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Biology

ऑटोफैगिक और प्रोटीसोमल फ्लक्स में दैनिक तालों को मापने

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60133
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Washington University School of Medicine

Summary

हम autophagy और माउस जिगर में proteasome के माध्यम से प्रोटीन catabolism में जैविक लय को मापने के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन.

Abstract

सेल अवांछित प्रोटीन और अन्य सामग्री रीसाइक्लिंग के लिए कई तरीकों को रोजगार, लाइसोसोमल और गैर lysosomal रास्ते सहित. मुख्य लाइसोसोम-निर्भर मार्ग को स्वभोजी कहा जाता है, जबकि प्रोटीन कैटाबोलिज्म के लिए प्राथमिक गैर-लाइसोसोमल विधि सर्वव्यापक-प्रोटेसोम प्रणाली है। मॉडल जीवों में हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि दोनों autophagy और सर्वव्यापक प्रणाली की गतिविधि दिन भर में स्थिर नहीं है, लेकिन बजाय एक दैनिक (circadian) ताल के अनुसार बदलता है. प्रोटीन कारोबार में जैविक लय को मापने की क्षमता कैसे सेलुलर गुणवत्ता नियंत्रण हासिल की है और ब्याज की विशिष्ट प्रोटीन की गतिशीलता को समझने के लिए समझने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम vivo में autophagic और proteasomal प्रवाह है कि प्रोटीन कारोबार के circadian घटक कब्जा मात्रा के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हमारे प्रोटोकॉल माउस से निपटने के लिए विवरण शामिल, ऊतक प्रसंस्करण, प्रभाजन, और autophagic प्रवाह परिमाणीकरण शुरू सामग्री के रूप में माउस जिगर का उपयोग कर.

Introduction

Circadian लय जैविक समारोह है कि प्रकृति भर में स्पष्ट कर रहे हैं में दैनिक, उम्मीद के मुताबिक बदलाव को देखें. वे हर जैविक पैमाने पर मौजूद हैं, नींद जाग चक्र की तरह स्थूल व्यवहार से, जैव अणुओं की लयबद्ध बहुतायत की तरह आणविक घटना के लिए. हाल के वर्षों में, Circadian लय में अनुसंधान circadian ताल पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण हैं कि "घड़ी जीन" की खोज से बदल दिया गया है. घड़ी जीन नॉकआउट चूहों में अध्ययन इस तरह के चयापचय 1 के रूप में कोर सेलुलर प्रक्रियाओं के आयोजन में circadian लय के लिए एक केंद्रीय भूमिका से पता चलाहै. जिस तरह से circadian लय यह हो बनाने के बीच प्रोटीन catabolism के लिए एक अस्थायी संरचना प्रदान करके है.

हमारे सहित कई समूहों ने दिखाया है कि सेलुलर प्रोटीन कैटाबोलिज्म, ऑटोफैगी और सर्वव्यापक प्रणाली के लिए दो प्रमुख रास्ते, दैनिक लय2,3,4,5के अधीन हैं। स्वभोजी प्रोटीन कैटाबोलिज्म के लाइसोम-निर्भर हाथ का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें ब्याज के प्रोटीन या तो एक उपन्यास आशय (मैक्रोऑटोफैगी) के निर्माण के माध्यम से या प्रत्यक्ष स्थानांतरण के माध्यम से इस अपमानजनक अंग को वितरित किए जाते हैं। चैनल (चैपरोन मध्यस्थता autophagy)6| सर्वव्यापक प्रणाली मुख्य गैर-लाइसोमल मार्ग है, जहां प्रोटीन बहु-सबबीकृत होते हैं और फिर प्रोटीसोम में खिलाया जाता है, एक मैक्रोआण्विक निम्नीकरण मशीन जो कोशिकाद्रव्य और नाभिक में पाई जाती है7,8. ऑटोफैगिक और प्रोटीसोमल गतिविधि में ताल महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे संभवतः सेलुलर गृह व्यवस्था में एक भूमिका निभाते हैं। एक परिणाम के रूप में, यह एक मानकीकृत प्रक्रिया है कि प्रोटीन catabolism है कि पूर्व नैदानिक रोग मॉडल के साथ संगत है में दैनिक दोलनों का पता लगा सकते हैं मूल्यवान है.

यहाँ, हम माउस यकृत में ऑटोफैगिक फ्लक्स में दैनिक विभिन्नता की मात्रा निर्धारित करने के लिए अपना प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो हमारी प्रयोगशाला3,9में कार्य के आधार के रूप में कार्य करता है। हमारी विधि एक "टर्नओवर परख"10के रूप में वर्गीकृत किया गया है, एक प्रोटीओलिटिक गतिविधि (या प्रवाह) को मापने के लिए कई समूहों द्वारा इस्तेमाल किया दृष्टिकोण. इस दृष्टिकोण में, लाइसोसोम या प्रोटेसोम के लिए विशिष्ट प्रोटीज़ अवरोधक चूहों को प्रशासित किए जाते हैं और फिर ऊतक के नमूने एक निश्चित समय अंतराल के बाद प्राप्त किए जाते हैं। समानांतर में, ऊतक के नमूने चूहों से प्राप्त कर रहे हैं शर्म इंजेक्शन के अधीन. ऊतक के नमूने homogenized और फिर जैव रासायनिक lysosome समृद्ध और साइटोप्लाज्मिक भिन्न प्राप्त करने के लिए अलग कर रहे हैं। इन अंशों तो मैक्रोऑटोफैगी मार्करों (LC3b और p62) या proteasomal substrates (पॉली-सबबक्टिनाइज्ड प्रोटीन) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर पश्चिमी blotting के माध्यम से समानांतर में विश्लेषण कर रहे हैं। समय के साथ, प्रोटीज़ अवरोधकों के साथ इंजेक्शन जानवरों प्रोटीन है कि आम तौर पर पुनर्नवीनीकरण किया गया होगा जमा. नतीजतन, कारोबार की दर protease-inhibitor इलाज नमूनों में मार्कर प्रोटीन की बहुतायत की तुलना द्वारा sham-treated नमूनों के लिए inferred है. दिन भर में निश्चित समय अंतराल पर इस विधि को दोहराने से प्रोटीओलिसिस में सर्कैडियन विविधताओं का पुनर्निर्माण करना संभव है (चित्र 1क)।

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Protocol

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल सेंट लुइस पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) में वाशिंगटन विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था.

1. माउस आवास और प्रायोगिक डिजाइन

  1. प्रोटीन कारोबार में दैनिक लय का पता लगाने के लिए, घर चूहों (पुरुष या महिला C57BL/6J, 4 "8 सप्ताह पुराने, 20 डिग्री 25 ग्राम) के तहत मानक 12 एच प्रकाश / जानवरों पर जोर देने से बचने के लिए, उपयोग करने से पहले सुविधा में कम से कम एक सप्ताह के लिए acclimate चूहों और एकल आवास से बचने के लिए. यह साबित करने के लिए कि प्रोटीन कैटाबोलिज्म में लय वास्तव में सर्कैडियन हैं (यानी, जानवर की आंतरिक जैविक घड़ी द्वारा संचालित), लगातार अंधेरे परिस्थितियों में घर चूहों, exogenous प्रकाश के लिए चूहों को उजागर करने से बचने के लिए देखभाल करने के लिए।
    नोट: Circadian ताल प्रयोगों के लिए माउस आवास के बारे में जानकारी के लिए निम्नलिखित संदर्भ11देखें.
  2. प्रत्येक समय बिंदु के लिए, तीन चूहों को शर्म नियंत्रण के रूप में आवंटित करना और प्रत्येक प्रकार के प्रोटीज़ अवरोधक के लिए कम से कम तीन चूहों का उपयोग किया जाता है (ऑटोफैगिक फ्रलक्स के लिए लीपेप्टिन और प्रोटीसोमल फ्रलक्स माप के लिए बोर्टेजोमिब)। ऊतक के नमूने प्राप्त करने के लिए दिन भर में 4 एच अंतराल पर समान रूप से छह समय अंक के लिए योजना बनाएँ।
    नोट: एक 24 ज, फॉस्फेट-बफर ेड नमकीन (पीबीएस), ल्यूपेप्टिन, और बोर्टेजोमीब के साथ 6 समय बिंदु प्रयोग में कुल 54 चूहों (3 उपचार x 3 उपचार x 6 समय अंक) की आवश्यकता होगी।

2. Homogenization समाधान की तैयारी, अवरोधक स्टॉक समाधान, और माउस लिवर संग्रह के लिए Vials

  1. ताजा homogenization बफर (एचबी) तैयार है और बर्फ पर रखने के लिए: 10 एमएम Tris-HCl पीएच 7.5, 250 एमएम सुक्रोज, 5 एमएम EDTA पीएच 8.0, और 1 protease inhibitor गोली प्रति 100 एमएल.
    नोट: लगभग 10 एमएल एचबी प्रति माउस की जरूरत है.
  2. जैविक नमूनों के डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए कच्चे होमोगेनेट को पकड़ने के लिए 15 एमएल शंकु ट्यूब की आवश्यकता होती है, एक 15 एमएल ट्यूब को परमाणु महाराष् ट्रीयस्ट के बाद, दो 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब 3,000 x g और 20,000 x g छेड रखने के लिए एक 15 एमएल की ट्यूब की आवश्यकता होती है। सामग्री, क्रमशः, और एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब कोशिका द्रव्यीय अंश पकड़ करने के लिए। कच्चे होमोजेनेट के लिए इरादा प्रत्येक ट्यूब के लिए ठंड एचबी के 7 एमएल जोड़ें और बर्फ पर रहते हैं।
  3. बाँझ पीबीएस में ल्यूपेटिन हेमी-सल्फेट का 2 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान तैयार करें। इसके अलावा डाइमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में बोर्टेजोमिब का 50 मिलीग्राम/एमएल घोल तैयार करें। अलीकोट और -80 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान।

3. प्रोटीज़ अवरोधक प्रशासन

  1. Thaw leupeptin (2 mg/mL) और bortezomib (50 mg/mL) शेयर समाधान कमरे के तापमान के लिए 15 मिनट पहले हर समय बिंदु से पहले. ल्यूपटिन स्टॉक इंजेक्शन के लिए तैयार है। बाँझ पीबीएस में बोर्टेजोमीब को 50 ग्राम/एमएल कार्य समाधान देने के लिए पतला करें।
    नोट: Bortezomib प्रकाश संवेदनशील है, तो उपयोग जब तक प्रकाश से काम कर रहे शेयर की रक्षा.
  2. चूहों वजन और "शाम" पीबीएस (0.5 एमएल), ल्यूपेटिन (40 मिलीग्राम/किलोग्राम), या bortezomib (1.6 डिग्री/ चूहों को उचित रूप से चिह्नित पिंजरों को वापस करें जो उन्हें प्राप्त इंजेक्शन के प्रकार द्वारा समूहीकृत किया गया था। चूहों का इलाज या एक मानकीकृत तालिका में हेरफेर कर रहे हैं समय रिकॉर्ड (पूरक फ़ाइल देखें "नमूना डेटा").
    नोट: एक खुराक कैलकुलेटर पूरक फ़ाइल "नमूना डेटा"में एक सहायता के रूप में शामिल किया गया है। यह इंजेक्शन तेजी से और एक ही क्रम में समय बिंदु से timepoint करने के लिए परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है.

4. ऊतक अधिग्रहण और भंडारण

  1. इंजेक्शन के दो घंटे बाद, संस्थानीय अनुमोदित IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार एक समय में चूहों को एक इच्छा मृत्युशय करें। उदाहरण के लिए, चूहों को एनेस्थेटाइज़ करें तो गर्भाशय ग्रीवा की अव्यवस्था से इच्छामृत्यु करें। इच्छामृत्यु के तुरंत बाद विच्छेदन कदम पर आगे बढ़ें।
    नोट: एक प्रेक्षणीय पलटा बिना सामने पंजे pinching द्वारा गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से पहले पूरा संज्ञाहरण सुनिश्चित करें।
  2. माउस के अधर पेट पर Metzenbaum कैंची के साथ एक 1.5 से 2.0 सेमी चीरा बनाकर जिगर के बाएं पालि निकालें। जिगर के बाएं पालि को बाहरी और सर्जिकल कैंची के साथ इसे उत्पादित करें। एक उचित लेबल 15 एमएल शंकु ट्यूब में बर्फ ठंडा एचबी के 7 एमएल में जिगर के नमूने को जलमग्न। प्रसंस्करण के दौरान बर्फ पर नमूना रखें.
    नोट: नमूने बर्फ पर या आगे बढ़ने से पहले रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। यदि मैक्रोटोफैगी और प्रोटीसोमल गतिविधि के मानक मार्कर केवल लक्षित readouts हैं, जिगर के नमूने तरल नाइट्रोजन में जमे हुए फ्लैश किया जा सकता है और बाद में प्रसंस्करण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. गिरावट के अन्य लक्ष्यों की जांच करने के लिए (उदा., proteomics के माध्यम से), ठंड के बिना नमूने की प्रक्रिया.
  3. सभी नमूनों का अधिग्रहण कर रहे हैं जब तक अगले माउस इच्छामृत्यु और विच्छेदन के लिए आगे बढ़ें। प्रक्रिया चूहों एक ही समूह के क्रम में वे इंजेक्शन और इस चरण की अवधि रिकॉर्ड किया गया (पूरक फ़ाइल "नमूना डेटा देखें"). प्रत्येक माउस इंजेक्शन inhibitors के लिए जोखिम समय में अंतर को सीमित करने के लिए 5 मिनट के तहत में संसाधित किया जाना चाहिए.

5. जिगर के नमूनों की जैव रासायनिक भिन्नण

नोट: चित्र 1B भिन्नीकरण योजना को दर्शाता है।

  1. प्रत्येक जिगर का नमूना और एचबी के 7 एमएल को 15 एमएल क्षमता वाले होमोजेनाइज़र में स्थानांतरित करें। ढीला पिस्टन के 10 स्ट्रोक और तंग पिस्टन के 15 स्ट्रोक के साथ नमूना Homogenize. परिणामी अपरिष्कृत समरूप को 15 एमएल शंकु तदी पर लौटाइए। दोहराएँ जब तक सभी जिगर के नमूने homogenized किया गया है.
  2. स्पिन कच्चे तेल homogenate नमूने 700 x ग्राम के लिए 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गोली नाभिक और मलबे के लिए. परमाणुोत्तर सुपरनेटेंट ( एस 1)के शीर्ष 4 एमएल को एक ताजा 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार ब्रैडफोर्ड या biconinic एसिड (BCA) assays का उपयोग कर अंश S1 के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण. अगले सभी नमूनों की सांद्रता के बराबर 2.1 mg/mL या वांछित एकाग्रता के लिए ताजा एचबी जोड़ने के द्वारा S1 जहां जरूरत है. सामान्यीकृत नमूने हैं "कुल प्रोटीन" (टोट) अंश. डाउनस्ट्रीम विश्लेषणात्मक उद्देश्यों और गुणवत्ता में सुधार के लिए, टोट अंश के अलीकोट 500 डिग्री सेल्सियस और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  4. शेष टोट अंश का 1.5 एमएल एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर स्पिन करें। परिणामी सुपरनेटेंट ( एस2) का 1 एमएल एक ताजा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर सेट करें।
  5. शेष सुपरनेंट को प्रेरित करें और 3,000 x ग्राम गोली (3KP) को 1.5 एमएल ठंड एचबी के साथ दो बार धो लें। 3KP गोली -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखी संग्रहीत किया जा सकता है अगर बहाव proteomics प्रत्याशित हैं. यदि केवल पश्चिमी सोख्ता का अनुमान है, तो सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीऐक्लेमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (एसडीएस-पेज) नमूना बफर (सामग्री की तालिका)के 200 डिग्री एल में 3KP गोली को फिर से भर दें और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर S2 अंश स्पिन। परिणामी अधिनांत (एस 3) को एक ताजा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। S3 कोशिकाद्रव्यी(साइटो) अंश है। एसडीएस-पेज के लिए, Cyto अंश के 150 डिग्री एल 4x एसडीएस-पेज नमूना बफर के 50 डिग्री एल के साथ गठबंधन और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर फोड़ा।
  7. 20,000 x ग्राम गोली (20KP) से शेष supernatant को प्रेरित करें और 1.5 एमएल ठंड एचबी के साथ दो बार धो लें। 20KP गोली -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखी संग्रहीत किया जा सकता है अगर बहाव proteomics प्रत्याशित हैं. यदि केवल पश्चिमी सोख्ता का अनुमान है, तो एसडीएस-पेज नमूना बफर के 100 डिग्री एल में 20KP गोली को फिर से भर लें और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबाल ें।

6. पश्चिमी ब्लॉटिंग रीडआउट

  1. पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से मैक्रो ऑटोफैगिक और प्रोटीसोमल फ्रलक्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए, शुद्ध जीएसटी-एलसी3 बी (2 डिग्री जी/एमएल), p62-His6 (2 g/mL), और Lys48 लिंक्ड पॉलीयूबिक्विटिन (K48-Ub, 50 g/ 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबलने के बाद, aliquot और भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  2. SDS-PAGE के समय, क्रमिक रूप से 1x एसडीएस-पेज नमूना बफर में 1:3 diluting द्वारा मानक प्रोटीन मिश्रण के एक 6-बिंदु मानक वक्र उत्पन्न करते हैं. एक 26 अच्छी तरह से 4 $12% एसडीएस-पेज मिडी-जेल पर प्रत्येक मानक वक्र नमूने के 10 $L लोड, prestained प्रोटीन मानकों के बाद(सामग्री की तालिका),एक वाणिज्यिक आणविक वजन मानक.
  3. autophagic प्रवाह को मापने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से 3KP नमूना के 12 डिग्री एल लोड.
    नोट: यह मानते हुए कि शर्म, bortezomib, और ल्यूपीप्टिन उपचार किया गया और उपचार के प्रति 3 चूहों संभालने, हर बार बिंदु 9 नमूनों से मिलकर चाहिए. इसलिए, प्रत्येक मिडी-जेल 2 समय अंक प्लस मानक वक्र को समायोजित कर सकते हैं और एक ठेठ समय श्रृंखला प्रयोग readout के लिए 3 midi-gels की आवश्यकता होगी.
  4. प्रोटीसोमल फ्रलक्स को मापने के लिए, प्रत्येक कुएं में 12 डिग्री सेल्सियस Cyto अंश लोड करें।
  5. एसडीएस-पेज द्वारा अलग प्रोटीन नमूने और मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली के लिए स्थानांतरण। यदि LC3b के लिए पश्चिमी blotting प्रत्याशित है, हस्तांतरण जैल का उपयोग कर 20% मेथनॉल युक्त हस्तांतरण बफर. अन्यथा, 10% मेथनॉल युक्त हस्तांतरण बफर का उपयोग करें क्योंकि यह उच्च आणविक वजन प्रोटीन प्रजातियों के अधिक कुशल हस्तांतरण को सक्षम करेगा।
  6. मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन करें. मैक्रोऑटोफैगिक फ्रलक्स का विश्लेषण करने के लिए, एंटी-पी62 या एंटी-एलसी3बी एंटीबॉडी (1:1,000) के साथ 3KP नमूनों वाले ब्लॉट झिल्ली रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर। प्रोटीसोमल फ्रलक्स का विश्लेषण करने के लिए, एंटी-लीस48 विशिष्ट पॉलीयूबिक्विटिन (1:1,000) के साथ साइटो नमूनों वाले ब्लॉट झिल्ली रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  7. मानक माध्यमिक एंटीबॉडी और इमेजिंग उपकरणों का उपयोग कर छवि पश्चिमी blots. छवि सभी झिल्ली है कि एक दिया समय श्रृंखला प्रयोग एक साथ गठन.

7. डेटा विश्लेषण

नोट: पूरक फ़ाइल "नमूना डेटा"देखें |

  1. पश्चिमी धब्बा नमूनों पर densitometry प्रदर्शन करने के लिए, मानक ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर का उपयोगकरें, छवि स्टूडियो, या वैकल्पिक ImageJ.
  2. दोनों मानक वक्र और प्रयोगात्मक नमूने के लिए ब्याज के बैंड पर densitometric माप प्रदर्शन करते हैं. छवि स्टूडियो में, एक उदाहरण के रूप में p62 का उपयोग कर, तल पर प्रोटीन मोनोमर शामिल एक लंबे आयत आकर्षित और झिल्ली के शीर्ष करने के लिए विस्तार. की प्रतिलिपि बनाएँ, चिपकाएँ, और शेष नमूनों के लिए आयत ले जाएँ। यह मात्रा नमूने के बीच संगत मात्रा के लिए इस्तेमाल किया आयत रखने के लिए महत्वपूर्ण है.
  3. विश्लेषण विंडो के नीचे दाईं ओर रिपोर्ट दबाकर और स्प्रेडशीट लॉन्च करके स्प्रेडशीट के लिए परिमाणीकरण सहेजें.
  4. क्रमिक रूप से पतला मानक नमूना का उपयोग स्प्रेडशीट के साथ एक densitometric मानक वक्र उत्पन्न और एक सबसे अच्छा फिट मानक वक्र समीकरण प्राप्त करने के लिए रैखिक या बहुपद प्रतिगमन या तो का उपयोग करें. इस समीकरण का उपयोग करके, प्रयोगात्मक नमूनों में p62, LC3b-II या Lys48-पॉली Ub की मात्रा को अतिरिक्त करें।
  5. फ्लक्स माप प्राप्त करने के लिए, एक ही समय बिंदु से पीबीएस नमूनों के औसत मान से प्रत्येक अवरोधक-उपचारित नमूने की extrapolated प्रोटीन मात्रा घटाना (पूरक फ़ाइल "नमूना डेटा देखें"देखें)।
  6. 1-वे ANOVA का उपयोग कर प्रोटीन कारोबार में लौकिक भिन्नता के सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन करें। यह मानक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है.

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Representative Results

प्रतिनिधि आंकड़े 2A,Bमें प्रस्तुत किए गए हैं, और इन आंकड़ों का परिमाणीकरण चित्र 2C,D में प्रदान किया गया है (यह भी पूरक फ़ाइल "नमूना डेटा"देखें) में प्रदान किए जाते हैं। सरलता के लिए, हमने चित्र 2 में लोडिंग नियंत्रण नहीं दर्शाया है लेकिन इन्हें समानांतर रूप से प्राप्त किया जाना चाहिए। आमतौर पर, जेड-एक्टिन के खिलाफ पश्चिमी दाग इस उद्देश्य के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन कुल प्रोटीन दाग (जैसे Ponceau एस के रूप में) पर्याप्त होगा. किसी भी समय बिंदु पर autophagic प्रवाह के लिए प्राथमिक readout मैक्रो ऑटोफैगी विशिष्ट मार्करों की मात्रा में अंतर है (p62 या LC3b-II) ल्यूपीप्टिन के बीच इलाज बनाम छाया नमूने में lysosome समृद्ध 3KP अंश 2 से विभाजित (की संख्या प्रोटीज़ अवरोधक और ऊतक फसल के इंजेक्शन के बीच घंटे) इसी तरह के डेटा 20KP नमूने से प्राप्त किया जा सकता है, जो भी lysosome समृद्ध कर रहे हैं, लेकिन माउस जिगर में हमारा अनुभव यह है कि संकेत के अधिकांश 3KP अंश में अलग. आमतौर पर, परिणाम ों को उस माध्य के लिए सामान्यीकृत किया जाता है जो स्वतंत्र प्रयोगों में तुलना को सरल बनाता है (चित्र 2C,D)। प्रोटीसोमल कारोबार के लिए प्राथमिक रीडआउट लिस48-पॉलीयुबिक्विटिनेट प्रोटीन की मात्रा में बिल्टोसोलिक में बोर्टेजोमिब-उपचार बनाम शर्मीले नमूनों के बीच अंतर है ("साइटो") अंश 2 से विभाजित है। च62 मैक्रो ऑटोफैगी और प्रोटीसोम3दोनों का लक्ष्य हो सकता है, इसलिए प्रोटीसोमल फ्लक्स के लिए एक वैकल्पिक मार्कर 3KP अंश में p62 सामग्री +/- bortezomib में परिवर्तन है (नमूना डेटादेखें )। हालांकि, हम पाते हैं कि यह मार्कर Lys48-polyubiquitinated प्रोटीन की तुलना में कम मजबूत है और सबसे अच्छा सहायक डेटा के रूप में प्रयोग किया जाता है।

Figure 1
चित्र 1: प्रयोग चरण और नमूना संसाधन. (ए) माउस यकृत में ऑटोफैगिक और प्रोटेसोमल गतिविधि (प्रवाह) में दैनिक लय को मापने के लिए एक विशिष्ट समय श्रृंखला प्रयोग का स्केमेटिक। (ख)पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए लाइसोसोम समृद्ध और साइटोसोलिक यकृत प्रोटीन भिन्न प्राप्त करने के लिए भिन्नीकरण योजना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: फ्लक्स के नमूना प्रयोगात्मक परिणाम. माउस यकृत में ऑटोफैगिक फ्लक्स (ए) और प्रोटीसोमल फ्लक्स (बी) में दैनिक लय को मापने के लिए एक प्रतिनिधि समय श्रृंखला प्रयोग से पश्चिमी धब्बा। ध्यान दें कि ल्यूपप्टिन उपचारित परिस्थितियों के तहत, लगभग 50 केडीए से एसडीएस-स्थिर परिसरों में लगभग 50 केडीए पर मोनोमेरिक रूप से लेकर सीढ़ी के रूप में p62 रन करता है। दिन के समय zeitgeber समय की इकाइयों में चित्रित कर रहे हैं (जेडटी), जहां $T0 पर रोशनी का प्रतिनिधित्व करता है और $T12 बंद रोशनी का प्रतिनिधित्व करता है. अवलोकन बार है कि बंद रोशनी के दौरान गिर छायांकित काले हैं. (सी,डी) इन आंकड़ों का परिमाणीकरण। प्रत्येक डेटा बिंदु माध्य ज़् (द र् 3) का प्रतिनिधित्व करता है। एक तरह से ANOVA के माध्यम से सांख्यिकीय महत्व चित्रित किया गया है. कृपया इन डेटा के एक सारणीबद्ध प्रतिनिधित्व के लिए पूरक फ़ाइल "नमूना डेटा" देखें. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल: नमूना डेटा. डेन्सिटोमेट्रिक डेटा का प्रयोगशाला विश्लेषण और बाद में सांख्यिकीय विश्लेषण। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हमारे प्रोटोकॉल आमतौर पर उपलब्ध आणविक जीव विज्ञान उपकरण का उपयोग कर चूहों में प्रोटीन कारोबार में जैविक लय को मापने के एक तकनीकी रूप से सरल साधन का वर्णन करता है. समय श्रृंखला प्रयोगों की लंबाई और शामिल जैविक नमूनों की संख्या के कारण, यह कैसे चूहों इंजेक्शन हैं के बारे में पूरे प्रयोग भर में संगत होना महत्वपूर्ण है, ऊतक अधिग्रहण के समय और जैव रासायनिक प्रसंस्करण के नमूने. इंजेक्शन, इच्छामृत्यु, और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था कदम एक पूर्ण पैमाने पर प्रयोग शुरू करने से पहले ऑपरेटर अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है. यह एक एकल ऑपरेटर के लिए सबसे अच्छा है के बाद से विभिन्न व्यक्तियों अलग गति पर विच्छेदन सभी ऊतक विच्छेदन प्रदर्शन करने के लिए, लेकिन अगर यह अव्यवहार्य है यह प्रोटीज़ अवरोधक इंजेक्शन और ऊतक फसल के बीच समय को बढ़ाने के लिए सार्थक हो सकता है 2 ज से 3 या 4 ज ( बशर्ते यह लगातार समय अंक भर में किया जाता है).

समस्या निवारण के लिए सामान्य कारणों में जैविक प्रतिकृति नमूनों के बीच प्रवाह में परिवर्तनशीलता, और खराब पश्चिमी धब्बा गुणवत्ता शामिल है। नमूना परिवर्तनशीलता के बारे में, यह अलग विच्छेदन गति या अनुभव के स्तर के साथ कई ऑपरेटरों के उपयोग के कारण हो सकता है. यह अभ्यास प्रयोगों को क्रियान्वित करके कम किया जा सकता है जब तक औसत विच्छेदन बार माउस प्रति 5 मिनट से कम कर रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, एक एकल ऑपरेटर विच्छेदन बाहर ले जाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पश्चिमी धब्बों पर उच्च पृष्ठभूमि असमान स्थानांतरण, अपर्याप्त अवरुद्ध, कम गुणवत्ता वाले प्राथमिक एंटीबॉडी, या अपर्याप्त धोने के कदम से उत्पन्न हो सकती है। सबसे अच्छा परिणाम एसडीएस-पेज अलग प्रोटीन के नमूनों के रात भर गीला हस्तांतरण द्वारा प्राप्त कर रहे हैं PVDF में 10 डिग्री 20% मेथनॉल हस्तांतरण बफर युक्त, अवरुद्ध करने के लिए 10% गैर वसा शुष्क दूध का उपयोग कर, और कदम के बीच व्यापक धोने (3x 10 मिनट न्यूनतम एक यांत्रिक रॉकर पर).

इस तकनीक की कई सीमाएँ हैं। सबसे पहले, प्रोटोकॉल वर्णित जानवरों की महत्वपूर्ण संख्या की आवश्यकता है और इसलिए संसाधन गहन है. जबकि एक न्यूनतम समय श्रृंखला प्रयोग 24 एच तक फैला है, कम से कम 2 चक्र के प्रयोगों की पुष्टि है कि दैनिक परिवर्तन प्रोटीन कारोबार में मनाया जा रहा है reproduible हैं, और आवधिकता और चरण 12 की तरह ताल विशेषताओं का आकलन करने के लिए आदर्श होते हैं . क्योंकि समय के बीच बीतना चाहिए जब protease inhibitors चूहों के लिए प्रशासित रहे हैं और समय नमूने काटा जाता है (प्रोटीओलिसिस के लक्ष्य ों जमा करने के लिए अनुमति देने के लिए), प्राप्त कारोबार माप एक 2 एच अंतराल पर एक औसत गतिविधि का प्रतिनिधित्व करते हैं बल्कि एक बिंदु अनुमान से. एक परिणाम के रूप में, इस परख प्रोटीन catabolism में गतिशील परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रदान कर सकते हैं संकल्प के लिए एक सीमा है. अंत में, इस प्रोटोकॉल माउस जिगर के लिए अनुकूलित है और जैव रासायनिक भिन्नण प्रक्रिया यहाँ प्रस्तुत की संभावना को कुशलतापूर्वक अन्य ऊतक प्रकार से lysosomes प्राप्त करने के लिए संशोधित करने की आवश्यकता होगी.

यह भी इस घटना के proteome व्यापक टिप्पणियों में सक्षम बनाता है कि autophagic प्रवाह में दैनिक लय को मापने के लिए पहली विधि है। इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों autoimmune रोग, कैंसर, और तीव्र संक्रमण सहित विभिन्न रोग मॉडल में proteolytic लय का विश्लेषण शामिल हैं। प्रमुख में इस विधि अन्य माउस अंगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और मानव नमूने, जो उच्च translational क्षमता के साथ एक रोमांचक भविष्य आवेदन का प्रतिनिधित्व करता है explanted.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम RO1HL135846 और एक बाल विकास संस्थान अनुदान (पीडी-II-2016-529) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4x SDS PAGE Sample Buffer Invitrogen Cat# NP0008
Bortezomib EMD Millipore Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7
Image Studio LICOR N/A
Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron Merck Millipore Ltd Cat# IPFL00010
K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb Cell Signaling Technology Cat#8081S; RRID:AB_10859893
LC3a Boston Biochem Cat# UL-430
LC3b antibody Novus Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146
LC3b antibody Cell Signaling Technology Cat#2775; RRID:AB_915950
Leupeptin Sigma Cat# L2884; CAS: 103476-89-7
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels Thermo Fisher Scientific Cat# WG1403BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermo Fisher Scientific Cat# NP0007
P62-his Novus Cat# NBP1-44490
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards Bio-Rad Cat# 1610373
Rabbit Anti-p62/SQSTM1 Millipore-Sigma Cat#P0067; RRID:AB_1841064
rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) Boston Biochem Cat# UC-230
SDS-PAGE Midi-size Gels Invitrogen Cat# WG1403
SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets Millipore-Sigma Cat# S8830

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References

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जीव विज्ञान अंक 151 कैटाबोलिज्म ऑटोफैगी सर्कैडियन लय सूजन मैक्रो ऑटोफैगी फ्रलक्स पश्चिमी समय बिंदु
ऑटोफैगिक और प्रोटीसोमल फ्लक्स में दैनिक तालों को मापने
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Ryzhikov, M., Eubanks, A., Haspel,… More

Ryzhikov, M., Eubanks, A., Haspel, J. A. Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux. J. Vis. Exp. (151), e60133, doi:10.3791/60133 (2019).

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