Summary
オートファジーとマウス肝臓のプロテアソームを介してタンパク質異化の生体リズムを測定するための我々のプロトコルを説明する.
Abstract
細胞は、リソソームおよび非リソソーム経路を含む不要なタンパク質および他の材料をリサイクルするためのいくつかの方法を採用しています。主なリソソーム依存性経路はオートファジーと呼ばれ、タンパク質異化症の主要な非リソソーム法はユビキチンプロテアソーム系である。モデル生物の最近の研究は、オートファジーとユビキチンプロテアソームシステムの両方の活性が一日を通して一定ではなく、代わりに毎日(概日)リズムに応じて変化することを示唆しています。タンパク質回転率の生体リズムを測定する能力は、細胞の品質管理がどのように達成されるかを理解し、目的の特定のタンパク質のダイナミクスを理解するために重要です。ここでは、タンパク質回転率の概日成分を捕捉する生体内でオートプハギックおよびプロテアソームフラックスを定量するための標準化されたプロトコルを提示する。当社のプロトコルには、マウスの取り扱い、組織処理、分画、およびマウス肝臓を出発材料として使用したオートファギックフラックス定量の詳細が含まれています。
Introduction
概日リズムは、自然全体で明らかな生物学的機能の毎日の予測可能な変動を指します。睡眠覚醒サイクルのようなマクロ的な行動から、生体分子のリズミカルな豊富さのような分子現象まで、あらゆる生物学的規模で存在します。近年、概日リズム生成に不可欠な「クロック遺伝子」の発見により、概日リズムの研究が変容しています。クロック遺伝子ノックアウトマウスの研究は、代謝1などのコア細胞プロセスを一時的に組織化する概日リズムの中心的な役割を明らかにした。概日リズムがこれを実現する方法の中で、タンパク質異化に時間構造を与えることによってです。
我々を含むいくつかのグループは、細胞タンパク質異化症、オートファジーおよびユビキチンプロテアソーム系の2つの主要な道が、日次リズム2、3、4、5の対象となることを示している。オートファジーは、目的のタンパク質が新規小胞(マクロオートファジー)の構築を通じて、または直接転移を通じてこの劣化小器官に送達されるタンパク質異化のリソソーム依存性アームを表す。チャネル(シャペロン媒介オートファジー)6.ユビキチン・プロテアソーム系は、タンパク質がポリユビキチン化され、プロテアソームに送り込まれる主要な非リソソーム経路であり、細胞質および核7、8全体で見られる高分子分解機である。オートファジーとプロテアソーム活性のリズムは、細胞のハウスキーピングに役割を果たす可能性が高いので重要です。その結果、前臨床疾患モデルと互換性のあるタンパク質異化の日常的な振動を検出できる標準化された手順を持つことは貴重です。
ここでは、研究室3,9の研究の基礎となっているマウス肝臓のオートファギックフラックスの日常的変動を定量化するためのプロトコルを提供します。我々の方法は、「ターンオーバーアッセイ」10、多くのグループがプロテオ溶解活性(またはフラックス)を測定するために使用されるアプローチとして分類される。このアプローチでは、リソソームまたはプロテアソームに特異的なプロテアーゼ阻害剤をマウスに投与し、その後、組織サンプルが一定の時間間隔後に得られる。並行して、組織サンプルは、シャム注射を行ったマウスから得られる。組織サンプルを均質化し、生化学的に分離し、リソソーム富化および細胞質画分を得る。これらの画分は、マクロオートファジーマーカー(LC3bおよびp62)またはプロテアソーム基質(ポリユビキチン化タンパク質)に特異的な抗体を用いてウェスタンブロッティングを介して並行して分析される。時間が経つにつれて、プロテアーゼ阻害剤を注射された動物は、通常リサイクルされるであろうタンパク質を蓄積します。その結果、ターンオーバー率は、プロテアーゼ阻害剤処理されたサンプル中のマーカータンパク質の豊富さをシャム処理サンプルと比較することによって推測される。この方法を1日を通して一定の時間間隔で繰り返すことにより、プロテオ分解における概日変動を再構築することができる(図1A)。
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Protocol
ここに記載されているプロトコルは、セントルイス動物ケアと使用委員会(IACUC)のワシントン大学によって承認されました。
1. マウスハウジングと実験設計
- タンパク質回転率の毎日のリズムを検出するために、ハウスマウス(雄または女性C57BL/6J、4−8週齢、20−25g)の標準的な12時間の光/暗いサイクルの下で、食物提供のアドリビタムを提供する。動物にストレスを与えないように、使用前に施設内で少なくとも1週間マウスを順応させ、単一のハウジングを避ける。タンパク質異化のリズムが本当に概日的であることを証明するために(すなわち、動物の内部生体時計によって駆動される)、マウスを一定の暗い条件下で収容し、マウスが外因性光にさらされるのを避けるように注意する。
注:概日リズム実験用マウスハウジングの詳細については、以下のリファレンス11を参照してください。 - 各時点に対して、3匹のマウスをシャムコントロールとして割り当て、使用するプロテアーゼ阻害剤の種類ごとに少なくとも3匹のマウスを割り当てます(プロテプハギックフラックス用のルペプチンおよびプロテソームフラックス測定用ボルテゾミブ)。組織サンプルを得るために、昼夜のサイクルを通して4時間間隔で均等に間隔をあけた6つの時間ポイントを計画します。
注:リン酸緩衝生理食べ物(PBS)、レペプチン、およびボルテゾミブを用いた24時間、6時間の実験では、合計54匹のマウスが必要です(治療1回あたり3匹×3回×6時間点)。
2. マウス肝臓採取用ホモジネーション溶液、阻害剤ストックソリューション、バイアルの調製
- 新鮮な均質化バッファー(HB)を調製し、氷上に保つ:10 mMトリス-HCl pH 7.5、250 mMスクロース、5 mM EDTA pH 8.0、および100mLあたり1プロテアーゼ阻害剤錠剤。
注:マウス1匹につき約10mLのHBが必要です。 - 生物学的サンプルの下流処理のために、各サンプルは、粗い均質性を保持するために15 mL円錐管、核後の上清を保持するための15 mLチューブ、3,000 x gと20,000 x gペレットを保持する2つの1.5mLマイクロセントリフュージチューブを必要とします。材料は、それぞれ、細胞質画分を保持する1.5 mLマイクロ遠心管チューブ。粗い均質性を意図した各チューブに7 mLの冷たいHBを加え、氷の上に保ちます。
- 無菌PBS中のレペプチンヘミ硫酸塩の2mg/mLストック溶液を調製する。また、ジメチルスルホキシド(DMSO)中のボルテゾミブの50mg/mL溶液を調調用する。アリコットと-80 °Cでソリューションを保存します。
3. プロテアーゼ阻害剤投与
- ルーペプチン(2mg/mL)およびボルテゾミブ(50mg/mL)のストック溶液を、各時間点の15分前に室温に解凍する。ルププチンストックは注入の準備ができています。滅菌PBSでボルテゾミブを希釈し、50 μg/mLの作業溶液を得る。
注:ボルテゾミブは光に敏感なので、使用するまで光から作業ストックを保護します。 - マウスの重量を量り、「シャム」PBS(0.5 mL)、ルペプチン(40mg/kg)、またはボルテゾミブ(1.6 μg/kg)の食後注射を行います。マウスを、受け取った注射の種類別にグループ化した適切にマークされたケージに戻す。標準化されたテーブルでマウスが処理または操作される時間を記録します (補足ファイル「サンプルデータ」を参照)。
注:線量計算機は、補足ファイル「サンプルデータ」の援助として含まれています。変動を最小限に抑えるためには、インジェクションをタイムポイントからタイムポイントまで迅速かつ同じ順序で実行することが重要です。
4. 組織の取得と貯蔵
- 注射の2時間後、制度的に承認されたIACUCプロトコルに従ってマウスを1匹ずつ安楽死させる。例えば、マウスを麻酔し、子宮頸部脱臼により安楽死させる。安楽死の直後に解剖ステップに進みます。
注:観察可能な反射なしで前足をつまむことで頸部脱臼の前に完全な麻酔を確保してください。 - マウスの腹部にメッツェンバウムはさみで1.5〜2.0cmの切開を行い、肝臓の左葉を取り除きます。肝臓の左葉を外部化し、外科的なはさみでそれを切除します。肝臓サンプルを7mLの氷冷HBに適切に標識された15mL円錐管に沈めます。試料は処理中氷の上に保管してください。
注:サンプルは、先に進む前に氷の上または4°Cで一晩保存することができます。マクロオートファジーおよびプロテアソーム活性の標準マーカーが唯一の意図された読み出しである場合、肝臓サンプルは液体窒素中でフラッシュ凍結され、後で処理するために-80°Cで保存することができます。他の分解標的(例えば、プロテオミクスを介して)を調べるために、凍結することなくサンプルを処理する。 - すべてのサンプルが取得されるまで、次のマウスを安楽死させ、解剖します。マウスを注入したのと同じグループ順に処理し、このステップの持続時間を記録します(補足ファイル「サンプルデータ」を参照)。各マウスは、注入された阻害剤の露光時間の差を制限するために5分以下で処理する必要があります。
5. 肝臓サンプルの生化学的分画
注:図 1Bは、分数スキームを示しています。
- HBの各肝臓サンプルと7 mLを15 mL容量のダンスホモジナイザーに移します。緩いピストンの10ストロークとタイトなピストンの15ストロークでサンプルを均質化します。得られた粗質を15mL円錐形チューブに戻す。すべての肝臓サンプルが均質化されるまで繰り返します。
- 4°Cで10分間700xgで均質なサンプルをペレット核と破片にスピンします。 核後上清(S1)の上4mLを新鮮な15mL円錐管に移します。
- ブラッドフォードまたはビシンコニン酸(BCA)アッセイを使用して、製造元の指示に従って分画S1のタンパク質濃度を決定します。次に、必要に応じて新鮮なHBをS1に加えることによって、すべてのサンプルの濃度を2.1mg/mLまたは所望の濃度に等化します。正規化されたサンプルは、「総タンパク質」(Tot)分数です。下流の分析目的および品質の改善のために、Tot分画のアリコート500 μLおよび-80 °Cで貯える。
- 残りのトット画分の1.5mLをマイクロ遠心管に移し、3,000 x gで15分間4°Cでスピンします。得得た上清(S2)の1mLを新鮮なマイクロ遠心管に移し、氷の上に置く。
- 残りの上清を吸引し、3,000 x gペレット(3KP)を1.5mLの冷たいHBで2回洗浄します。下流のプロテオミクスが予想される場合、3KPペレットは-80°Cで乾燥して保存することができます。西洋ブロッティングのみが予想される場合は、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)サンプルバッファー(材料表)の200μLで3KPペレットを再中断し、95°Cで5分間沸騰させます。
- S2分画を20,000 x gで20分間4°Cで回します。得得た上清(S3)を新鮮なマイクロ遠心管に移します。S3は細胞質(細胞)画分である。SDS-PAGEの場合は、150 μLのCyto分画と4x SDS-PAGEサンプルバッファの50 μLを組み合わせ、95°Cで5分間沸騰させます。
- 残りの上清を20,000 x gペレット(20KP)から吸引し、1.5mLの冷たいHBで2回洗浄します。下流のプロテオミクスが予想される場合、20KPペレットは-80°Cで乾燥して保存することができます。西洋ブロッティングのみが予想される場合は、SDS-PAGEサンプルバッファの100 μLで20KPペレットを再中断し、95°Cで5分間沸騰させます。
6. ウェスタンブロッティング読み出し
- ウェスタンブロッティングを介してマクロオートファギックおよびプロテアソームフラックスを定量するために、精製されたGST-LC3b(2 μg/mL)、p62-His6(2 μg/mL)、およびLys48リンクポリウビキチン(K48-Ub、50μg/mL)のストック溶液を1x SDSページバッファで構成する。95°Cで5分間沸騰させた後、アリコートを-80°Cで保存し、将来の使用のために保存します。
- SDS-PAGEの時点では、1x SDS-PAGEサンプルバッファーで1:3を連続的に希釈することにより、標準タンパク質混合物の6点標準曲線を生成する。各標準曲線サンプルの10 μLを26ウェル4-12%SDS-PAGEミディゲルにロードし、その後に市販の分子量標準であるタンパク質標準(材料の表)を染色しました。
- オートプハギグラックスを測定するために、各ウェルに3KPサンプルの12 μLをロードします。
注:シャム、ボルテゾミブ、およびレペプチン治療が行われ、1回の治療につき3匹のマウスを想定すると、各時点は9つのサンプルで構成されるべきである。したがって、各ミディゲルは2つのタイムポイントに標準曲線を加えて収容することができ、典型的な時系列実験では読み出しに3つのミディゲルが必要になります。 - プロテアソームフラックスを測定するには、各ウェルにCyto分画の12 μLをロードします。
- SDS-PAGEによってタンパク質サンプルを分離し、標準プロトコルを使用してポリビニリデンフッ化物(PVDF)膜に移す。LC3bのウェスタンブロッティングが予想される場合は、20%メタノール含有転写バッファーを用いてゲルを転写する。さもなければ、これは高分子量タンパク質種のより効率的な転送を可能にするように、10%メタノール含有転写バッファーを使用する。
- 標準プロトコルを使用してウェスタン ブロッティングを実行します。マクロオートプハギ性フラックスを分析するために、抗p62または抗LC3b抗体(1:1,000)を含む3KPサンプルを含むブロット膜を4°Cで一晩。プロテアソームフラックスを分析するために、抗Lys48特異的ポリウビキチン(1:1,000)を用いたCytoサンプルを含むブロット膜を4°Cで一晩。
- 標準的な二次抗体およびイメージング装置を用いて画像西部ブロット。特定の時系列実験を構成するすべての膜を一緒にイメージします。
7. データ分析
注:補足ファイル「サンプルデータ」を参照してください。
- ウェスタン ブロット サンプルに対して密度測定を実行するには、標準グラフィックスソフトウェア、イメージ スタジオ、または ImageJ を使用します。
- 標準曲線と実験サンプルの両方について、対象バンドに対して密度測定を実行します。Image Studio では、p62 を例にして、下部にタンパク質モノマーを含む長い長方形を描き、膜の上部まで伸ばします。四角形をコピー、貼り付け、残りのサンプルに移動します。サンプル間で定量化に使用される四角形を一貫しておく必要があります。
- 分析ウィンドウの右下にある[レポート]と [スプレッドシートの起動]を押して、定量をスプレッドシートに保存します。
- 連続的に希釈された標準サンプルを使用してスプレッドシートを使用して密度標準曲線を生成し、線形回帰または多項式回帰を使用して、最適な標準曲線方程式を取得します。この式を使用して、実験サンプルでp62、LC3b-IIまたはLys48-polyUbの量を外挿する。
- フラックス測定を得るためには、各阻害剤処理サンプルの外挿タンパク質量を、同じ時点からPBSサンプルの平均値から差し引きます(補足ファイル「サンプルデータ」を参照)。
- 一方通行分散分析を用いてタンパク質回転率の時間変動の統計的有意性を評価する。これは、標準的なスプレッドシートソフトウェアを使用して行うことができます。
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Representative Results
代表的なデータを図2A,Bに示し、これらのデータの定量化を図2C,Dに示します(補足ファイル「サンプルデータ」も参照)。わかりやすくするために、図 2にローディング コントロールを示していませんが、これらは並行して取得する必要があります。典型的には、β-アクチンに対するウェスタンブロットがこの目的のために使用されるが、全タンパク質染色(ポンソーSなど)で十分である。任意の時点におけるオートファジーフラックスの主な読み出しは、リソペム濃縮3KP画分のルペプチン処理とシャムサンプルの間のマクロオートファジー特異的マーカー(p62またはLC3b-II)の量の差を2で割った3KP分数(の数)プロテアーゼ阻害剤の注射と組織収穫の間の時間)。同様のデータは20KPサンプルからも得ることができますが、マウス肝臓での経験は、信号のほとんどが3KP分画で分離するということです。通常、結果は、独立した実験間の比較を簡素化する平均に正規化される(図2C,D)。プロテアソームターンオーバーの主な読み出しは、細胞質(「細胞質」)画分を2で割ったボルテゾミブ処理とシャムサンプルの間のLys48-ポリウビキチン化タンパク質の量の差である。p62はマクロオートファジーとプロテアソーム3の両方の標的となり得るので、プロテアソームフラックスの代替マーカーは、3KP分画におけるp62含有量+/-ボルテゾミブの変化である(サンプルデータを参照)。しかし、このマーカーはLys48-ポリウビキチン化タンパク質に比べて堅牢性が低く、支持データとして最もよく使用されています。
図1:実験ステップとサンプル処理。(A)マウス肝臓におけるオートファジーおよびプロテアソーム活性(フラックス)における毎日のリズムを測定する典型的な時系列実験の概略図。(B)ウェスタンブロット分析のためのリソソーム富化および細胞質肝タンパク質画分分を得るための分画スキーム。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:フラックスの実験結果のサンプル。マウス肝臓におけるオートファジーフラックス(A)およびプロテアソームフラックス(B)における毎日のリズムを測定する代表的な時系列実験からのウェスタンブロット。レペプチン処理条件下では、p62は約50kDaのモノマー形態から約250kDaのSDS安定複合体に至るまではしごとして実行されます。時刻はツァイトゲーバー時間 (ZT) 単位で表示され、ZT0 はライトが点灯し、ZT12 はライトオフを表します。ライトオフ中に落下する観測時間は、黒でシェードされます。(C,D)これらのデータの定量化。各データポイントは平均±SE(n=3)を表す。一方通行の分散分析による統計的有意性が示されている。これらのデータの表形式の表現については、補足ファイル「サンプルデータ」を参照してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル: サンプル データ。密度データの実験室分析とその後の統計分析このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々のプロトコルは、一般的に利用可能な分子生物学装置を使用してマウスのタンパク質回転率の生物学的リズムを測定する技術的に簡単な手段を説明する。時系列実験の長さと関連する生物学的サンプルの数のために、マウスの注入方法、組織獲得のタイミングおよび生化学的処理に関する実験全体で一貫性を保ることが重要である。サンプル。注射、安楽死、頸部脱臼のステップは、本格的な実験を始める前にオペレータの練習を必要とするかもしれません。異なる個人が異なる速度で解剖するので、単一のオペレータがすべての組織解剖を行うことが最善ですが、これが不可能な場合は、プロテアーゼ阻害剤の注射と組織の収穫の間の時間を2時間から3または4時間(2時間または4時間()これは、時間ポイント間で一貫して行われる場合)。
トラブルシューティングの一般的な理由には、生物学的反復サンプル間のフラックスの変動性と、西洋ブロット品質の低さが含まれます。サンプルの変動性に関しては、解剖速度または経験レベルが異なる複数の演算子を使用しているためです。これは、平均解剖時間がマウスあたり5分未満になるまで、練習実験を行うことによって軽減することができます。あるいは、単一のオペレータを使用して解剖を行うことができる。ウェスタンブロットの高い背景は、不均一な転写、不十分なブロッキング、低品質の一次抗体、または不十分な洗浄工程から生じることができます。最良の結果は、SDS-PAGE分離タンパク質サンプルを10−20%メタノール含むトランスファーバッファーでPVDFに一晩湿った移動し、ブロッキングのために10%の非脂肪ドライミルクを使用し、ステップ間の広範な洗浄(機械ロッカーで最低3x 10分)によって達成される。
この手法にはいくつかの制限があります。まず、説明するプロトコルは、動物のかなりの数を必要とし、したがって、リソースを集中的にします。最小時系列実験は24時間に及びますが、少なくとも2サイクルの実験は、タンパク質の回転率で観察される日々の変動が再現可能であることを確認し、周期性やフェーズ12などのリズム特性を推定するのに最適です。.プロテアーゼ阻害剤がマウスに投与され、サンプルが採取されるまでの時間が経過しなければならないため(プロテオシスの標的が蓄積できるようにするため)、得られたターンオーバー測定値は2時間間隔で平均活性を表すポイントの見積もりではなく。その結果、このアッセイがタンパク質異化の動的変化を検出するために提供できる分解能に限界がある。最後に、このプロトコルはマウス肝臓用に最適化されており、ここで提示される生化学的分画手順は、他の組織タイプからリソソームを効率的に得るために改変する必要がある可能性が高い。
この現象のプロテオーム全体の観測を可能にするオートファジーフラックスの日常のリズムを直接測定する最初の方法です。この技術の将来の応用には、自己免疫疾患、癌、急性感染症を含む様々な疾患モデルにおけるプロテオ溶解リズムの分析が含まれる。主に、この方法は、他のマウス臓器に適応し、高い翻訳可能性を持つエキサイティングな将来のアプリケーションを表す人間のサンプルを移植することができます。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、RO1HL135846と児童開発研究所の助成金(PD-II-2016-529)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
References
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