiler (för ett exempel i Myocarditis, se en tidigare publikation12). Man tror att detta protokoll kommer att bidra till att främja mer forskning om nät i vävnad och förhoppningsvis stöd för att reda ut okända roller av nät i bildandet eller förebyggande av sjukdomar.
The authors have nothing to disclose.
Författarna har inget att avslöja.
bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
embedding molds | Sakura | 4162 | |
embedding station | Microm | AP280 | |
ethanol | Roth | 9065.4 | |
filter paper, rolled | OCB | ||
forceps | Dumont | 7a | |
glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
glycerol | Roth | 3783.1 | |
HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
normal donkey serum | Merck | S30 | |
PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
scalpel | Braun | Fig.22 | |
Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
Tween 20 | Fluka | 93773 | |
water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |