Summary
Protein katabolizmindeki biyolojik ritimleri otofaji ve fare karaciğerinde proteozom yoluyla ölçme protokolümüzü tanımlıyoruz.
Abstract
Hücreler istenmeyen proteinlerve diğer malzeme geri dönüşüm için çeşitli yöntemler kullanır, lysosomal ve non-lysosomal yollar da dahil olmak üzere. Protein katabolizmasının birincil lizozomal olmayan yöntemi ubikitin-proteozom sistemi iken, başlıca lizozom-bağımlı yol otofaji olarak adlandırılır. Model organizmalar üzerinde yapılan son çalışmalar, hem otofaji hem de ubikitin-proteozom sisteminin aktivitesinin gün boyunca sabit olmadığını, bunun yerine günlük (sirkadiyen) ritme göre değiştiğini göstermektedir. Protein cirosu biyolojik ritimleri ölçmek için yeteneği hücresel kalite kontrolü nasıl elde edilir anlamak ve ilgi belirli proteinlerin dinamiklerini anlamak için önemlidir. Burada protein cirosunun sirkadiyen bileşenini yakalayan otophagic ve proteasomal akı in vivo'nun ölçülmesi için standart laştırılmış bir protokol salıyoruz. Protokolümüz, fare işleme, doku işleme, fraksiyonve başlangıç malzemesi olarak fare karaciğeri kullanarak otofatik akı nicelliği için ayrıntıları içerir.
Introduction
Sirkadiyen ritimler, biyolojik fonksiyonda doğa boyunca belirgin olan günlük, öngörülebilir varyasyonları ifade eder. Her biyolojik ölçekte varolurlar, uyku-uyanıklık döngüleri gibi makroskopik davranışlardan biyomoleküllerin ritmik bolluğu gibi moleküler fenomenlere kadar. Son yıllarda sirkadiyen ritim ler üzerine yapılan araştırmalar, sirkadiyen ritim üretimi için kritik öneme sahip "saat genlerinin" keşfi ile dönüştürülmüştür. Saat gen nakavt farelerde çalışmalar metabolizma1gibi zamansal olarak organize çekirdek hücresel süreçler sirkadiyen ritimleri için merkezi bir rol ortaya koymuştur. Sirkadiyen ritimlerin bunu gerçekleştirme yolları arasında protein katabolizmine zamansal bir yapı vermek tir.
Bizim ki de dahil olmak üzere çeşitli gruplar göstermiştir ki hücresel protein katabolizma için iki ana caddeleri, otofaji ve ubikiquitin-proteozom sistemi, diurnal ritimleri tabidir2,3,4,5. Otofaji, protein katabolizmasının lizozom bağımlı kolunu temsil eder. kanal (şaperon aracılı otofaji)6. Ubikitin-proteozom sistemi ana non-lysozomal yoludur, proteinler poli-ubiquitinated ve daha sonra proteozom içine beslenen, bir makromoleküler degradatif makine sitoplazma ve çekirdek boyunca bulunan7,8. Otophagic ve proteazomal aktivite ritimleri büyük olasılıkla hücresel housekeeping bir rol oynamaktadır, çünkü önemlidir. Sonuç olarak, pre-klinik hastalık modelleri ile uyumlu protein katabolizma günlük salınımları tespit edebilir standart bir prosedür olması değerlidir.
Burada, bizim laboratuvar3,9çalışma için temel olarak hizmet vermiştir fare karaciğer, otophagic akı diurnal varyasyonları ölçmek için protokolümüzü sağlamak. Yöntemimiz bir "ciro tamsadı"10olarak sınıflandırılır, proteolitik aktivite (veya akı) ölçmek için çok sayıda grup tarafından kullanılan bir yaklaşım. Bu yaklaşımda farelere lizozom veya proteozomlara özgü proteaz inhibitörleri verilir ve sabit bir zaman aralığından sonra doku örnekleri alınır. Buna paralel olarak sahte enjeksiyona maruz kalan farelerden doku örnekleri alınır. Doku örnekleri homojenize edilir ve daha sonra biyokimyasal olarak ayrılabilmek için kemikozomla zenginleştirilmiş ve sitoplazmik fraksiyonlar elde edilir. Bu kesirler daha sonra makrootofji belirteçlerine (LC3b ve p62) özgü antikorlar veya proteazomal substratlar (poli-ubiquitinated protein) kullanılarak batı lekeleme yoluyla paralel olarak analiz edilir. Zamanla, proteaz inhibitörleri enjekte edilen hayvanlar normalde geri dönüştürülmüş olacak proteinleri birikir. Sonuç olarak, proteaz-inhibitör tedavi örneklerindeki marker proteinlerin bolluğu sahte tedavi edilmiş numunelerle karşılaştırılarak ciro oranı çıkarılır. Bu yöntemi gün içinde sabit zaman aralıklarında tekrarlayarak proteozizde sirkadiyen varyasyonları yeniden oluşturmak mümkündür (Şekil 1A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan protokol Washington Üniversitesi tarafından St. Louis Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Fare Muhafazası ve Deneysel Tasarımı
- Protein cirogünlük ritimleri tespit etmek için, ev fareleri (erkek veya kadın C57BL/6J, 4−8 haftalık, 20−25 g) standart 12 saat ışık / karanlık döngüleri altında gıda reklam libitumsağlanan . Hayvanları strese girmemek için, fareleri kullanmadan önce tesiste en az bir hafta boyunca alıştırın ve tek bir muhafazadan kaçının. Protein katabolizma ritimleri gerçekten sirkadiyen olduğunu kanıtlamak için (yani, hayvanın iç biyolojik saat tarafından tahrik), sürekli karanlık koşullar altında ev fareler, eksojen ışığa fareler maruz önlemek için özen.
NOT: Sirkadiyen ritim deneyleri için fare gövdesi hakkında ayrıntılı bilgi için aşağıdaki referans11'ebakın. - Her zaman noktası için, sham kontrolleri ve proteaz inhibitörü kullanılan her tip için en az üç fare olarak üç fare ayırın (otophagic akı için löpeptin ve proteazomal akı ölçümleri için bortezomib). Doku örnekleri elde etmek için gündüz/gece döngüsü boyunca 4 saat aralıklarla eşit aralıklı altı zaman noktası için plan layın.
NOT: Fosfat tamponlu salin (PBS), löpeptin ve bortezomib ile 24 saat, 6 saat nokta deneyi toplam 54 fare gerektirir (tedavi başına 3 x 3 tedaviler x 6 zaman puanı).
2. Fare KaraciğerI Toplama için Homojenizasyon Çözeltisi, İnhibitör Stok Çözeltileri ve Şişelerin Hazırlanması
- Taze homojenizasyon tamponu (HB) hazırlayın ve buzda tutun: 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM sakaroz, 5 mM EDTA pH 8.0 ve 100 mL'de 1 proteaz inhibitörü tablet.
NOT: Fare başına yaklaşık 10 mL HB gereklidir. - Biyolojik numunelerin aşağı işlemesi için her numune ham homojeni tutmak için 15 mL konik tüp, nükleer sonrası süpernatantı tutmak için 15 mL tüp, 3.000 x g ve 20.000 x g peletli tutmak için iki adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü gerektirir. malzeme, sırasıyla, ve bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüp sitoplazmik fraksiyonu tutmak için. Ham homojen lik için tasarlanmış her tüpe 7 mL soğuk HB ekleyin ve buzda tutun.
- Steril PBS'de leupeptin hemi-sülfat2 mg/mL stok çözeltisi hazırlayın. Ayrıca dimetil sülfoksit (DMSO) bortezomib 50 mg /mL çözeltisi hazırlayın. Aliquot ve -80 °C'de çözeltileri saklayın.
3. Proteaz Inhibitörü İdaresi
- Her zaman noktasından 15 dk önce oda sıcaklığına kadar leupeptin (2 mg/mL) ve bortezomib (50 mg/mL) stok çözeltisi çözülür. Leupeptin stoğu enjeksiyon için hazır. 50 μg/mL çalışma çözeltisi elde etmek için steril PBS'deki bortezomib'i seyreltin.
NOT: Bortezomib ışığa duyarlıdır, bu nedenle kullanıma kadar çalışma stoğunu ışıktan koruyun. - Fareleri tartın ve "sham" PBS (0,5 mL), leupeptin (40 mg/kg) veya bortezomib (1,6 g/kg) intraperitoneal enjeksiyonları yapın. Fareleri aldıkları enjeksiyon türüne göre gruplanmış uygun şekilde işaretlenmiş kafeslere geri döndürün. Farelerin standart bir tabloda işlem gördüğü veya manipüle edildiği zamanı kaydedin (bkz. Ek Dosya "Örnek Veriler").
NOT: Bir doz hesap makinesi Ek Dosya "Örnek Veri"bir yardım olarak dahildir. Değişkenliği en aza indirmek için enjeksiyonları hızlı ve zaman noktasından zaman noktasına doğru aynı sırada gerçekleştirmek önemlidir.
4. Doku Edinimi ve Depolanması
- Enjeksiyondan iki saat sonra, kurumsal olarak onaylanmış IACUC protokolüne uygun olarak fareleri teker teker ötenazi yetirin. Örneğin, fareleri anestezik sonra servikal çıkığı ile ötenazi. Ötenaziden hemen sonra diseksiyon adımına geçin.
NOT: Gözlemlenebilir bir refleks olmadan ön pençeleri çimdikleyerek servikal çıkış önce tam anestezi olun. - Farenin ventral karın üzerinde Metzenbaum makas ile 1,5 ila 2,0 cm kesi yaparak karaciğerin sol lob çıkarın. Karaciğerin sol lobunu dışsallaştırın ve cerrahi makasla çıkarın. Karaciğer örneğini 7 mL buz gibi HB'ye uygun şekilde etiketlenmiş 15 mL konik tüpe batırın. İşlem boyunca numuneyi buzda tutun.
NOT: Numuneler devam etmeden önce buzda veya gece boyunca 4 °C'de saklanabilir. Makrootophaji ve proteazomal aktivitenin standart belirteçleri tek amaçlanan okumalar ise, karaciğer örnekleri sıvı nitrojende dondurulmuş ve daha sonra işlenmesi için -80 °C'de saklanabilir. Diğer bozulma hedeflerini (örn. proteomik yoluyla) incelemek için, numuneleri donmadan işleyin. - Tüm örnekler elde edilene kadar ötenazi yapmaya ve bir sonraki fareyi incelemeye devam edin. Farelere enjekte edildikleri grup sırasına göre işlem sağlayın ve bu adımın süresini kaydedin (bkz. Ek Dosya "Örnek Veriler"). Her fare enjekte inhibitörleri için maruz kalma süreleri farkı sınırlamak için 5 dakika altında işlenmelidir.
5. Karaciğer Örneklerinin Biyokimyasal Fraksiyonu
NOT: Şekil 1B kesirasyon düzenini gösterir.
- Her karaciğer numunesini ve 7 mL HB'yi 15 mL kapasiteli Dounce homogenizer'e aktarın. Numuneyi gevşek pistonun 10 vuruşu ve sıkı pistonun 15 vuruşuyla homojenize edin. Elde edilen ham homojeni, kaynağı olan 15 mL konik tüpe geri döndürün. Tüm karaciğer örnekleri homojenleştirilene kadar tekrarlayın.
- 700 x g'de 4 °C'de 4 °C'de püre çekirdekleri ve enkaziçin ham homojen numuneleri döndürün. Nükleer sonrası supernatantın(S1)en iyi 4 mL'sini taze 15 mL konik tüpe aktarın.
- Üreticinin talimatlarına göre Bradford veya bicinchoninic asit (BCA) tahlilleri kullanarak fraksiyonU S1 protein konsantrasyonu belirleyin. Daha sonra tüm numunelerin konsantrasyonlarını 2,1 mg/mL'ye veya gerektiğinde S1'e taze HB ekleyerek istenilen konsantrasyona eşitleyin. Normalleştirilmiş örnekler "Toplam Protein" ( Tot )fraksiyonudur. Aşağı analitik amaçlar ve kalite iyileştirme için, aliquot 500 μL Tot fraksiyonu ve depolamak -80 °C.
- Kalan Tot fraksiyonunun 1,5 mL'sini mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de 15 dakika boyunca 3.000 x g'de döndürün. Ortaya çıkan supernatant(S2)1 mL'yi taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde ayarlayın.
- Kalan supernatant aspire ve 3.000 x g pelet yıkayın (3KP) soğuk HB 1.5 mL ile iki kez. 3KP pelet, aşağı proteomik ler bekleniyorsa -80 °C'de kuru olarak saklanabilir. Sadece batı lekelenme sebebleri beklenirse, 3KP peletini 200 μL sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) örnek tampon(Malzeme Tablosu)içinde yeniden askıya alın ve 5 dk boyunca 95 °C'de kaynatın.
- S2 fraksiyonu 20.000 x g'de 20 dk 4 °C'de döndürün. Ortaya çıkan supernatant(S3)taze bir mikrosantrifüj tüp aktarın. S3 sitoplazmik (Sito) fraksiyonudur. SDS-PAGE için, 150 μL Cyto fraksiyonu ile 50 μL 4x SDS-PAGE örnek tamponu birleştirin ve 5 dk boyunca 95 °C'de kaynatın.
- 20.000 x g peletten(20KP)kalan süpernatantı aspire edin ve 1,5 mL soğuk HB ile iki kez yıkayın. 20KP pelet, aşağı proteomik ler bekleniyorsa -80 °C'de kuru olarak saklanabilir. Sadece batılekesi bekleniyorsa, 20KP peletini 100 μL SDS-PAGE numune tamponunda yeniden askıya alın ve 95 °C'de 5 dk kaynatın.
6. Batı Blotting Okuma
- Makrootophagic ve proteasomal akı batı blotting yoluyla ölçmek için, saflaştırılmış GST-LC3b (2 μg/mL), p62-His6 (2 μg/mL) ve Lys48 bağlantılı poliubiquitin (K48-Ub, 50 μg/mL) 1x SDS-PAGE örnek tampon bir stok çözüm oluşturmak. 95 °C'de 5 dk kaynatıldıktan sonra aliquot ve -80 °C'de saklayabilirsiniz.
- SDS-PAGE sırasında, 1x SDS-PAGE örnek arabelleğiiçinde 1:3'ü seri olarak seyrelterek standart protein karışımının 6 noktalı standart eğrisini oluşturun. Her standart eğri numunenin 10 μL'sini 26 kuyu 4−12% SDS-PAGE midi-jeline yükleyin ve bunu ticari bir molekül ağırlık standardı olan prestained protein standartları(Malzeme Tablosu)takip edin.
- Otophagic akı ölçmek için, her kuyuya 12 μL 3KP numune yükleyin.
NOT: Sham, bortezomib ve leupeptin tedavileri yapıldığını varsayarsak ve tedavi başına 3 fare varsayarsak, her zaman noktası 9 örnekten oluşmalıdır. Bu nedenle, her midi-jel 2 saat noktaları artı standart eğrisi ve tipik bir zaman serisi deney barındırabilir 3 okuma için midi-jeller gerektirir. - Proteasomal akı ölçmek için, her kuyuya 12 μL Cyto fraksiyonu yükleyin.
- SDS-PAGE tarafından ayrı protein örnekleri ve standart protokoller kullanılarak polivinilidenflor (PVDF) membranlara aktarılır. LC3b için batı lekelenme bekleniyorsa, transfer jelleri kullanarak 20% metanol içeren transfer tampon. Aksi takdirde, yüksek molekül ağırlıklı protein türlerinin daha verimli transferini sağlayacağından % 10 metanol içeren transfer tamponu kullanın.
- Standart protokolleri kullanarak batı lekeleme gerçekleştirin. Makrootophagic akı analiz etmek için, 4 °C gecede anti-p62 veya anti-LC3b antikorları (1:1.000) ile 3KP örnekleri içeren blot membranları. Proteasomal akı analizi için, anti-Lys48 spesifik poliubiquitin (1:1.000) ile Sito örnekleri içeren leke membranları 4 °C'de bir gecede.
- Standart ikincil antikorlar ve görüntüleme cihazları kullanarak görüntü batı lekeleri. Belirli bir zaman serisi deneyini oluşturan tüm membranları birlikte görüntüleyin.
7. Veri Analizi
NOT: Bkz. Ek Dosya "Örnek Veriler".
- Batı leke örnekleri üzerinde densitometri gerçekleştirmek için, standart grafik yazılımıkullanın, Image Studio, veya alternatif ImageJ.
- Hem standart eğri hem de deney numuneleri için ilgi bantları üzerinde densitometrik ölçümler yapın. Image Studio'da, p62'yi örnek olarak kullanarak, alttaki protein monomerini çevreleyen ve membranın üst kısmına kadar uzanan uzun bir dikdörtgen çizin. Dikdörtgeni kopyalayın, yapıştırın ve kalan örneklere taşıyın. Numuneler arasında niceleme tutarlı olmak için kullanılan dikdörtgenin tutulması önemlidir.
- Analiz penceresinin sağ alt kısmındaki Rapor ve Başlat Elektronik Tablosu'na basarak niceliği elektronik tabloya kaydedin.
- Seri olarak seyreltilmiş standart örneği kullanarak elektronik tabloyla densitometrik standart eğri oluşturun ve en uygun standart eğri denklemini elde etmek için doğrusal veya polinomlu regresyon kullanın. Bu denklemi kullanarak, deneysel numunelerde p62, LC3b-II veya Lys48-poly Ub miktarını tahmin edin.
- Akı ölçümleri elde etmek için, inhibitörle tedavi edilen her numunenin ekstrapolate protein miktarını pbs numunelerinin ortalama değerinden aynı zaman noktasından çıkarın (bkz. Ek Dosya "Örnek Veriler").
- 1 yönlü ANOVA kullanarak protein cirosunun zamansal değişiminin istatistiksel önemini değerlendirin. Bu standart elektronik tablo yazılımı kullanılarak yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temsili veriler Şekil 2A,B'desunulur ve bu verilerin niceliği Şekil 2C,D'de verilmiştir (ayrıca bkz. Ek Dosya "Örnek Veriler"). Basitlik için, Şekil 2'de yükleme kontrollerini göstermedik, ancak bunlar paralel olarak alınmalıdır. Tipik olarak, β-aktin karşı batı lekeleri bu amaçla kullanılır, ancak toplam protein lekesi (Ponceau S gibi) yeterli olacaktır. Herhangi bir zaman noktasında otofajik akı için birincil okuma, löpeptin ile tedavi edilen ve şam örnekleri arasındaki makrootophajispesifik belirteçlerin (p62 veya LC3b-II) miktarındaki farktır. proteaz inhibitörü enjeksiyonu ve doku hasadı arasında saat). Benzer veriler, aynı zamanda lizom zenginleştirilmiş 20KP örnekleri elde edilebilir, ancak fare karaciğeri bizim deneyim 3KP fraksiyonu içinde sinyal ayırır en. Tipik olarak, sonuçlar, bağımsız deneyler arasında karşılaştırmayı basitleştiren ortalamaya göre normalleştirilir(Şekil 2C,D). Proteazomal ciro için birincil okuma Lys48-poliubiquitinated protein miktarı arasındaki fark sitozolik ("Cyto") fraksiyonu 2 bölünür bortezomib-tedavi karşı sham örnekleri arasında. P62 hem makrootophaji hem de proteozom3'ünhedefi olabileceğinden, proteazomal akı için alternatif bir belirteç 3KP fraksiyonundaki p62 içeriğindeki +/- bortezomib değişimidir (Bkz. Örnek Veriler). Ancak, bu belirteç Lys48-poliubiquitinated protein ile karşılaştırıldığında daha az sağlam ve en iyi destekleyici veri olarak kullanılır bulabilirsiniz.
Şekil 1: Deney adımları ve örnek işleme. (A) Fare karaciğerinde otonom ve proteazomal aktivite (akı) günlük ritimleri ölçmek için tipik bir zaman serisi deney şeması. (B) Batı leke analizi için lizozomla zenginleştirilmiş ve sitozolik karaciğer protein fraksiyonları elde etmek için fraksiyonasyon şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Akı örnek deneysel sonuçları. Fare karaciğerinde otophagic akı(A)ve proteasomal akı(B)günlük ritimleri ölçmek için temsili bir zaman serisi deney batı lekeleri. Löpeptin tedavi koşulları altında, p62 yaklaşık 50 kDa monomerik formu ndan Yaklaşık 250 kDa SDS kararlı kompleksleri arasında değişen merdiven olarak çalışır unutmayın. Günün saatleri, ZT0'nın ışıkları ve ZT12'nin ışıkları nisbeten temsil ettiği zeitgeber saati (ZT) birimlerinde tasvir edilir. Işıklar kapalı sırasında düşen gözlem süreleri siyah gölgeli. (C,D) Bu verilerin sayısallaştırılması. Her veri noktası ± SE (n = 3) ortalamasını temsil eder. Tek yönlü ANOVA ile istatistiksel anlamlılık gösterilmiştir. Bu verilerin bir tabular gösterimi için lütfen Ek Dosya "Örnek Veriler"e bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek dosya: Örnek veriler. Densitometrik verilerin laboratuvar analizi ve sonraki istatistiksel analiz. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokolümüz, farelerde yaygın olarak kullanılan moleküler biyoloji ekipmanlarını kullanarak protein cirosundaki biyolojik ritimleri ölçmenin teknik olarak basit bir aracını tanımlar. Zaman serisi deneylerin uzunluğu ve ilgili biyolojik numunelerin sayısı nedeniyle, farelerin nasıl enjekte edildiği, doku ediniminin zamanlaması ve biyokimyasal işleme ile ilgili tüm deneyboyunca tutarlı olmak önemlidir. Örnekleri. Enjeksiyon, ötenazi ve servikal çıkık adımları, tam ölçekli bir deney başlatmadan önce operatör uygulaması gerektirebilir. Farklı bireyler farklı hızlarda diseksiyon beri tek bir operatör için tüm doku diseksiyonları gerçekleştirmek için en iyisidir, ancak bu mümkün değilse proteaz inhibitörü enjeksiyonu ve doku hasat arasındaki süreyi artırmak için değerli olabilir 2 h 3 veya 4 h ( bu zaman noktaları arasında tutarlı bir şekilde yapılır).
Sorun giderme için yaygın nedenler biyolojik çoğaltma örnekleri arasında akı değişkenlik ve kötü batı leke kalitesi içerir. Örnek değişkenliği ile ilgili olarak, bu farklı kesme hızları veya deneyim düzeyleri ile birden fazla operatör kullanımı nedeniyle olabilir. Bu, ortalama kesme süreleri fare başına 5 dakikadan az olana kadar uygulama denemeleri yürütülerek azaltılabilir. Alternatif olarak, tek bir operatör diseksiyon yürütmek için kullanılabilir. Batı lekeleri üzerinde yüksek arka plan düzensiz transferi ortaya çıkabilir, yetersiz engelleme, düşük kaliteli birincil antikor, ya da yetersiz yıkama adımları. En iyi sonuçlar, SDS-PAGE ayrılmış protein örneklerinin transfer tamponu içeren %10−20 metanolle PVDF'ye bir gecede ıslak olarak aktarılması, bloke için %10 yağsız kuru süt kullanılması ve basamaklar arasında kapsamlı yıkama (mekanik bir kaya çeşidinde en az 3x 10 dk) elde edilir.
Bu tekniğin çeşitli sınırlamaları vardır. İlk olarak, açıklanan protokol önemli sayıda hayvan gerektirir ve bu nedenle kaynak yoğundur. Minimal zaman serisi deneyi 24 saate kadar uzanırken, protein cirosunda gözlenen günlük varyasyonların tekrarlanabilir olduğunu doğrulamak ve periyodiklik ve faz 12 gibi ritim özelliklerini tahmin etmek için en az 2 döngüden oluşan deneyler idealdir. . Proteaz inhibitörlerinin farelere verilmesi ile numunelerin hasat edildiği zaman (proteozizin hedeflerinin birikmesine izin vermek için) arasında zaman geçmesi gerektiğinden, elde edilen ciro ölçümleri 2 saat aralıkta ortalama bir aktiviteyi temsil eder. bir nokta tahmini yerine. Sonuç olarak, bu titrenin protein katabolizmasındaki dinamik değişiklikleri saptamak için sağlayabileceği çözünürlüğün bir sınırı vardır. Son olarak, bu protokol fare karaciğeri için optimize edilmiştir ve burada sunulan biyokimyasal fraksiyonlama prosedürü nün diğer doku tiplerinden verimli bir şekilde elde edilebilmek için değiştirilmesi gerekir.
Bu, aynı zamanda bu fenomenin proteom çapında gözlemler sağlayan otophagic akı günlük ritimleri doğrudan ölçmek için ilk yöntemdir. Bu tekniğin gelecekteki uygulamaları otoimmün hastalık, kanser ve akut enfeksiyon da dahil olmak üzere çeşitli hastalık modellerinde proteolitik ritim analizi içerir. Esas olarak bu yöntem diğer fare organlarına ve yüksek çeviri potansiyeline sahip heyecan verici bir gelecekteki uygulamayı temsil eden insan örneklerine uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma RO1HL135846 ve Çocuk Geliştirme Enstitüsü hibe (PD-II-2016-529) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
References
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J.
- Ma, B. Y., et al. LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages. Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).
- Ryzhikov, M., et al. Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy. Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Desvergne, A., et al. Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts. Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W.
- Ciechanover, A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L.
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P.
- Hughes, M. E., et al. Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms. Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).
