Nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETs) uyarılmış nötrofil granülositler tarafından oluşturulan üç boyutlu yapılardır. Son yıllarda NET’lerin çok çeşitli hastalıklara karıştıkları ortaya çıkmıştır. Dokudaki NET’lerin saptanması tanısal bir önemi olabilir, bu nedenle NET bileşenlerinin etiketlenmesi için standart protokoller gereklidir.
Lobulated çekirdeğinden dolayı polimorfonükleer lökosit (PMN) olarak da adlandırılan nötrofil granülositler en bol lökosit türüdür. Kemik iliğinde olgunlaşırlar ve periferik kana salınırlar ve yaklaşık 6−8 saat boyunca dolaşırlar; ancak, doku, onlar gün boyunca yaşayabilir. Endotel yoluyla diapedezis ile, onlar kan dolaşımını terk, dokulara girmek, ve kemotaktik gradyanlar aşağıdaki bir enfeksiyon sitesine doğru göç. Nötrofiller fagosittoz, degranülasyon ve nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NeTs) üretimi ile istilacı mikroorganizmalarla savaşabilirler. Bu protokol parafin gömülü dokuda NETs tespit etmek için yardımcı olacaktır. NET’ler, nükleer, granüler ve sitoplazmik bileşenlerin canlı (hayati NETosis) veya ölmekten (intihar netosisi) nötrofillerden serbest bırakılmasına yol açan NETosis adlı bir sürecin sonucudur. In vitro, NETs bulut benzeri yapılar oluşturur, hangi bir boşluk birkaç kat daha büyük bir alan kaplar lar ki, indi hücrelerin birkaç kat daha büyük. NETs omurgası kromatin, hangi protein ve peptidler granül ve sitoplazma kaynaklanan bir seçim bağlı olduğu. Böylece, NET’lerin bakteriler, mantarlar, virüsler ve parazitler de dahil olmak üzere çeşitli patojenleri yakalayıp etkisiz hale getirebilmeleri için yüksek yerel toksik bileşikler konsantrasyonu korunurken, son derece aktif NET bileşenlerinin difüzyonu komşu doku sınırlıdır. Bununla birlikte, son yıllarda, nets, bolca üretilen veya yetersiz temizlenmiş, kanser otoimmün hastalıklararasında değişen patolojik potansiyele sahip olduğu ortaya çıkmıştır. Bu nedenle doku örneklerinde NET’lerin saptanması tanısal öneme sahip olabilir ve hastalıklı dokudaki NET’lerin saptanması hastaların tedavisini etkileyebilir. Parafin gömülü doku örnekleri patolojik analiziçin kullanılan standart örnek olduğundan, ticari olarak mevcut antikorlar kullanılarak parafin gömülü dokuda NET bileşenlerinin floresan boyanması için bir protokol oluşturulmuştur.
Nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETs) karmaşık üç boyutlu bir yapıya sahiptir. Yüksek çözünürlüklü tarama-elektron mikroskobik analizi, 15−20 nm (kromatin) çapı 15−20 nm (kromatin) olan ve muhtemelen yaklaşık 30 tanecikli ve sitoplazmik bir çeşitlemeden oluşan >25 nm küresel etki alanları ile çivilenmiş pürüzsüz liflerden oluştuğunu ortaya çıkardı. proteinler ve peptidler1,2. İzole nötrofillerden in vitro olarak üretildiğinde, NET’ler iki veya daha fazla bileşeninin immünoresans (örn. histones ve nötrofil elastaz [NE]) ile boyanması ile tanımlanabilir. Uyarılmamış polimorfonükleer lökositlerde (PMN), histones sadece çekirdekte bulunurken, NE granüllerde bulunur. NETosis sırasında, NE çekirdek girer, buradahistones3,4işler. NET’ler, uyarılmamış nötrofillerde açıkça ayrılan bileşenlerin kolokalizasyonu ile karakterizedir. Şu anda net spesifik epitoponları sadece tespit eden antikorlar olmadığından (yani, naif nötrofillerle reaksiyona girme), NÖTROFIL proteinlerinin NÖTR’lerde kolokalizasyonunu saptamak NET’leri tanımlamanın tek yoludur.
Dokuda, NETs neredeyse konvansiyonel histolojik lekeler tarafından tespit edilebilir (örneğin, hematoksilin / eozin ile boyama tarafından [H & E], hangi yaygın bir soluk mavimsi karınca olarak NETs tasvir). Sadece çok bol olduğunda, NET NET H & E boyama ile ayırt edilebilir, trombositgibi 5. NET’ler tek başına yaygın olduğundan, doku yapısı en iyi şekilde korunmalıdır, bu nedenle dondurucu objeleri indükleme eğilimli kriyo-preparatlar dokudaki NET’lerin analizi için yetersizdir. Bunun yerine, formaldehit fiksasyonu ve parafin gömme doku da NET yapısını korumak için gösterilmiştir2. Parafin gömülü doku bölümlerinin (İmmüno-)histolojik incelemesi patolojik analiz için standart bir yöntemdir. Parafin bloklarında doku oda sıcaklığında bile korunduğundan (RT), günlük tanı çalışmalarından elde edilen doku örnekleri, yıllar önce hazırlanmış örneklerle karşılaştırılabilir, son zamanlarda ortaya çıkan sorular ve tekniklerle. Yakın zamana kadar dokudaki NET’ler tespit edilmemiştir ve hastalıkların seyri sırasında NET oluşumu ve çıkarılmasının ayrıntılı analizi patogeneze yeni kavrayışlara yol açabilir. Parafin gömülü doku kullanımı arşiv malzemesi analizi sağlamak ve retrospektif çalışmalar yapmak için paha biçilmez bir avantaja sahiptir6. Inkar edilemez, bu faydaların bir bedeli vardır. Parafin içine gömmeden önce, doku formaldehit sabit, susuz ve 50 °C üzerinde ısıtılmış olmalıdır. Bu işlemler doku otofloresans yanı sıra epitop maskeleme neden.
Fiksasyon yapılarını sınırlamak için fiksasyon süresi minimumda tutulmalıdır, böylece doku örneklerinin boyutu ~3 mm kalınlığında 20 mm x 30 mm’lik bir alanı geçmemelidir. Bu boyuttaki numuneler formaldehit te RT’de gece kuluçkadan sonra tamamen sabitlenir, ideal olarak doğrudan dehidratasyon ve parafin katıştırma ile takip edilir. Alternatif olarak, sabit numuneler arabellekte 1 veya 2 gün saklanabilir. İmmünofloresans çalışmaları için fiksatif, uygun bir tamponda çözünmüş paraformaldehitten (örn. fosfat tamponlu salin [PBS] veya Tris-tamponlu salin [TBS]) taze olarak hazırlanmalıdır. Fiksatif hazırlık sırasında, formik asit oluşumunu önlemek için sıcaklık 60 °C’nin altında tutulmalıdır. Patoloji için standart bir fiksatif olan formalin, metanol, diğer aldehitler, ketonlar ve formik asit içerdiğinden kullanılmamalıdır. Bu kirler artmış epitop maskeleme ve önemli doku otofloresanyol.
Başarılı immünetiketleme için, epitop maskeleme antijen alma denilen bir süreç içinde geri alılmalıdır. Doku bölümleri metilen köprüleri kırmak için inanılan uygun bir tampon, ısıtılır, bu yüzden epitops antikorlar için erişilebilir hale7. NETs tespiti için, ısı kaynaklı epitop alma (HIER) proteolitik enzimlerin kullanımı gibi diğer yöntemlere tercih edilir. Rutin olarak, parafin bölümlerinin immünetiketleme tek bir antikor ile birlikte peroksidaz etiketli sekonder antikor ile yapılır, çökeltici bir substrat ile tespit edilir. İmmünofluoresans ile karşılaştırıldığında, enzim tabanlı algılama yöntemleri substrat çökelti difüzyonu nedeniyle daha düşük bir mekansal çözünürlüğe sahip, ve genellikle, birden fazla antijen eşzamanlı algılamasınırlıdır 6.
Şu anda sadece NET’lere bağlanan antikorlar bulunmadığından, bu protokol iki proteini, nükleer histon 2B’yi ve granüllerde lokalize olan nötrofil elastazı etiketlemek için kullanılır. Uyarılmamış nötrofillerde bu proteinler ayrılır, ancak nötrofillerde NEToz ve NET’lerde birlikte lokalize olurlar. İki antijenin eşzamanlı olarak saptanması, farklı konaklarda yetiştirilen iki ana antikor ve farklı florokromlarla etiketlenmiş iki türe özgü ikincil antikorile elde edilebilir. Bu rapor, daha önce yayınlanmışprotokol 8’in bir standardizasyonudur ve insan ve minnet kökenli parafin gömülü dokuda NET bileşenlerini güvenilir bir şekilde lekeleyen iki adet ticari olarak mevcut antikorkombinasyonunu kullanmaktadır.
Patogenez 9 sırasında NET’lerinrolü ne kadar farkındalık ile, hasta veya deneysel hayvanlardan doku da tespit giderek önem kazanıyor. Parafin gömülü doku örnekleridiğer doku preparatlarına göre bir takım avantajlara sahiptir (örn. kriyopreserved örneklerin bölümleri). Parafin gömülü örneklerde doku koruma açıkça üstündür, ve bir kez gömülü, örnekler retrograd çalışmalar sağlayan, onlarca yıl korunur. Filigran yapıları olan NET’lerin tespiti için iyi bir numune koruma, morfolojik olarak benzeyen eserlere yol açabilen buz kristali oluşumu nedeniyle doku hasarına yatkın olan kriyokorunmuş malzeme kullanımını ekarte eden bir ön koşuldur. Ağları.
Optimal koruma için, deneysel hayvanlardan doku ölümden kısa bir süre sonra sabit olmalıdır, ideal perfüzyon ile, otolizin önlemek için. TBS veya PBS cevheri optimal gibi uygun bir tampon paraformaldehit fiksatif, taze hazırlanmış veya taze çözülmüş çözeltiler olarak. Bu kimyasal standart histoloji için kullanılan formalin preparatları aksine tanımlanır, ve daha az doku otofloresans indükler. Buna karşılık, insan dokusu genellikle eksizyondan sonra doğrudan sabit değildir ve fiksatif olarak, normalde polimerizasyonu önlemek için bir stabilizatör olarak metanol% 10 ila % 15 içeren formalin% 10 seyreltme kullanılır, yanı sıra formik asit, diğer aldehitler, ve ketonlar . Genellikle, doku katıştırma önce uzun süre bu fiksatif saklanır. Sonuç otolizin (eksizyon ve fiksasyon arasındaki zamana bağlı olarak) ve aşırı fiksasyon nedeniyle metilen köprülerin aşırı oluşumu olabilir. Formaldehit fiksasyonu proteinlerin üçüncül yapısında, moleküler ve moleküler metilen köprülerinin oluşumu ile değişikliklere neden olur10. Nükleik asitler, karbonhidratlar ve lipidler gibi proteinsiz hücre bileşenleri doğrudan sabit lenmez, üç boyutlu protein ağında hareketsiz kalır. Başarılı etiketleme için, metilen bağları antijen alma sürecinde epitoplar ortaya çıkarmak için kırık olması gerekir. Bu uygun bir ısı kaynaklı antijen alma tampon (HIER tampon)11mikroskop slaytlar üzerine monte doku bölümleri ısıtma ile gerçekleştirilir. Önceki çalışmamızda parafinize dokuda NET bileşenlerinin tespiti üzerinde pH ve HIER tamponların sıcaklığının etkisi analiz, ve bir bileşen için başarılı doku önlat genellikle ikinci bir bileşen için suboptimal olduğu bulundu8.
Bu arada, 9 pH’da HIER tamponunda 70 °C’ye kadar olan dokuyu ısıtmanın birçok NET bileşeni için iyi bir uzlaşma olduğu ve genellikle daha yüksek sıcaklıklarda tehlikeye giren iyi doku korumasını koruyacağı tespit edilmiştir. Başlangıç noktası olarak belirtilen alma süresinin kullanılması önerilmektedir, ancak özellikle bilinmeyen fiksasyon parametrelerinin arşiv örneklerinde boyama yoğunluğu tatmin edici olmayabilir. Bu durumda, alma işlemi sırasında sıcaklığın uzatılması veya daha yüksek olması boyama verimliliğini artırabilir. Bu aynı zamanda protokolümüzde kullanılan IgY antikor histon 2B boyama etkileyebilir. Şekil 1’degösterildiği gibi, nötrofillerde de yoğuşma kromatin, netosis geçiren nötrofillerde ve nets lekelerinde bu antikorla dinlenmiş nötrofillerde kromatine göre çok daha güçlü bulunabilir. Bu muhtemelen kompakt çekirdekleri için 180 kDa IgY molekülün sınırlı erişim nedeniyle ve artan epitop kurtarma sonra farklı olabilir. Bu yoğunlaştırılmış kromatin alanlarda bile bağlayıcı verimliliği yoğunlaştırmak olabilir, nötrofiller ve diğer hücrelerin normal çekirdeklerinde güçlü floresan neden olur. NETosis geçiren nötrofiller ile uyarılmayan nötrofiller arasındaki boyama verimi farkı Şekil 1’degösterilenden daha az belirgin olabilir. NET oluşum alanları hala NE, H2B ve DNA’nın birlikte lokalizasyonu ile belirlenecek.
Fiksasyon prosedürü aynı zamanda özellikle spektrumun mavimsi/yeşilimsi kısmında, dokunun önemli otofloresansneden olabilir. Mavi ekstrasyon ile kullanılan florokromemisyon maksimum maç yeterli dar bandpass floresan filtre setleri (geniş alan) veya dedektör ayarları (confocal) kullanarak bu otofloresans çoğu önlemek için önemlidir, örneğin, Cy2, Alexafluor 488. Aşırı otofloresan gibi durumlarda spektrumun mavimsi/yeşilimsi kısmından kaçınılmalıdır. Bunun yerine floresan sinyalleri spektrumun uzak kırmızı kısmında daha kolay tespit edilebilir (örneğin, Cy 5 veya Alexafluor 635 ile birleşen ikincil antikorlar), ancak bu filtresiz siyah/beyaz kameralar veya konfokal mikroskoplar gerektirir. İnsan gözü 600 nm’nin ötesinde oldukça duyarsız olduğundan, çok kırmızı floresan sinyalleri göz küleri kullanılarak tespit edilemez. Her halükarda, uygun maruz kalma sürelerini veya dedektör ayarlarını belirlemek için negatif kontroller (örn. primer antikorlar yerine immün sera/isotip kontrolleri veya primer antikorları atlayarak) kullanmak önemlidir.
1−2 μm doku kesitleri 10x veya 20x hedefleri kullanılarak geniş alan mikroskopları ile analiz edilebilir. Bu lensler büyük bir odak derinliği sağlamak, bu yüzden (neredeyse) tüm doku bölümü odak olacak. Bu, doku kesitlerinin yeterince büyük olması durumunda NET oluşum alanları için hızlı bir şekilde tarar (Şekil 1’dekigibi) kullanılabilir. Yeşil (NE), kırmızı (H2B) ve mavi (DNA) kanallarının birlikte lokalizasyonu NET oluşum alanlarını gösteren beyaz bir lekelenme yle sonuçlanır (Şekil 1G). Daha yüksek büyütmeler için dekonvolution içeren konfokal veya geniş alanlı mikroskoplar gereklidir. Şekil 2, Şekil 1için de kullanılan insan apandisit örneğinin ayrıntılarını göstermektedir. Şekil 2A’da,NE küçük nokta (granüller) lokalize olur, ancak büyük bir kısmı hücre dışıdır ve genellikle H2B (Şekil 2B) ve DNA ile örtüşen çizgiler oluşturur (Şekil 2C). Bu kolokalizasyon, NET’leri gösteren beyazımsı bir bindirmeyle sonuçlanır (Şekil 2D). Çok benzer bir desen M. tüberküloz ile enfekte bir farenin akciğer bölümünde bulunabilir(Şekil 3).
Burada sunulan örnekler, düşük büyütmede bile tespit edilebilen yüksek net formasyonderecesine sahip alanlar ile karakterize dir. Doku yoğunluğuna ve ilgili uyaranlara bağlı olarak NET oluşumu çok daha az belirgin olabilir, nötrofillerin küçük gruplarının NET oluşumuna kadar (miyokarditörneğin, bir önceki yayına bakın12). Bu protokolün dokudaki NET’ler üzerinde daha fazla araştırmanın teşvik edilmesine yardımcı olacağına ve hastalıkların oluşumunda veya önlenmesinde NET’lerin tanınmayan rollerinin çözülmesine yardımcı olacağına inanılmaktadır.
The authors have nothing to disclose.
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
embedding molds | Sakura | 4162 | |
embedding station | Microm | AP280 | |
ethanol | Roth | 9065.4 | |
filter paper, rolled | OCB | ||
forceps | Dumont | 7a | |
glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
glycerol | Roth | 3783.1 | |
HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
normal donkey serum | Merck | S30 | |
PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
scalpel | Braun | Fig.22 | |
Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
Tween 20 | Fluka | 93773 | |
water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |